Trabalho realizado por: Francisco Roque, nº 9 11ºA CROMATOGRAFIA

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1 Trabalho realizado por: Francisco Roque, nº 9 11ºA CROMATOGRAFIA

2 INTRODUÇÃO A cromatografia é uma técnica analítica, qualitativa, que permite separar os componentes de uma mistura atendendo a propriedades como a solubilidade, tamanho e massa. Baseia-se nas diferentes velocidades de deslocamento das moléculas através de um meio poroso fase estacionária -, quando arrastadas por um eluente (líquido ou gasoso) em movimento fase móvel. A separação cromatográfica está relacionada com o fenómeno de adsorção (aderência de partículas, moléculas ou iões) à fase estacionária, que pode ser um papel poroso, sílica gel, albumina, etc. Quando misturas gasosas ou líquidas são postas em contacto com um meio sólido, as diferentes moléculas ou iões que as constituem, são por ele retidas mais ou menos fortemente, consoante as suas características anteriormente referidas. Depois das partículas aderirem ao suporte, na fase estacionária, é possível separá-las recorrendo a eluentes apropriados. O suporte cromatográfico pode ser apresentado como camada plana, para a cromatografia de camada plana e enchimento de uma coluna, na cromatografia em coluna. A cromatografia pode ser, quanto ao método de introdução da amostra, zonal, onde a amostra é aplicada de uma só vez, numa determinada zona e que permite separar completamente todos os componentes de uma amostra; ou frontal, quando a amostra é introduzida de um modo contínuo e cada componente é retido pela fase estacionária até à saturação desta, após o que atravessa completamente na fase móvel. As técnicas cromatográficas podem ser classificadas como: Cromatografia de partição Esta baseia-se nas diferentes solubilidades dos componentes de uma mistura, em ambas as fases, as quais são as duas líquidas. Pode ser efectuada em papel ou em coluna como suportes. Ambos estes processos vão ser descritos mais à frente. O coeficiente de partição é independente da concentração e de outras substâncias da mistura. Cromatografia de adsorção Baseia-se nas diferentes afinidades adsorventes da superfície da fase estacionária. É uma cromatografia em que a fase móvel é liquida e a fase estacionária é sólida. O suporte pode ser de alumina ou sacarose para a cromatografia de coluna e vidro ou alumínio para a cromatografia em camada fina. A separação baseia-se nas interacções entre moléculas dos solutos da fase móvel liquida e a superfície da fase estacionária sólida. Existem dois tipos de cromatografia de adsorção, em camada fina, onde se faz passar lentamente através de uma coluna de material adsorvente uma mistura líquida, cujos componentes se vão depositando em zonas distintas da coluna, devido à diferença de velocidade de arrastamento de cada um; e em coluna, que se aplica sobretudo em separação de espécies não-iónicas solúveis em solventes orgânicos segundo a polaridade, o número relativo e a posição do grupo funcional. Esta técnica tem as desvantagem do aparecimento de caudas nas bandas e na dificuldade de reprodução da actividade da fase estacionária quando se usam agentes desactivadores.

3 A adsorção pode ser feita quer por substâncias apolares (carvão activado), quer por substâncias polares (óxidos e sais). Além das moléculas do soluto, também as moléculas do solvente são adsorvidas pela fase sólida, sendo necessária a deslocação de moléculas adsorvidas de solvente por moléculas de soluto, para adsorção destas. Ainda existe também a cromatografia de partição iónica. Todos estes processos cromatográficos baseiam-se em alguns princípios como a mudança de fase (adsorção a um suporte sólido), partição de gases ou separação em solução que pode acontecer por efeito de crivo ou efeito eléctrico. Ao introduzir uma amostra na coluna, ela é arrastada pelo eluente e sofre sempre alguma dispersão. As principais causas disto são: - A não existência de um equilíbrio entre as duas fases. - Problemas de transferência de massas. - A possibilidade de existência de reacções do soluto com a fase fixa sendo esta mais lenta e por isso limitante, não permitindo que o equilíbrio seja atingido. - A existência de gradientes de concentração do soluto que originam dispersão molecular. Uma boa separação dos diferentes pigmentos depende sempre de: - Selectividade e capacidade de adsorção por parte do material que constitui o enchimento relativamente aos diferentes solutos. - Altura do prato que é uma medida da dispersão no interior da coluna. Parâmetros de retenção Através da velocidade com que os componentes da amostra se deslocam em relação ao solvente pode-se efectuar a separação cromatográfica e determinar a razão de retenção. Esta é a razão entre a velocidade média da substância e a velocidade média do eluente e está representada a sua fórmula em seguida: Rr = velocidade média da substância velocidade média do eluente Na cromatografia plana, define-se geralmente, um outro parâmetro de retenção, a razão de retardação Rf. Este valor não coincide exactamente com o anterior pois avalia a distância percorrida pela substância e pelo eluente e a velocidade da frente do eluente, deslocando-se no suporte seco, é superior à velocidade média do suporte molhado. A seguinte fórmula ilustra esta razão, considerando o mesmo espaço de tempo: Rf = distância percorrida pela substância distância percorrida pelo eluente Pigmentos fotossintéticos Os pigmentos fotossintéticos são moléculas particulares que apenas existem nos seres vivos autotróficos, que realizam a fotossíntese, e cuja principal função é captar a energia luminosa e convertê-la em energia química. Estes pigmentos têm a propriedade de absorver as radiações luminosas no espectro do visível (comprimentos de onda entre os 400 e os 700 nm). Esta absorção não é eficiente em todo os espectro e por essa razão algumas radiações são reflectidas, apresentando as moléculas essa coloração.

4 Os três principais tipos de pigmentos envolvidos na fotossíntese são as clorofilas, os carotenóides e as ficobilinas. Nem todos têm a mesma importância para a fotossíntese, por isso são classificados como principais (clorofila a) e acessórios (todos os outros). Clorofilas existem quatro tipos de clorofilas (a, b, c e d), cujas diferenças ocorrem apenas na alteração de alguns grupos químicos (CHO, CH 3, CHCH 2 ) nas moléculas constituintes. Estas são formadas por duas estruturas fundamentais: um anel porfirínico, ao qual se liga perpendicularmente o fitol, uma molécula linear de hidrocarbonatos. Esta molécula é insolúvel em água mas solúvel em compostos orgânicos como o éter, o benzeno e a acetona devido às propriedades apolares do fitol. Elas dão coloração verde às plantas e quando dissolvidas também formam soluções com coloração verde intensa. Embora absorvam radiação em todos os comprimentos de onda do espectro do visível, têm alguns picos de absorção nas regiões do azul-violeta (400 nm) e do vermelho (600 nm), o que faz com que surjam com coloração verde, uma vez que é a cor que reflectem. A clorofila a está presente em todos os organismos que libertam oxigénio na fotossíntese; a clorofila b encontra-se junto com a clorofila a em todas as plantas e algas verdes; a clorofila c encontra-se nas diatomáceas, dinoflagelados e algas castanhas; a clorofila d encontrase em algumas algas vermelhas. Carotenóides constituem outro grupo de pigmentos com actividade fotossintética, apesar de também poderem ser observados nos animais. Apresentam colorações que vão desde o amarelo ao castanho, passando pelo laranja e pelo vermelho. A sua cor só é visível durante o Outono, pois no resto do anos estão mascarados pelas clorofilas. Diferem muito das clorofilas em termos de composição química, pois são formados por longas cadeias lineares hidrocarbonatadas insaturadas, com anéis benzénicos nas extremidades. Alguns carotenóides possuem apenas átomos de carbono e hidrogénio nas suas cadeias, sendo designados por carotenos. Os mais comuns na Natureza são o α, β e γ-caroteno. Outros carotenóides para além de hidrogénio e carbono, possuem também átomos de oxigénio na sua composição e são designados por xantofilas. A luteína e o fucoxantol são as xantofilas mais comuns. Ambos os carotenóides estão presentes nos cloroplastos sob a forma de complexos proteicos insolúveis em água. As suas funções fundamentais são a absorção da energia luminosa e protecção das clorofilas contra os fenómenos de fotoxidação. Estes pigmentos surgem com tonalidades vermelhas e avermelhadas pois absorvem nas regiões do azul e do verde. A luz Um feixe de luz branca é formado pelo somatório de uma sucessão contínua de cores: vermelho, laranja, amarelo, verde, azul, anil e violeta. O conjunto formado por esta secessão constitui o espectro visível. Com o auxílio de um instrumento denominado de espectroscópio óptico, podemos decompor luzes complexas de modo a conhecer as luzes simples que as compõem e observar os seus respectivos espectros. Um objecto apresenta-se de uma determinada cor quando incide luz branca sobre eles pois existem na sua constituição substâncias com a capacidade de absorver diferencialmente as cores do espectro visível, reflectindo as restantes. A cor de uma substância não é uma característica física desta, depende do tipo de luz

5 incidente. O tomate, na presença de luz branca absorve todas as cores excepto o vermelho, que é reflectido, se iluminarmos o tomate maduro com luz verde, vêmo-lo preto pois esta cor é absorvida. Espectros de absorção Os espectros de absorção obtêm-se quando se interpõe uma amostra de uma solução entre a fonte emissora de luz e o espectroscópio, que têm como finalidade dispersar a luz que os atinge. Apresentam-se como uma sequência de bandas coloridas intermeadas por bandas pretas. Considere-se uma amostra de solução de clorofila obtida por maceração em álcool de folhas verdes. Se colocarmos esta solução entre uma fonte de luz branca e a janela do espectroscópio, observamos uma sucessão de bandas coloridas intercaladas por bandas pretas. As bandas pretas situam-se nas zonas dos azuis e dos violetas, preferencialmente, e algumas ainda nos vermelhos. Correspondem às cores absorvidas pela clorofila. As cores predominantes neste espectro são o verde e o verde-amarelado; é a sobreposição destas cores que confere o tom esverdeado à clorofila. Espectros de emissão Os espectros que se observam através de um espectroscópio a partir das luzes emitidas, quer pela chama de uma lamparina de álcool ou de um sólido incandescente, são, tal como o espectro visível da luz branca, constituídos por uma sucessão contínua de luzes de diferentes cores, podendo apresentar bandas de cor predominantes às outras, consoante a temperatura a que o corpo de emissão se encontra. Estes são os espectros de emissão contínuos. Existem ainda os espectros de emissão de riscas, sujeitando gases rarefeitos a descargas eléctricas. Cada elemento tem o seu espectro de emissão de riscas característico, podendo-se identificá-los apenas por isto. Os espectros de emissão de riscas caracterizam um elemento químico permitindo a sua identificação, tal como os respectivos espectros de absorção. OBJECTIVOS Neste trabalho vamos proceder à separação de uma solução desconhecida, comparando a sua razão de retardação com a de outras duas conhecidas, o azul de metileno e o alaranjado de metilo. A técnica cromatográfica utilizada será a cromatografia em camada fina em suporte de sílica gel alumínio. Vamos também separar os componentes de uma mistura de macerado de plantas recolhidas em acetona, identificando os seus constituintes. Vamos utilizar a técnica de cromatografia em coluna com suporte de albumina. Vamos também observar os espectros das xantofilas e das clorofilas com um espectroscópio.

6 MATERIAL 1- CROMATOGRAFIA EM CAMADA FINA - câmara cromatográfica - placa cromatográfica de sílica gel 60,0,2 mm de espessura em alumínio - mistura desconhecida - solução de azul de metileno - solução de alaranjado de metilo - solução eluente 2- propanol / ac. acético 15:2 v/v 2- CROMATOGRAFIA EM COLUNA - folhas e plantas recolhidas no exterior - acetona - alumina - éter de petróleo - coluna de vidro PROCEDIMENTOS 1- CROMATOGRAFIA EM CAMADA FINA 1- Preparar uma câmara cromatográfica com a solução eluente. 2- Numa placa cromatográfica 4x8cm traçar a 2cm da base uma linha a lápis e colocar uma gota de cada um dos corantes e da mistura na linha. 3- Secar as gotas com um secador. 4- Colocar a placa na câmara e aguardar 10 min. 2- CROMATOGRAFIA EM COLUNA 1- Preparar um extracto de folhas com acetona e decantar. 2- Preparar uma mistura de alumina e éter de petróleo e encher a coluna de vidro. 3- Verter a mistura dos extractos e passar éter de petróleo pela mistura para a separação dos constituintes. RESULTADOS 1- CROMATOGRAFIA EM CAMADA FINA Distância percorrida pelo eluente 4,2 cm Distância percorrida pelo azul de metileno 0,9 cm Distância percorrida pelo alaranjado de metilo 3,2 cm Distância percorrida pela substância azul da mistura 0,9 cm Distância percorrida pela substância laranja da mistura 3,2 cm Rf azul metileno = 0,9 4,2 = 0,214 Rf alaranjado metilo = 3,2 4,2 = 0,761 Rf azul mistura = 0,9 3,2 4,2 = 0,214 Rf laranja mistura = 4,2 = 0,761

7 2- CROMATOGRAFIA EM COLUNA Ao introduzir os pigmentos na coluna já preparada em alumina, observou-se a saída de um pigmento alaranjado, o depósito de pigmentos esverdeados em baixo e o depósito de pigmentos acastanhados no topo da coluna. Estes últimos não desceram pela albumina. Ao observar os espectros dos pigmentos, verificou-se que o espectro dos pigmentos amarelados apresenta colorações na ordem dos amarelos e vermelhos e que o espectro dos pigmentos esverdeados apresentava colorações nos vermelhos, verdes e azuis. CONCLUSÕES 1- CROMATOGRAFIA EM CAMADA FINA Com este trabalho experimental pude verificar que com a cromatografia posso descobrir os componentes de uma mistura através da sua razão de retardação. Ao analisar os valores desta razão posso concluir que a mistura utilizada não é mais do que a mistura entre o azul de metileno e o alaranjado de metilo visto que coincidem exactamente com os destas substâncias. A mistura inicial apresentava uma cor azul e após a separação dos pigmentos verificou-se uma faixa azul e uma alaranjada; a primeira corresponde ao azul de metileno pois tem o mesmo Rf e a segunda corresponde ao alaranjado de metilo pela mesma razão. Ao fazer subir o eluente pelo suporte acima, verifiquei que os pigmentos eram arrastados por ele e devido às diferentes afinidades adsorventes, os pigmentos iguais eram arrastados com a mesma velocidade e os pigmentos diferentes eram arrastados com velocidades diferentes. Nesta cromatografia líquido sólido, a fase móvel é líquida, e a fase estacionária é sólida. 2- CROMATOGRAFIA EM COLUNA Os pigmentos vertidos na coluna foram arrastados pelo eluente, separando-se devido às suas diferentes afinidades adsorventes pelo suporte. Os pigmentos que saíram da coluna eram as xantofilas, amareladas; os pigmentos que se depositaram no meio da coluna eram as clorofilas, esverdeadas; e os que ficaram no topo eram os carotenos, acastanhados. Ao observar as xantofilas e os carotenos no espectroscópio, verifiquei que as clorofilas apresentam um espectro de riscas, onde aparecem cores na região dos vermelhos, verdes e azuis, que são as cores emitidas, tendo riscas pretas nas zonas dos amarelos e alaranjados, que são as cores absorvidas. É por isto que as clorofilas apresentam coloração esverdeada. O espectro das xantofilas apenas apresenta coloração nas zonas dos amarelos e dos vermelhos, que são emitidos e riscas pretas em todas as outras cores, que são absorvidas. É por esta razão que as xantofilas apresentam colorações amareladas. Só pude observar as clorofilas de um outro grupo pois saíram da coluna. Os carotenos não puderam ser observados pois não passaram do topo da coluna.

8 BIBLIOGRAFIA Internet, pesquisa clix técnicas química MENDONÇA, Lucinda Santos e RAMALHO, Marta Duarte, Jogo de Partículas, Texto Editora, Lisboa, 2000 GONÇALVES, Salomé e AMARAL, Carla, A vida ao microscópio Bloco II, Porto Editora, Porto, 2000 QUINTAS, Célia e BRAZ, Nídia Rebelo, No Laboratório Bloco II, Areal Editores, Lisboa, Maio 1995 SOARES, Rosa e ALMEIDA, Carla e SERRA, Lídia, Técnicas Laboratoriais de Biologia Bloco II, Porto Editora, Porto, 2000 SILVA, Amparo Dias da e outros, Terra, Universo de Vida 1ª parte, Biologia, Porto Editora, Porto, 2000

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