Passos na análise de cristais de proteínas por difração de raios-x. Cristalização de Proteinas

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1 Passos na análise de cristais de proteínas por difração de raios-x Cristalização de Proteinas Glaucius Oliva Instituto de Física de São Carlos - USP Centro de Biotecnologia Molecular Estrutural - CEPID/FAPESP Cristalização Coleta de dados de difração de raios-x Resolução do problema das fases Substituição isomórfica múltipla Substituição molecular MAD Interpretação dos mapas de densidade eletrônica Refinamento da Estrutura Number of protein molecules in a typical protein crystal Obtaining adequate protein single crystals is the major bottleneck in the process of elucidating a new structure. Adequate crystals means: highly ordered diffraction to high resolution suitable size (~0.1mm or less)

2 Fatos históricos Cristalização proteica: Nobel em 1946 Princípios da Cristalização de Proteínas: 122 anos! Friedrich Ludwig Hünefeld (1840 foi o 1º relator de um cristal proteico) John H. Northrop James B. Sumner Wendell M. Stanley I have occasionally seen in almost dried blood rectangular crystalline structures which under the microscope had sharp edges and were bright red. 1. Proteína pura e homogênea 2. Solubilidade proteica e precipitação Contatos hidrofóbicos; salting in e salting out 3. Supersaturação Nucleação 4. Crescimento do cristal 5. Qualidade cristalina padrão de difração e limite de resolução Max Perutz John Kendrew Nobel em Hemoglobina/Mioglobina 1a. Est. Crist. Biomolecular (B12; 1957): Nobel em 1964 Obtenção de Proteinas para Cristalização Obtenção de proteínas solúveis, puras ( grau cristalização ) e na quantidade necessária (tipicamente multiplos de miligramas) é o gargalo inicial mais crítico para um projeto de cristalização de proteinas Purificação direta da fonte natural Expressão heteróloga recombinante Produção heteróloga de proteínas O que é?

3 Por que é importante produzir proteínas heterólogas? Proteína Pura e Homogênea Fontes mais comuns de heterogeneidade Contaminadas por DNA ou proteínas não relacionadas Oxidação das cisteínas Modificações pós traducionais Estados de oligomerização Isoformas População de moléculas mal enoveladas Flexibilidade estrutural Temperatura de expressão

4 Escolha do organismo 98 kda 77 kda 50 kda Outras proteínas de fusão Dicas de manipulação de proteínas para cristalização Mantenha a pura (> 90 95% em PAGE) e concentrada (> 10 mg/ml) Seja gentil com sua proteína: Evite a formação de espuma Manter em gelo durante o trabalho com ela e armazená la corretamente, evitando ciclos de congelamento / descongelamento Filtro Caracterize a pureza, homogeneidade e estabilidade da proteína por PAGE, DLS e / ou MS Evite a liofilização Evitar o uso de precipitação com sulfato de amônio como etapa final de purificação Evite misturar proteinas de diferentes preparações

5 Protein crystal growth from solution: nucleation growth Mas o que significa cristalização? É um fenômeno de transição de fase! Proteína sai da solução para uma fase cristalina, através da indução de supersaturação (depende da solubilidade da proteína). Como? Adição de agente precipitante (batch) Remoção de água (difusão de vapor) Troca de solvente (diálise) Difusão livre por uma interface Mudança de ph Combinaçao Remover água da camada de solvatação Diagrama de Fase para a Solubilidade Referência: Biomolecular Crystallography Bernhard Rupp (Capítulo 3)

6 Parâmetros que afetam solubilidade proteica ph Temperatura Força iônica Solventes orgânicos Polímeros orgânicos Dependência da solubilidade proteica em relação à alguns parâmetros ph Dependência da solubilidade proteica em relação à alguns parâmetros ph

7 Dependência da solubilidade proteica em relação à alguns parâmetros Temperatura Variables to force supersaturation: Temperature Temperature manipulates solubility and supersaturation of the sample normal solubility: in low ionic strength solubility increases with temperature retrograde solubility: in high ionic strength solubility decreases with temperature It is convenient to set up trials at different temperatures, e.g. 4 C and room temperature (RT) RT must be as controlled as possible. Attention to temperature changes during plate viewing!. In temperatures other than RT, minimize condensation. Dependência da solubilidade proteica em relação à alguns parâmetros Sais Dependência da solubilidade proteica em relação à alguns parâmetros Polímeros Orgânicos (PEGs) Log(S) = β K s (I) Log(S) = β K s c PEG Não existe pegging in Competição pelas moléculas de água Forca ionica =

8 Nucleação e Crescimento O processo de cristalização procede em duas fases: Nucleação e Crescimento Termodinâmica da Cristalização A colisão entre moléculas podem induzir a formação de agregados cristalinos A formação de uma massa crítica que permita o crescimento cristalino Crescimento cooperativo Distância (Å) Separação (centro) Separação média Concentração de lisozima (mg/ml) Diâmetro molecular médio de 40 Å Tamanho médio da agregação Nucleação crítica Metaestável zona de nucleação supersaturação Métodos de Cristalização Difusão de vapor: gota sentada [ppt] gota = [ppt] reservatório 2 Reservatório contém: agente precipitante + solução tamponante + aditivos, etc... O equilíbrio acontece com a difusão de vapor [ppt] gota = [ppt] reservatório A concentração no reservatório mantem se praticamente a mesma Reservatório Gota contém: proteína + sol. reservatório + aditivos + ligantes + etc... Proteína + sol. reservatório: normalmente 1:1, 2:1 e 1:2 Ao final do processo (na gota): a) Aumento na [ppt] b) Aumento na [proteína] Reservatório O volume da gota diminui, aumentando a concentração de ambos precipitante e proteína Energia de ativação para vencer a barreira da nucleação Exceção para os precipitantes voláteis

9 Equilíbrio da solução Na maioria das vezes é um processo rápido Diagrama de Cristalização para Difusão de Vapor horas dias (3 a 5) Independente do precipitante, o processo inicia se rapidamente e desacelera de acordo com a diferença de concentração de precipitante entre a gota e o reservatório O equilíbrio é dependente da temperatura % equilíbrio O equilíbrio cessa no momento em que a pressão osmótica das duas soluções se igualam Dados experimentais + 4 C 25 C Tempo (horas) Adaptado de Fowlis et al J. Cryst. Growth 90:117. Diagrama de Cristalização para Difusão de Vapor Crystallization strategies: how to optimize crystallization trials Sparse Matrix ( random ) Biased samplings of crystallization parameters selected from literature Grid Screens One or two parameters systematically varied Incomplete factorials all parameters varied simultaneously and randomly statistically balanced

10 Exemplo do espaço 3D de Cristalização Matriz Esparsa Condições de cristalização são baseadas em um número limitado de soluções e agentes precipitantes (screens), escolhidos de acordo relatos científicos de sucesso na cristalização de macromoléculas Muitos diferentes tipos de screens são disponíveis no mercado Os screens cobrem uma vasta gama de soluções tamponantes, ph, aditibos e agentes precipitantes Nota: screenis do tipo matrizes esparsas envolvem uma aleatoriedade intencional no tocante às possíveis combinações de condições que funcionaram anteriormente

11 JBScreen Family JBScreen Classic The JBScreen Classic Kits 1 10 cover 240 (10 kits x 24 conditions each) of the most prominent conditions for protein crystallization. Their compositions result from mining of literature data of several thousands of crystallized proteins. JBScreen represents the selected statistically most successful buffers that yielded protein crystals suitable for X ray diffraction. BScreen Basic Based on the classic sparse matrix crystallization screen published first by Jancarik and Kim in 1991, it contains 96 unique reagent mixtures for screening a wide range of ph and various salts and precipitants. JBScreen Membrane The optimized screen for hydrophobic and membrane proteins JBScreen Kinase A highly effective crystallization screen based on data analyses of published kinase structures JBScreen Nuc Pro A highly effective sparse matrix screen based upon extensive screening of the PDB, with focus on entries by structural genomic initiatives, the BMCD and other protocols. JBScreen PEG/Salt Efficient screening of PEG 3350 and PEG 5000 MME versus 48 different salts JBScreen Pentaerythritol A systematic crystallization screen based on pentaerythritol polymers as precipitants developed by Ulrike Demmer from the Max Planck Institute for Biophysics in Frankfurt. JBScreen PACT ++ Systematic screen for ph, anion, cation testing in the presence of polyehtylene glycol JBScreen JCSG ++ Optimized sparse matrix screen developed by the Joint Center for Structural Genomics (JCSG) Pi Screens Developed at the MRC Cambridge Crystallization Screens for soluble and integral membrane proteins based on Pi sampling strategy JBScreen Wizard A highly effective random sparse matrix screen for crystallizing proteins, peptides, nucleic acids and macromolecular complexes Otimização da Condição de Cristalização hit Sal contra PEG screen ph contra PEG screen Sal contra PEG screen ph contra PEG screen hit

12 Materiais usados em cristalização de Proteínas ALGUNS EXEMPLOS DE CRISTAIS DE PROTEÍNAS: + Cristalização manual Cristalização em larga escala mosquito HoneyBee