Cromatografia - uma definição. Sistemas de cromatografia e suas aplicações. Cromatografia. Cromatografia. Cromatografia - os tipos principais

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1 7/1/213 Cromatografia - uma definição Sistemas de cromatografia e suas aplicações Prof. Alan McBride Proteômica Biotecnologia, CDTec, UFPel A cromatografia é uma técnica de separação baseada na distribuição dos componentes de uma mistura entre um fluido (fase móvel ou eluente) e um adsorvente (fase estacionária). A fase estacionária pode ser um sólido ou um líquido depositado num sólido inerte, empacotado numa coluna ou espalhado por uma superfície formando uma camada fina. Cromatografia Transporte dos componentes de uma amostra por uma fase móvel através de uma fase estacionária (sólido) Cromatografia Conceito de coeficiente de partição: Qualquer soluto particionar entre dois solventes imiscíveis; Um soluto imóvel (sólido ou estacionário) e o outro é móvel representa as aplicações mais comum na cromatografia; Cromatografia de fase para a frente: o suporte é polar, ex. papel, silica; Cromatografia de fase reversa: o suporte é nãopolar. Cromatografia - os tipos principais Preparativo Separação dos componentes de uma mistura para uma aplicação avançada; É um tipo de purificação Analítico Menor quantidade de material; Determinar as proporções relativas na mistura. Misturas e compostos Analito - substância a ser separada durante a cromatografia. Mistura duas ou mais substâncias misturadas, mas não quimicamente combinado Ar: uma mistura de gases Nevoeiro: água suspenso em ar Composto dois ou mais elementos quimicamente combinado Sal: um composto de sódio e cloro (NaCl) Água: um composto de hidrogênio e oxigênio (H 2 O) 1

2 7/1/213 Soluções Os processos cromatográficos Solução uma mistura onde uma substância é dissolvida em uma outra. Uma solução tem duas partes: Soluto: é a substância dissolvida. Solvente: é a substância que dissolver a outra. Solubilidade a capacidade de uma substância de se dissolver. Cromatografia em camada delgada É uma técnica de adsorção líquido sólido Separação de misturas Química orgânica monitor reações TIPOS DE CROMATOGRAFIA Cromatografia em camada delgada Uso de placas de plástico ou vidro para identificar pigmentos, químicos e outros substâncias desconhecidos. Cromatografia de papel Pode separar os compostos de tintas, plantas (ex clorofila), maquiagem e outras substâncias. Cromatografia líquida HPLC A fase móvel é liquida e é arrastada através da coluna apenas por força da gravidade Tipos: HPLC, FPLC, Íon, Afinidade Cromatografia liquido Usada para identificar pigmentos e outros compostos desconhecidos de plantas. High-performance liquid chromatography Cromatografia líquida de alta eficiência Separação de misturas de compostos química analítica e bioquímica, medicina, doping Idenitificação, quantificação e purificação dos componentes da mistura 2

3 7/1/213 FPLC Fast protein (performance) liquid chromatography Cromatografia líquida de proteína rápida Mais comum é troca iônica Cromatografia gasosa ou líquida-gasosa A fase móvel é um gás e é feito usando uma coluna; Com base no equilíbrio de partição de analito entre a fase sólido e um gás móvel. Anaizar e purificar misturas de proteínas Cromatografia gasosa Usada para determinar a composição química de substâncias desconhecidos, ex composto de gasolina, ver cada peco no gráfico abaixo. Cromatografia gasosa Química analítica Separação e analise de misturas de compostos que podem ser vaporizado (< 3 C) sem decomposição Testes de pureza Cromatografia preparativo Cromatografia em Camada Delgada CCD é uma técnica de adsorção líquido sólido: A separação é em função da migração diferencial sobre uma camada delgada de adsorvente, fixo numa superfície plana, por meio de uma fase móvel (um líquido ou misturas de líquidos). O fenômeno é principalmente de adsorção: A separação se dá pela diferença de afinidade dos componentes de uma mistura pela fase estacionária. Os adsorventes comerciais mais utilizados são: sílica, alumina, celulose, terra diatomácea e poliamida. CCD Utiliza-se pequena quantidade de amostra (microgramas a miligramas). As manchas podem ser reveladas por meio de luz UV, vapores de iodo, soluções de cloreto férrico e tiocianoferrato de potássio, fluorescências, radioatividade, etc. 3

4 7/1/213 CCD Fator de retenção (Rf): O qual é a razão entre a distância percorrida pela substância em questão e a distância percorrida pela fase móvel. Os valores ideais para Rf estão entre,4 e,6. CCD A CCD pode ser usada tanto na escala analítica quanto na preparativa. Método simples, rápido, visual e econômico. A CCD pode ser usada para: Identificar os compostos presentes em uma mistura; Determinar a pureza de uma substância. Cromatografia Gasosa Partição dos componentes de uma amostra entre a fase móvel gasosa e a fase estacionária líquida. A utilização de fases estacionárias sólidas, as quais levariam à separação por adsorção, apresenta poucas aplicações. Técnica analítica mais utilizada: Além de possuir um alto poder de resolução, é muito atrativa devido à possibilidade de detecção em escala de nano a picogramas (1 9 a 1-12 g). A grande limitação deste método é a necessidade de que a amostra seja volátil ou estável termicamente. Cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) É baseado na partição dos componentes de uma amostra entre a fase móvel líquida e a fase estacionária sólida. A versatilidade desta técnica reside no grande número de fases estacionárias existentes, as quais possibilitam análises e separações de uma ampla gama de compostos com alta eficiência. a) reservatório da fase móvel; b) bomba de alta pressão; c) válvula de injeção; d) coluna; e) detector e f) registrador. HPLC Perfil cromatográfico de uma análise registrada automaticamente, de padrões de aminoácidos. Fonte: Lehninger,

5 7/1/213 HPLC HPLC As separações em HPLC podem se dar por adsorção, partição ou ambos. O suporte mais utilizado é a sílica. As fases quimicamente ligadas, dependendo da modificação feita ao suporte, podem atuar no modo normal, reverso ou ambos. Na cromatografia em fase normal, a fase estacionária é mais polar que a fase móvel, e em fase reversa, a fase móvel é mais polar. Separações analíticas são predominantemente realizadas em fase reversa A fase C18 (octadecilsílica) é a mais usada. Separações no modo reverso utilizam fases móveis aquosas. Tem sido utilizada em várias áreas da ciência, no acompanhamento de sínteses, em análises de pesticidas, feromônios, no isolamento de produtos naturais e sintéticos e na produção e controle de qualidade de medicamentos, dentre tantas outras aplicações. Cromatografia de afinidade (CA) Baseada na capacidade de uma proteína/componente se ligar especificamente a outra partícula. As colunas contêm esferas ligadas covalentemente a anticorpos específicos da proteína de interesse. As partículas são depois eluídas por ex. por uma solução concentrada de ligando, ph diferente do de ligação. CA Superfície da espera ligada ao epóxi, aldeído ou grupos de éster aril. Immobilized metal ion affinity chromatography (IMAC) Iminodiacético + Ni 2+ /Zn 2+ /Co 2+ CA Cromatografia iônica (CI) dez3no2:1_UV 24dez3no2:1_Cond 24dez3no2:1_Conc 24dez3no2:1_Fractions %B Waste min IMAC purificação SDS-PAGE das frações É a troca de íons de mesmo sinal entre uma solução e um corpo sólido muito insolúvel. Corpo sólido = trocador de íons = resina útil polímeros portadores de carga elétrica que possuem íons ativos que permutam reversivelmente de posição com outros íons de uma solução. Proteínas grandes, nucelotídeos pequenas e aminoácidos 5

6 7/1/213 CI Importante: o grau que um íon é absorvido preferencialmente em relação a um outro íon: Cresce com o aumento da carga dos íons permutantes: (Na + < Ca 2+ < Al 3+ < Th 4+ ) Cresce com a diminuição do tamanho do íon hidratado: (Li + < H + < Na + < NH 4+ < K + < Rb + < Cs + ) A afinidade relativa do íon de maior carga cresce em proporção direta com a diluição. CI Análise consiste de quatro etapas: Transporte Separação Detecção Análise de dados CI CI Transporte A amostra líquida é transportada por um eluente líquido, com composição e concentração conhecidos. O sistema opera sob pressão. Separação Os diferentes íons da amostra migram completamente na coluna de separação em diferentes períodos de tempo, de acordo com as interações com os sítios ativos da coluna de separação. Detecção Feita por uma célula de condutividade, que monitora e mede a condutância elétrica dos íons da amostra, produzindo um sinal baseado em uma propriedade física ou química do analito. Análise de dados Software que recebe o sinal da célula de condutividade e analisa os dados comparando os picos da amostra em um cromatograma com os produzidos por uma solução padrão. Vantagens de CI Permite a determinação de espécies iônicas, orgânicas e inorgânicas; Sensibilidade a baixas concentrações (μg/l ou menos); Tempo de análise (15 minutos); Pequenos volumes de amostra (1 ml). Desvantagens de CI Custos alto Equipamento e treinamento Produtos químicos (eluente e regenerante) Mão de obra especializada Técnico capacitado em operar o equipamento e analisar os resultados. 6

7 7/1/213 O lisado de E. coli contém milhares de proteínas Meio de cultura ~1 proteínas Lipopolissacarídeos PURIFICAÇÃO DE PROTEÍNAS RECOMBINANTES Periplasma ~1 proteínas Citoplasma ~2 proteínas Membrana externa Peptídeoglicano Membrana interna Afinidade Os 5 princípios de separação Gel filtração Troca iônica Interação hidrofóbica Fase reversa Recombinant Protein Purification Handbook, GE Healthcare Gel filtração A técnica mais simples de cromatografia. As proteínas maiores não entram nos poros da matriz saem primeiro. As proteínas menores demoram mais para sair da coluna. Dois tipos: Separação de grupos. Separação de alta resolução. Separação baseada na carga global da superfície de cada proteína. Dependente do ph. Eluição com gradiente de NaCl. Pode diferenciar entre duas proteínas que diferem por só um aminoácido. Troca iônica Preparação de amostra 7

8 dez3no2:1_UV 24dez3no2:1_Cond 24dez3no2:1_Conc 24dez3no2:1_Fractions Waste min %B /1/213 Proteínas de fusão Vários tipos de caudas: 6 His GST MBP Proteína de fusão com cauda de histidina (6 His) Cromatografia de afinidade por metal imobilizado (IMAC): Cu 2+, Zn 2+, Co 2+ e Ni 2+ tem afinidade para 6 His A sefarose pode ser usada em colunas: Seletor os poços que tem expressão das proteínas (vermelho) Expressar a proteína em larga escala IMAC para purificar a proteína 1. Ressuspender o pellet em tampão de lise (Tris 2 mm, EDTA 1 mm, Imidazol 1-4 mm ) e sonicar a suspensão; 2. Centrifugar a suspensão (4 C, 16. rpm, 3 min) e coletar o sobrenadante; Produto final 3. Equilibrar a coluna de sefarose com tampão 1 (Tris 2 mm, EDTA 1 mm, Imidazol 1-4 mm ) e aplicar o sobrenadante a coluna; 4. Lavar a coluna 1x com tampão 1; 5. Aplicar tampão 1 e tampão 2 (PBS, 5 mm Imidazol) para formar um gradiente 1-4 até 5 mm Imidazol (eluição das proteína recombinantes) e coletar as frações dez3no2:1_UV 24dez3no2:1_Cond 24dez3no2:1_Conc 24dez3no2:1_Fractions %B SDS-PAGE das frações Waste min AKTAprime 8

9 7/1/213 Trocar o tampão final e remover o imidazol; Diálise Gel filtração Verificar a purificação de sua proteína recombinante: M Verificar a concentração de proteína recombinante: Ex. métodos de Bradford ou Lowry Fontes de informação THE CUBE SEPARAÇÃO DE PROTEÍNAS Handbooks, GE Healthcare 9