Aminoácidos, péptidos e proteínas

Transcrição

1 Aminoácidos, péptidos e proteínas

2 Algumas funções de proteínas: Luciferina e luciferase Hemoglobina Queratina

3 Funções das proteínas 1.Catálise enzimática 2.Transporte e armazenamento 3.Movimento coordenado 4.Suporte mecânico 5.Protecção imune 6.Geração e transmissão de impulsos nervosos 7.Controlo do crescimento e diferenciação

4 Estrutura geral de um aminoácido como ião dipolar

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7 Convenção: Código de 3 letras : as três primeiras letras do nome Código com uma letra: Margaret Dayhoff ( ) diminuir o tamanho dos ficheiros. CHIMSV 6 aa a 1ª letra do nome (é única) ex. cisteína, histidina AGLPT 5 aa a 1ª letra (não é única) dos aa mais comuns. Ex.leucina é mais comum que lisina.

8 RFYW 4 aa sugerido fonéticamente Ex. arginine, tyrosine DNEQ -4 aa letras sugeridas pelos nomes Ex. aspardic, asparagine K lisina - sobravam poucas letras e era a letra mais perto do L

9 As proteínas são constituídas apenas por L-aminoácidos

10 Relação estérea dos estereoisómeros da alanina com a configuração absoluta do L- e D- gliceraldeído

11 Os aminoácidos podem ser classificados com base nas propriedades do grupo R Grupos R alifáticos, não polares Glicina Alanina Prolina Valina Leucina Isoleucina Metionina

12 Grupos R aromáticos Fenilalanina Tirosina Triptofano

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14 Grupos R sem carga, polares Serina Treonina Cisteína Asparagina Glutamina

15 Cisteína Cistina Cisteína

16 Grupos R carregados positivamente Lisina Arginina Histidina

17 Grupos R carregados negativamente Aspartato Glutamato

18 Aminoácidos não comuns também têm papéis importantes Paredes celulares de plantas Colagéneo 4 - Hidroxiprolina

19 5 - Hidroxilisina Colagéneo

20 6 N - Metillisina Miosina proteína contráctil do músculo

21 γ - Carboxiglutamato Protrombina proteína envolvida na coagulação do sangue Outras proteínas que se ligam ao Ca

22 Alguns resíduos de aa podem ser modificados transientemente (adição de grupos fosforil, metil, acetil, etc) modificações regulatórias Ornitina e citrulina aa envolvidos na biossíntese de arginina e no ciclo da ureia.

23 Forma não iónica Forma zwiteriónica O estado de ionização de um aminoácido depende do ph Os aminoácidos podem funcionar como ácidos ou bases fracos

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25 Titulação de um aminoácido

26 Efeito do ambiente químico sobre o pka

27 Curva de titulação do glutamato

28 Curva de titulação da histidina

29 Sumário: Os 20 aa têm um grupo α-carboxílico e um grupo α-amino. O C α é assimétrico. Nas proteínas apenas há L- aa. Os aa variam nas suas propriedades ácido-base e têm curvas de titulação características. Outros aa menos comuns, existem quer nas proteínas (após modificação) ou como metabolitos livres Os aa são classificados em 5 grupos com base na sua polaridade e carga (a ph 7) do seu grupo R.

30 Péptidos e Proteínas

31 A ligação peptídica

32 Ligação peptídica

33 dipéptido Ligação peptídica

34 dipéptido tripéptido tetrapéptido pentapéptido... oligopéptido...polipéptido MM Da

35 Um pentapéptido

36 Terminal N ou amina Terminal C ou carboxilo Ser Gly Tyr Ala Leu serilgliciltirosilalanileucine SGYAL

37 Estrutura predominante do tetrapéptido alanilglutamilglicillisina a ph7 Carga global 0 pi = 7 Ponto isoelétrico de uma proteína ph ao qual a carga global é zero

38 Péptidos com importância biológica

39 L-aspartil-L-fenilalanina metiléster adoçante

40 hormona Piroglutamato Histidina Prolilamida piroglu-his-pro-nh 2 TRH - hormona de libertação da tirotropina

41 hormona Piroglutamato Histidina Prolilamida piroglu-his-pro-nh 2 TRH - hormona de libertação da tirotropina forma-se no hipotálamo a partir de Glu-His-Pro

42 Outras hormonas que são péptidos Oxitocina (9 res) pituitária; estimula as contracções uterinas Bradicinina (9 res) inibição da inflamação de tecidos Vasopressina aumento a tensão arterial Insulina (2 cadeias com 30 res) reduz a glucose no sangue promovendo a sua entrada nas células.

43 Venenos Amanitina Amanitin is the most powerful poison... Antibióticos gramicidinas, polimixinas, bacitracinas, glicopéptidos, etc

44 Neuropéptidos: encefalinas, endorfinas...

45 Massa Molecular de algumas proteínas MM nº res nºcadeias Nº aproximado de aa de uma proteína = MM/110

46 Proteínas constituídas por uma cadeia polipeptídica Proteínas multiméricas dois ou mais polipéptidos iguais ou diferentes, associados não covalentemente. As subunidades idênticas chamam-se protómeros. Ex. hemoglobina

47 Algumas proteínas têm duas cadeias polipeptídicas ligadas covalentemente Ex.insulina bovina

48 Composição em aminoácidos de duas proteínas

49 Cálculo do nº de aminoácidos de uma proteína Massa molecular média dos aminoácidos = 138 Média ponderada dos aminoácidos mais frequentes = 128 Eliminação de uma molécula de água por ligação peptídica = 110 Massa molecular média de um resíduo de aa numa proteína 110 Massa molecular da proteína / 110 = nº de aa de uma proteína

50 Simples Proteínas Conjugadas Grupo prostético

51 Proteína conjugada g.prostético exemplo Lipoproteína Lípido Β 1 -lipoproteína sangue Glicoproteína glúcido Imunoglobulina G Fosfoproteína fosfato Caseína do leite Hemoproteína Hemo (Fe porfirinico) Hemoglobina Metaloproteína Fe Ferritina Zn Alcooldesidrogenase Ca Calmodulina Mo Dinitrogenase Flavoproteína FAD Succinato desidrogenase

52 Proteínas em solução Interacções electrostáticas entre macroiões

53 Variação da solubilidade de proteínas com o ph e força iónica I = ½ M i Z i 2 Salting in Aumentando a concentração de sal, a solubilidade de uma proteína aumenta. Salting out A concentrações salinas muito elevadas, a solubilidade das proteínas diminui.

54 Células e tecidos usados em estudos bioquímicos E.coli, S.cerevisiae, chlamydomonas, folha de espinafre, fígado de rato, músculo esquelético Fonte homogénea e grande quantidade: culturas de microrganismos, tecidos, mutantes genéticos. Alguns materiais são ricos num componente específico: Músculo esquelético actina e miosina Células do pâncreas RER Células espermáticas DNA Células do fígado enzimas das vias biosintéticas Folhas de espinafre, eritrócitos, vírus,

55 As proteínas podem ser separadas e purificadas Tecido ou células lise Extracto bruto Fraccionamento subcelular Extracto Fraccionamento de proteínas Proteína em estudo

56 As proteínas podem ser separadas e purificadas Solubilidade Salting out Tamanho Diálise, cromatografia de exclusão molecular Carga Cromatografia de troca iónica Afinidade Cromatografia de afinidade

57 Diálise

58 Cromatografia em coluna reservatório Fase móvel (amostra de proteínas) Fase estacionária (matriz porosa) suporte poroso efluente proteínas

59 Carga + + Carga + Carga- Carga- - Cromatografia de troca iónica (catiónica) Explora diferenças de sinal e intensidade de carga eléctrica de proteínas a um determinado ph Partículas poliméricas com grupos funcionais negativos As proteínas movem-se através da coluna a velocidades dependentes da carga e do ph usado

60 Questão: Um biólogo pretende separar dois péptidos por cromatografia de troca iónica. Ao ph da fase móvel a usar na coluna, um péptido (A) tem uma carga global de -3, devido à presença de mais resíduos Glu e Asp do que Arg, Lys e His. O péptido B tem uma carga global de +1. Qual dos péptidos seria primeiro eluído de uma resina de troca catiónica? Qual seria eluído primeiro de uma resina de troca aniónica?

61 Partículas poliméricas porosas Cromatografia por exclusão ou filtração gel As moléculas de proteína separam-se por tamanho; as maiores saiem (eluem) primeiro

62 Cromatografia de afinidade Proteína X ligando Amostra inicial (mistura de proteínas) Solução do ligando Mistura de proteínas é adicionada à coluna contendo um polímero com um ligando específico para a proteína X Proteínas diferentes de X são retiradas por lavagem da coluna Proteina X é eluida por solução de ligando

63 HPLC- high performance liquid cromatography

64 Exemplo de tabela de purificação do enzima X Vol. Prot. Activ. Passo fracção(ml) total(mg) Activ. espec. 1. extracto cru prec. c/ sulf. am crom. troca ion filtração gel crom. afinidade

65 Actividade vs actividade específica Os dois copos contêm a mesma actividade da proteína. O segundo tem uma actividade específica mais elevada

66 Amostras diferentes em cada poço electroforese poço direcção da migração Gel de poliacrilamida

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68 Purificação de RNA polimerase de E.coli

69 Determinação do peso molecular de uma proteína

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71 Isoelectrofocagem: separa proteínas conforme o pi

72 Pontos isoeléctricos de algumas proteínas

73 Electroforese a duas dimensões: combinação de isoelectrofocagem e electroforese em acrilamida

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76 Níveis de estrutura na proteína primário quaternário secundário terciário

77 Estrutura covalente das proteínas A purificação de uma proteína é o principio

78 A função de uma proteína depende da sua sequência de aminoácidos Proteínas com diferentes funções têm diferentes composições em aa. Doenças genéticas humanas envolvendo alterações em aa, têm na origem proteínas com funções alteradas. Proteínas com funções semelhantes em espécies diferentes, têm sequências de aa semelhantes (ex. a ubiquitina). Polimorfismo.

79 A sequência de aminoácidos de uma proteína é invariante? 20-30% das proteínas no homem são polimórficas (variantes) Como determinar a sequência?

80 Sequência de aminoácidos da insulina bovina a 1ª proteína a ser sequenciada

81 Determinação da sequência em aminoácidos de uma proteína (estrutura primária) 1.Determinação da composição em aminoácidos: Proteína completamente hidrolisada (110 0 C, 24h em HCl 6N). Aa separados e quantificados por cromatografia de troca iónica

82 2. Identificação do aminoácido N terminal Método de Sanger (FDNB) Degradação de Edman (fenilisotiocianato)

83 polipéptido Reagente de Sanger 2,4- dinitrofenil deriv. do polipép. 2,4-dinitrofenil deriv. do res N terminal Mistura dos restantes aa (inutil para prosseguir)

84 polipéptido Sequenciação de um polipéptido Reagente de Sanger 2,4- dinitrofenil deriv. do polipép. 2,4-dinitrofenil deriv. do res N terminal Mistura dos restantes aa (inutil para prosseguir) Apenas permite identificar aa do terminal N

85 polipéptido Sequenciação de um polipéptido Reagente de Sanger 2,4- dinitrofenil deriv. do polipép. 2,4-dinitrofenil deriv. do res N terminal Mistura dos restantes aa (inutil para prosseguir) Reagente de Edman PTIC feniltio isocia nato Identificação do aa N terminal aducto PTC Polipéptido com n-1 resíduos que reage de novo com PTIC

86 cloreto de dabsilo cloreto de dansilo

87 3. Cisão das pontes dissulfureto As ligações dissulfureto interferem com o procedimento de sequenciação. Oxidação pelo ácido perfórmico Redução pelo ditiotreitol(dtt) ou β-mercaptoetanol

88 lig.persulfureto Ditiotreitol (DTT) oxidação ac. perfórmico Redução por DTT 2 res. ácido cisteico acetilação por iodoacetato cisteínas acetiladas

89 4. Fragmentação dos péptidos A cadeia polipéptica é fragmentada em segmentos mais pequenos que são depois separados por métodos cromatográficos ou electroforéticos

90 Especificidade de alguns métodos comuns de fragmentação de cadeias polipeptídicas reagente (fonte) ponto de clivagem Tripsina (pâncreas bovino) Submaxillarus protease (glândula submaxilar) Quimotripsina (pâncreas bovino) Protease V8 (Staphylococcus aureus) Asp-N- protease (Psedomonas fragi) Pepsina (estômago de porco) Endoprotease Lys C (Lysobacter enzymogenes) CNBr

91 5. Sequenciação dos péptidos Cada péptido é sequenciado pelo procedimento de Edman. 6. Ordenamento dos fragmentos do polipéptido inicial Utilizam-se outros enzimas ou químicos para reconstruir a sequência da proteína original

92 Sequenciação de uma proteína

93 7. Localização das ligações dissulfureto A proteína é hidrolisada com um enzima (ou químico) mas sem antes se terem cindido as ligações dissulfureto. Os péptidos são separados por electroforese e comparados com o conjunto de péptidos gerados pelo mesmo enzima (químico). Por cada ligação dissulfureto não aparecerão dois péptidos e será visível um péptido maior.

94 A sequência de aminoácidos pode ser deduzida por outros métodos

95 A sequência de resíduos de aminoácidos de uma proteína fornece informações sobre: Estrutura tridimensional Função Localização celular Evolução

96 Níveis de estrutura na proteína primário quaternário secundário terciário