1.1 Antígenos virais para uso na técnica de ELISA indireto com anticorpo de captura

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1 1. Metodologia detalhada ELISA para quantificação de anticorpos anti- PCV-2. Prof. João Pessoa Araújo Junior (Instituto de Biociencias - UNESP - Botucatu) Dra. Taís Fukuta da Cruz (EMBRAPA - Campo Grande -MS) 1.1 Antígenos virais para uso na técnica de ELISA indireto com anticorpo de captura Como antígenos virais foram utilizados os lisados e sobrenadantes de cultura de célula ST infectada com PCV2 (antígeno PCV2) e o lisado de cultura de célula ST nãoinfectada (antígeno ST). Ambos os antígenos foram tratados com 5% de Vertrell (DuPont ) e clarificados a x g por 10 minutos a 4 C. Os sobrenadantes de cada antígeno foram aliquotados em 4,5 ml e armazendos a -20 C. 1.2 Produção do antissoro de captura Inoculação do PCV2 purificado em coelho Uma coelha foi imunizada com o vírus purificado na dose de 50 μg/ml (v/v) com adjuvante completo de Freund (ACF - Gibco BRL) na primeira inoculação, por via subcutânea. Após 28 dias da primeira inoculação, o animal recebeu a segunda inoculação na dose de 50 μg/ml (v/v) com adjuvante incompleto de Freund (AIF - Sigma), por via subcutânea. Dezesseis dias após a última imunização, a coelha foi anestesiada e realizou-se a sangria total por punção cardíaca. O sangue colhido do animal foi deixado em TA para retração do coágulo. Depois, o soro obtido foi centrifugado a 2500 x g durante 10 minutos a 24 C, aliquotado em 5 ml e guardado a 20 C. Purificação da IgG de coelho anti-pcv2

2 A purificação da IgG de coelho anti-pcv2 foi realizada com a coluna HiTrap Protein G 5 ml (Pharmacia Biotech), seguindo as instruções do fabricante. A concentração protéica das frações selecionadas e reunidas da purificação foi determinada pelo método do BCA com relação à soroalbumina bovina (SMITH et al., 1985), sendo igual a 8 mg/ml. Soro/plasma de referência para uso no ELISA indireto com anticorpo de captura O soro/plasma de referência com menor quantidade de anticorpos consistiu de uma mistura de 5 amostras colhidas de animais com alta concentração de DNA viral de PCV no sangue total determinada através da PCR em tempo real e com baixo valor de D.O. a 450 nm (D.O. < 0,100) detectada pelo ELISA indireto com anticorpo de captura. Pela PCR para PCV1 e PCV2, todas as amostras foram positivas para PCV2 e negativas para PCV1. Essa mistura foi denominada de referência negativa. Para o soro/plasma de referência com maior quantidade de anticorpos, o mesmo procedimento foi realizado, sendo que 22 amostras foram obtidas de animais negativos pela PCR em tempo real para PCV no sangue total, entretanto, essas amostras pelo ELISA indireto com anticorpo de captura apresentaram altos valores de D.O. a 450 nm (D.O. > 1,500). Pela PCR para PCV1 e PCV2 todas as amostras resultaram negativas para ambos os vírus. Essa mistura foi denominada de referência positiva. Especificidade do antissoro de captura A especificidade do antissoro utilizado foi avaliada pelo método de ELISA indireto com anticorpo de captura. O antissoro de captura foi testado na concentração ótima determinada contra três tipos de antígenos preparados na diluição de uso: antígeno PCV2, antígeno ST e lisado de célula PK-15 persistentemente infectada com PCV1. A microplaca Maxisorp - Nunc foi utilizada para adsorção do antissoro de captura e os soros de referência com maior e menor quantidade de anticorpos foram empregados nessa reação como soros teste, também na diluição ótima estabelecida

3 1.3 Método do ELISA indireto com anticorpo de captura para detecção de anticorpos contra o PCV2 em soros de suínos Microplacas Nas reações de ELISA foram utilizadas microplacas de 96 cavidades de fundo chato, da marca Nunc (Maxisorp certificadas). As diluições dos soros teste e soro/plasma de referência com maior e menor quantidade de anticorpos foram realizadas em microplacas rígidas de fundo em U previamente tratadas com 10% de LPD em TCB ph 9,6 durante 18 horas a 4 ºC em câmara úmida. Desenvolvimento do ELISA indireto com anticorpo de captura Inicialmente, o antissoro de captura purificado (IgG de coelho anti-pcv2) foi diluído na concentração ótima de trabalho com TCB ph 9,6 e aplicado na microplaca no volume de 100 µl/poço. Em seguida, a microplaca foi incubada durante 18 horas a 4 ºC em câmara úmida. Juntamente com a etapa de adsorção da IgG de coelho anti-pcv2 na microplaca de ELISA, os soros teste e soros/plasma de referência foram diluídos com PBST acrescido de 10% LPD e 10% SNC em uma microplaca de fundo em U. Essa microplaca também foi incubada durante 18 horas a 4 ºC em câmara úmida, seguido de um período de incubação a 37 ºC por 1 hora e 45 minutos em câmara úmida. Após a adsorção do anticorpo de captura, realizou-se a etapa de bloqueio de ruídos pela adição de 300 µl/poço de 10% de LPD em TCB ph 9,6. Depois do período de incubação de 45 minutos a 37 ºC em câmara úmida, a microplaca foi lavada cinco vezes com PBST. Em seguida, o antígeno PCV2 e o controle sem antígeno foram preparados na diluição ótima estabelecida com PBST acrescido de 10% LPD e aplicados na microplaca no volume de 100 µl/poço. Esta etapa envolveu um período de incubação de 1 hora a 37 C em câmara úmida. Após cinco lavagens com PBST, procedeu-se com a transferência dos soros teste e soro/plasma de referência para a microplaca de ELISA, no volume de 100 µl/poço em duplicata para o antígeno PCV2 e controle sem o antígeno (PBST). Em cada microplaca, os soro/plasma de referência com maior e menor quantidade de anticorpos

4 também foram testados em duplicatas contra o antígeno PCV2 e controle sem antígeno (PBST). O período de incubação foi de 1 hora a 37 C em câmara úmida. Novamente, outra sequencia de cinco lavagens foi efetuada como descrito anteriormente. O conjugado imunoenzimáticos IgG de coelho anti-igg de suíno conjugado com peroxidase (Sigma) foi preparado na diluição 1:5000 com PBST e 10% de LPD. Essa fase foi incubada durante 1 hora a 37 C em câmara úmida. Depois, a microplaca foi lavada, como mencionado anteriormente e a solução do substrato enzimático (2,5 L de H 2 O 2 a 30%) com o cromógeno (100 L do TMB a 10 mg/ml em DMSO) foi diluída em 10 ml do Tampão Citrato/Acetato 0,1 mol/l ph 6,0. A microplaca foi mantida sob agitação constante durante 15 minutos em TA. A reação colorimétrica foi bloqueada com a solução de HCl 2M no volume de 50 L/cavidade e a leitura das D.O. foi realizada em um comprimento de onda de 450 nm (Multiskan EX Labsystems) contra um branco onde foi colocado apenas o substrato e o bloqueador da reação colorimétrica. Determinação do índice ELISA O índice ELISA (IE) foi calculado para cada soro teste, após a subtração da média da D.O. encontrada para o controle sem antígeno (PBST) da média da D.O. obtida para o antígeno PCV2. Para as duplicatas dos soros teste foram consideradas satisfatórias aquelas que apresentavam um desvio-padrão menor que 0,2. Assim, a seguinte fórmula foi utilizada para o cálculo do IE: IE = X A/B A Onde, X = média das D.O. obtidas de cada soro teste após a subtração da média da D.O. do controle sem antígeno da média da D.O. do antígeno PCV2. A = média das D.O. obtidas do soro/plasma de referência negativo B = média das D.O. obtidas do soro/plasma de referência positivo 1.4 Teste da reprodutibilidade do ELISA indireto com anticorpo de captura

5 Para a verificação da reprodutibilidade do método, foi realizada a análise interteste e intra-teste. Em ambos os casos, o mesmo soro teste foi utilizado. No inter-teste, essa amostra foi testada em 11 reações durante o período de aplicação da técnica para a detecção de anticorpos contra o PCV2 nas demais amostras. O intra-teste foi efetuado em uma reação de ELISA executada durante o experimento, na qual o soro teste escolhido para essa análise foi aplicado em 11 locais diferentes da microplaca.