Cristalização de Macromoléculas Biológicas

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Lívia Cunha Macedo
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1 Cristalização de Macromoléculas Biológicas Laboratório de Sistemas Biomoleculares Departamento de Física IBILCE-UNESP

2 Aspectos Gerais A cristalografia de raios X revela as posições tridimensionais da maioria dos átomos em uma molécula de proteína. As características da estrutura terciária revelam muito sobre as funções das proteínas e suas evoluções.

3 Para que obter cristais de macromoléculas? O objetivo da cristalização de uma macromolécula biológica, tal como, proteína ou ácido nucléico, é o estudo estrutural dessas macromoléculas, pelo método de difração de raios X.

4 Resolução de Estrutura Purificação da Macromolécula Cristalização Coleta de Dados Densidade Eletrônica Refinamento do Modelo Estrutura

drogas anti-convulsivante Estrutura cristalográfica de toxinas do

5 Toxinas:problemas vasculares, processos inflamatórios, mecanismos de dor, processos alérgicos, asma bronquial drogas anti-trombóticas e drogas anti-convulsivante Estrutura cristalográfica de toxinas do escorpião Hottentotta judaica (esquerda) e da bactéria Clostridium tetani.

separação em duas células fi drogas contra o câncer.

6 Quinases: Sua função é ativar ou desativar cada etapa do ciclo celular, desde a duplicação do DNA até a separação em duas células fi drogas contra o câncer. Estrutura terciária da quinase dependente de ciclina humana (CDK).

7 Hemoglobinas: compreensão dos mecanismos funcionais de Hbs normais e mutantes, bem como, Hbs talassêmicas e relacionadas à anemia. Estrutura quaternária de hemoglobinas, do lobo guará (esquerda) e humana (direita).

8 Princípios Gerais para Cristalização de Macromoléculas Biológicas Parte crítica: obter cristais. Cristais de INHA de Mycobacterium tuberculosis, PNP humana e Hemoglobina do peixe Hoplosternum littorale.

9 Pureza da Macromolécula A purificação é um ponto importante para a cristalização; A cristalização de uma amostra de proteína não pura, resulta em cristais pequenos e mal formados; Uma amostra de macromolécula deve estar, no mínimo, 97% pura e um cristal deve ter, no mínimo, 0,2mm de tamanho.

10 Cristais pequenos e/ou mal formados

11 Estabilização e Armazenamento Armazenadas em soluções com propriedades próximas às do meio celular; A desnaturação é minimizada evitando-se condições extremas de ph e temperatura; Agentes bactericidas ou fungicidas podem ser adicionados.

12 Nucleação, Crescimento e término do crescimento. Nucleação: formação dos primeiros agregados ordenados. Requer um estado de supersaturação. Crescimento: É o aumento do cristal. Término do crescimento: Desconsiderando algumas causas, tais como, remoção da macromolécula do meio de cristalização, tem-se: defeitos de crescimento, defeitos das faces, envelhecimento da macromolécula, etc.

13 Cristais imperfeitos

14 Fatores que Afetam a Cristalização Temperatura: a solubilidade de uma proteína é dependente da temperatura, assim, é necessário que os experimentos de cristalização sejam realizados em temperatura constante; ph: proteínas são polieletrólitos com uma carga líquida que varia conforme o ph. Quando a carga líquida de uma proteína é nula, a proteína apresenta uma maior facilidade em se agregar;

15 Compostos Orgânicos e Polímeros: os polietilenoglicóis influenciam na cristalização diminuindo a atividade de água, ou seja, diminuindo a quantidade destas moléculas em solução e assim, a solução é levada a um estado de supersaturação; Força Iônica: Os sais podem diminuir ou aumentar a solubilidade de uma proteína;

16 Efeito de Solubilização por Sais Salting-in Os íons interagem com os grupos iônicos das moléculas, diminuindo as interações soluto-soluto e, aumentando a solubilidade. Representação esquemática da solubilização por salting-in.

17 Salting-out Os íons atraem as moléculas de água resultando em menor disponibilidade das mesmas para realizar interações com as moléculas de proteína.

18 Diagrama de fases de Macromoléculas Biológicas Representação do diagrama de fases de macromoléculas biológicas

20 Técnicas de Cristalização O método da Matriz Esparsa Dra. Jaru Jancarick (UC Berkeley); Diversas condições são testadas; Três parâmetros como variáveis principais: ph, aditivos e agentes precipitantes

21 Tabela 1. Componentes do método da matriz esparsa. Sais Tartarato de Sódio e Potássio; Fosfato de Amônio; Sulfato de Amônio; Acetato de Sódio; Sulfato de Lítio; Formiato de Sódio e Potássio; Citrato de Sódio; Formiato de Magnésio. Não Voláteis MDP;PEG 400; PEG1500; PEG 4000; PEG 8000 Voláteis 2-Propanol Mistura Sulfato de Amônio+PEG; 2-Propanol + PEG Aditivos Cloreto de Cálcio, Citrato de sódio, Cloreto de Magnésio, Acetato de Amônio, Sulfato de Amônio, Acetato de Magnésio, Acetato de Zinco e Acetato de Cálcio. Faixa de ph 4,6; 5,6; 6,5; 7,5 e 8,5

22 Kits para cristalização da Hampton Research Screens

23 Cristalização em Batch A macromolécula é misturada ao agente cristalizante atingindo a supersaturação instantaneamente. Representação da cristalização em batch.

24 Cristalização por Difusão de Vapor A supersaturação é alcançada por meio da difusão das espécies voláteis. Representação da montagem de uma gota de cristalização.

26 Passos para montagem de um placa de cristalização

27 Análise das gotas de cristalização

28 Cristalização por Diálise A solução precipitante pode ser facilmente trocada. Cristalização de proteínas por diálise.

29 Cristalização por Microdiálise Cristalização de proteínas pelo processo de microdiálise.

30 Melhoria das Condições de Cristalização Passo 1) Diminuição da concentração da macromolécula. Após uma semana, se não houver melhora nos cristais: Passo 2) Manter a concentração da macromolécula biológica e abaixar a concentração do agente precipitante. Após uma semana, se ainda não houver melhora nos cristais: Passo 3) Tentar microssemeadura ou macrossemeadura, ou tentar variar a temperatura.

31 Cristais adequados para coleta de dados de difração de raios X

32 Como identificar cristais de proteínas? Cristais de proteína corados com Izit

33 Cristalização Coleta de dados LNLS Difração de raios X Análise Resolução da estrutura cristalográfica

34 Montagem dos cristais

35 Analisando o modelo

36 Qual o grande objetivo da cristalografia de proteínas?

37 Cristalizando proteínas na presença de ligantes Há duas alternativas: por co-cristalização, incubando-se a proteína com o(s) ligante(s) Soaking, adicionando o(s) ligante(s) no cristal já formado

38 Desenho de Drogas

39 Sítio ativo da PNP humana, na presença do substrato e na presença de um inibidor. Inosina Imucilina H

40 Mapa de densidade eletrônica da região do sítio ativo da PNP humana na presença de ligantes.

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