ELETROFORESE EM GEL. Características da Eletroforese em Gel Clássica

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1 ELETROFORESE EM GEL Características da Eletroforese em Gel Clássica J - analisa paralelamente várias amostras - aparelhagem simples e barata - alta capacidade de amostra L - análises demoradas (E 20V/cm) - quantificação pobre - baixa sensibilidade 1

2 INTRODUÇÃO Eletroforese: Define-se como o movimento de partículas carregadas eletricamente em um meio líquido elétrico, sob a influência de um campo elétrico. + Potencial -- - N N tampão Fluxo eletroforético tampão Ânodo (+) Cátodo (-) + Potencial -- - N N tampão Fluxo eletroforético tampão Ânodo (+) Cátodo (-) Eletrólitos: solução tampão usada no preenchimento da coluna capilar e meio no qual ocorre a separação; Eletrodos: instalados dentro dos reservatórios de tampão, fazem a conexão elétrica e aplicação do campo elétrico através da coluna; 2

3 + Potencial -- - N N tampão Fluxo eletroforético tampão Ânodo (+) Cátodo (-) Coluna capilar: tubo aberto de sílica fundida onde ocorre o processo de eletroforese; Amostra: mistura de analitos neutros e ionizados, com um variado grau de cargas e tamanhos; + Potencial -- - N N tampão Fluxo eletroforético tampão Ânodo (+) Cátodo (-) Separação: quando a amostra é introduzida em um lado da coluna, em especial no lado anódico, seus componentes migram com a aplicação do potencial. A direção e a velocidade de migração dependem da carga e do tamanho da molécula; 3

4 + Potencial -- - N N tampão Fluxo eletroforético tampão Ânodo (+) Cátodo (-) Fluxo eletrosmótico: fenômeno que acompanha a eletroforese e acarreta a migração do eletrólito e compostos neutros; Detecção: moléculas separadas são detectadas na extremidade oposta a injeção. O registro do detector é chamado eletroferograma. + Potencial -- - N N tampão Fluxo eletroforético tampão Ânodo (+) Cátodo (-) Ordem de migração: íons positivos migram para o cátodo; íons negativos migram para o ânodo; a razão de migração depende da razão carga/tamanho; a relação carga/ tamanho, a velocidade; 4

5 ELETROFORESE CAPILAR Mikkers (1979) - Demostrou que eletroforese em tubos de teflon com 200 µ m i.d., apresentava difusão reduzida em comparação ao sistema aberto. Jorgenson & Lukacs (1981) - Usaram tubos de 75 µm em pyrex, os quais mostraram resultados, melhores do que tubos mais largos. Devido à melhor dissipação de calor, altas voltagens puderam ser implementadas (30 kv) Modos de Operação: - Zona (CZE) - Isotacoforese (ITP) - Focalização Isoelétrica (IEF) - Eletrocinética Micelar(MEKC) - Eletroforese em Gel (CGE) - Eletrocromatografia (CEC) 5

6 Aplicações: - Íons Inorgânicos - Compostos Quirais - Compostos Hidrofóbicos - Peptídeos - Macromoléculas - Carboidratos - Poluentes Ambientais - Fármacos Íons Moléculas Peptídeos Proteínas Oligonucle otídeos DNA CZE MEKC CZE CZE CGE CGE ITP CZE ITP CGE MEKC MEKC CIEF CIEF ITP CGE 6

7 Sistema de Eletroforese Capilar Reservatório dos Tampões:- Cátodo - Ânodo Introdução da Amostra: - Voltagem - Diferença de pressão - Volumes reduzidos (µl-nl) Colunas Capilares: - Tubos de sílica fundida - Tubos com interior revestido cm µm 7

8 Controle de Temperatura: - Líquido - Ar Forçado Fonte de Alta Tensão: - 30 kv µa - 6W - Bi-polaridade Aquisição e Manipulação de Dados: - Análise Qualitativas - Análise Quantitativas - Impressão de Relatórios - Eletroferograma Detectores: - Absorciométricos - Eletroquímicos - Espectrométricos - on- e/ou off-column 8

9 Eletroferograma - Registro da Resposta do Detector x Tempo O eletroferograma é o registro temporal da separação eletroforética onde os componentes separados são detectados ao passarem pelo detector. Capillary Zone Electrophoresis s t 9

10 CZE s t CZE s t 10

11 CZE s t I - MOBILIDADE ELETROFORÉTICA DE UMA PARTÍCULA ELETRICAMENTE CARREGADA EM SOLUÇÃO A - Soluções Diluídas - Leis de Stokes 11

12 â n o d o + F d F e c á t o d o _ s o l u ç ã o e l e t r o l í t i c a à d i l u i ç ã o i n f i n i t a p a r t í c u l a e s f é r i c a c a r e g a d a p o s i t i v a m e n t e 1) Em campo elétrico homogêneo a partícula será acelerada pela força elétrica F e F e = Z i. e o. E Z i = número de cargas do componente i e o = carga elementar [ 1,602 x10-19 A.S =C ] E = força do campo elétrico [ V.cm -1 ] 12

13 2) Em um meio hidrodinâmico viscoso existirá uma força de arraste (ou friccional) F d exercida sobre as espécies i na proporção de suas velocidades v io. F d = κ.η.v i o κ = constante [cm] η = viscosidade newtoniana da solução [P a.s] v i o = velocidade de migração do componente i [cm.s-1 ] 3) De acordo com a lei de Stokes, κ = 6πr para uma partícula esférica. Para partículas não esféricas o valor numérico é < 6. 4) No momento da aplicação do campo elétrico e a força de aceleração F e será contrabalanceada pela força de arraste F d e as partículas i migrarão com velocidade v i o constante. 13

14 F d = F e 6π r i.η.v i o = Z i.e o.e v i o = Z i e o 6πηr i E 5) Visto que a velocidade de migração v o i é proporcional ao campo elétrico E, o fator de proporcionalidade é chamado mobilidade eletroforética absoluta µ io. µ o i = v E o i = Zi e 6πηr o i [cm 2.V -1.s -1 ] 14

15 B - Soluções Reais - Lei de Debye, Hückel e Onsager (DHO) F r e t â n o d o + F d F e c á t o d o _ a t m o s f é r i c a i ô n i c a F r e l p a r t í c u l a c a r r e g a d a F e = Força Elétrica F d = Força Arraste F rel = Força Relaxamento F ret = Força de Retardo 1) De acordo com D.H.O., um íon em solução estará sempre rodeado por íon de carga oposta. 2) A presença da atmosfera iônica de carga oposta acarreta a ação de duas forças adicionais, F ret e F rel, que diminuirão a velocidade do íon. 3) A força de retardo (F ret ) é causada pelo movimento, em direção oposta, dos contra-íons. Como resultado a força friccional é maior e há um decréscimo na modalidade do íon central. 15

16 4) A movimentação do íon central deformam a atmosfera iônica, alterando a densidade relativa de cargas. Isto é, a densidade da atmosfera iônica será levemente menor na parte anterior do íon central do que na parte posterior (à direção do movimento). 5) Atrações coulômbicas entre as duas partes do íon desaceleram o mesmo na proporção da força de relaxamento Frel. 6) O ajuste pode ser feito substituindo-se a carga absoluta do íon pelo seu valor efetivo (D.H.O.), o qual leva em consideração os contra-íons e o raio da atmosfera iônica. µ i = Q ef 6πηR µ i = mobilidade eletroforética efetiva [cm 2.s -1.V -1 ] Q ref = carga efetiva do íon [ C ] R = raio total do íon [cm] A mobilidade efetiva será sempre menor que a mobilidade absoluta devido às interações iônicas 16

17 II - Mobilidade Eletroforética - Raio - Solvatação - Forma - Viscosidade - Carga Íon - Constante dielétrica Meio - Grau de - Força iônica dissociação - Temperatura - ph carga µα volume(tamanho) A. Determinação da Mobilidade Eletroforética Efetiva - O cálculo da mobilidade eletroforética pelas equações descritas é muito difícil. - Em termos práticos, pode-se calcular diretamente pelo registro da separação eletroforética 17

18 L D d e t e c t o r â n o d o v e o v - - v a p - v + v a p c á t o d o L T T µ i [ cm 2.V -1.s -1 ] ν i ν i L = = E V L T = distância entre eletrodos [ cm ] V = voltagem aplicada [ V ] 18

19 Electrophoretic Mobility F A velocidade aparente do componente i (V i(ap) ) é dado por: v i = vi( ap) v eo = L t D i L t D eo [cm.s -1 ] L D = comprimento da coluna até o ponto de detecção [cm] t i = tempo de migração do soluto i [s] t eo = tempo de migração do fluxo eletroosmótico [s] v i(ap) = velocidade aparente do soluto i [cm.s -1 ] v eo = velocidade de fluxo eletroosmótico 19

20 1. cloreto de benziltrimetilamônio (1+) 2. álcool benzílico (0) 3. salicilato de acetila (1-) 4. 4-hidroxibenzoato (1-) 5. benzoato (1-) F Na ausência de fluxo eletrosmótico, a mobilidade pode ser calculada por: i = ν = E LD L t V T µ i [ cm 2. V -1.s -1 ] i L D = comprimento da coluna até o ponto de detecção [cm] L T = comprimento total da coluna (distância entre os eletrodos) [cm] t i = tempo de migração do soluto i [s] E = intensidade do campo elétrico [V.cm -1 ] V = voltagem aplicada entre os eletrodos [V] 20

21 B. Eletrosmose e Fluxo Eletrosmótico (EOF) Eletrosmose ou eletroendosmose é o fenômeno básico que acompanha todo processo eletroforético Dentro de um tubo de sílica fundida a eletrosmose provocará o aparecimento de um fluxo dentro da coluna O fluxo origina-se da ionização dos grupos silanóis na superfície da coluna (ácidos fracos - pk a ~ 3) Para medir o fluxo eletrosmótico é necessário um marcador neutro (substância visível pelo detector porém não iônica) ν EOF = L t m 21

22 Camada fixa - cátions fortemente atraídos pelos grupos silanóis são imóveis Camada móvel - formada pela dupla camada difusa, é atraída eletroforeticamente ao cátodo Entre as duas camadas - plano de cisalhamento Potencial Zeta (ζ): diferença de potencial químico criado pelo desbalanceamento elétrico através do plano de cisalhamento. 22

23 F Note que a µ eo depende somente das características do tampão e independente do campo elétrico aplicado ph: a superfície da sílica comporta-se como um ácido fraco e aumenta a dissociação com o aumento do ph 23

24 F o ph também influencia a ionização dos solutos além de afetar µ eo, afeta µ i Electroosmotic Flow (EOF) 24

25 25

26 C. Perfil do Fluxo Eletrosmótico Em todo sistema com fluxos existirá um perfil de velocidade através da área seccional do tubo Sistemas hidrodinâmicos As setas indicam o vetor de velocidade ao longo do eixo radial e são decorrentes da ação friccional entre as diversas camadas. O gradiente de velocidade vai de zero, próximo a parede do tubo, à máxima velocidade no centro do tubo. Sistemas eletrodinâmicos Em sistemas movidos por eletrosmose, a camada próxima à parede também é imóvel, porém o gradiente de velocidade se prolonga somente até a dupla camada. Como não existe diferença de pressão, não há formação de gradiente de velocidade através do tubo capilar. 26

27 Voltagem aplicada: Aumentando-se E aumenta-se o fluxo eletroosmótico e diminui-se o tempo de análise. Voltagens excessivas levam a altas correntes e aquecimento por efeito Joule. Potência gerada- P = V.I [ W ] 27

28 Aplicação de Altas Voltagens: - altas correntes alta produção de calor aumenta gradiente de T dentro do capilar muda a viscosidade da solução e aumenta o fluxo degenera a separação separações não reprodutíveis decomposição ou desnaturação da amostra fervura do solvente e formação de bolhas causando descontinuidade elétrica interrupção da análise F De acordo com a Lei de Ohm: V = I.R I [A] I = Intensidade de corrente elétrica [A] R = Resistência elétrica [Ω] L = V max 1/R D.I. = V max Vmax potencial aplicado[v] 28

29 D. Outros fatores que afetam o EOF Temperatura: Viscosidade Fluxo Cte. dielétrica Fluxo Solventes orgânicos: - difícil previsão do efeito - viscosidade - cte. dielétrica - potencial zeta - concentração do solvente Modificação química do capilar: - reduzido EOF - eliminado - revertido - controlado Recursos: - recobrimento dinâmico - recobrimento estático - modificadores - voltagem radial 29

30 RESUMO - aumento da voltagem aumenta o EOF - aumento do ph do tampão aumenta o EOF - aumento da concentração e da força iônica do tampão diminuem o EOF - adicionando-se solvente orgânico pode-se tanto aumentar como diminuir o EOF - modificando-se a parede do capilar pode-se reduzir, eliminar ou reverter o EOF III. Parâmetros de Separação A. Formato da Banda Eletroforética t = 0 injeção perfil de concentração h = C o t 1 > 0 h = C x,t w 1 t 2 > t 1 h = C x,t w 2 30

31 F Fator mais importante: difusão molecular no meio de separação C x,t = κ 2(D i π t) 1 2 (x v i t) 2 4D e i t C = concentração do soluto na distância x do ponto inicial após tempo t [mol.l -1 ] v i = velocidade do soluto [cm.s -1 ] D i = coeficiente de difusão [cm 2.s -1 ] A banda eletroforética pode ser descrita com uma curva gaussiana após o soluto ter migrado à distância x a partir da origem, no tempo t. do pico gaussiano: - posição de máximo (α Co) - largura do pico (α t, D i ) = distância entre os pontos de inflexão (2 2 D i t)

32 Similarmente aos cálculos estatísticos, a largura de uma curva gaussiana é definida como desvio padrão, σ σ = (2D i t) 1/2 [cm] Por definição, o quadrado do desvio padrão é chamado variância, σ 2 σ 2 = 2D i t [cm 2 ] Lembrando que: t i = L v D i LDLt = µ V ap LD = µ E ap L D = distância da origem até o ponto de detecção [cm] L T = comprimento total da coluna [cm] 2 2Di LD σ = ( µ E) ap 32

33 B. Resolução das Bandas Eletroforéticas e Eficiência da Separação A resolução R s mede o grau de separação entre dois compostos Δx w 1/2 σ 1 w b = 4σ 1 2σ 2 R s = 2( x w 1 x + w 2 1) 2 = Δx w X i = distância de migração [cm, s] w i = largura do pico na linha de base [cm, s] w = para picos próximos w 1 w 2 33

34 Para uma curva gaussiana, a largura do pico na base é: Δx w = 4σ R s = 4σ Resolução pode ser redefinida considerando-se: 1 x = v t e 2 i i i R s = Δµ apet 4(2Dit) 1 2 σ = ( 2 t) Δµ ap = diferença na mobilidade eletroforética aparente D i = difusão média D i A variância total de um processo é a somatória de todas as variâncias individuais. σ 2 tot = Σ σ i 2 A medida da eficiência de separação é calculada pelo número de pratos N 2 L = σ 2 Substituindo-se tot L e σ, 2 ( µ E) t N = 2D t i 2 34

35 Comparando as expressões de R s e N R s 1 Δµ = 4 µ ap N 1 2 = N 4 Δµ µ ap ap = R s R s = eficiência seletividade 35

36 Experimentalmente: N t = 16 w 2 e Δt R s = w N não é representativo como em cromatografia, entretanto: HETP = L N = 2 σ tot L HETP F Representa a fração do capilar tomada pelo analito e expressa melhor o índice de eficiência de separação. A variância total de um processo é igual a soma das variâncias parciais: σ tot = σ D + σ t + σ i + σ D σ i ad 36

37 Resumo sobre os parâmetros de separação - Tempo de análise: α 1/V; α L - Eficiência: α V - Seletividade: otimizado pelo ph e composição do meio - Resolução: α V, ph e tampão, L, EOF IV- Fatores que Influenciam a Performance 1. Efeitos dispersivos fundamentais A dispersão total do sistema é a medida de eficiência Difusão Adsorção Efeito Joule Dispersão eletroforética Injeção Detecção Outros 37

38 Efeito Joule: - A passagem de corrente pelo capilar aquece o meio P = U.I = R.I 2 P= Potência [W]; U = Potencial [V] I = Corrente [A]; R = Resistência [Ω] - A temperatura interna pode ser calculada relacionando-se através de uma relação com a viscosidade (µ eo 1/η) µ eo = C e EA RT - Medindo-se µ eo em duas voltagens (uma baixa e outra mais elevada), é possível calcular a temperatura µ µ EA EA + eo1 RT RT eo 2 = e Para uma solução aquosa a temperatura ambiente E A /R = 1820 K. Se T 1 = 289 K: 1 2 T 2 = ln( µ eo ) ln( µ eo 2 ) + 6,11 38

39 A dissipação do calor ocorre através das paredes e depende do meio que circunda a coluna. 39

40 Recomendações gerais: - A temperatura deve ser controlada µm de diâmetro representa um bom compromisso em relação aos efeitos térmicos e adsortivos, assim como à detecção - [amostra] 1% [tampão]; µ s µ b ; R s < R b - tamanho da injeção deve ser mínimo - condutância específica e força iônica do tampão devem ser as menores possíveis. B. Parâmetros Operacionais: Força do campo elétrico: Como observado previamente, o campo elétrico pode exercer o papel de mocinho e bandido! E Eficiência Resolução Tempo de Análise Efeito Joule Dispersão Gradiente de Temperatura J L 40

41 Temperatura Normalmente utilizado em cromatografia a gás e a líquido para melhorar e resolver problemas de eluição Em eletroforese, está associado com perda de desempenho Vários parâmetros são afetados pela temperatura: viscosidade ph dissociação EOF velocidade de reação 41

42 C) Sistema Eletrolítico: Tampões: não devem interferir na separação alta capacidade tamponante sobre uma extensa faixa de ph não devem diminuir a sensibilidade do detector mobilidade eletroforética similar à da amostra mobilidade eletroforética do contra-íon deve ser a menor possível 42

43 ph: parâmetro mais importante para controle da seletividade pode alterar a carga, tamanho e EOF A relação entre as concentrações de espécies ionizadas e não ionizadas é dada pela equação de Henderson-Hasselbalch. ph = pk a [ A ] + log [ HA ] Quando ph = pk a, [A - ]/[HA] = 1 50/50 Para substâncias anfotéricas negativa - neutra - positiva 43

44 Força Iônica: Como já visto, a força iônica I, afeta diretamente a mobilidade das espécies, por conseqüência, a resolução também será afetada. Sistema Genérico V - Instrumentação 44

45 A) Injeção ou Introdução da Amostra Diferença de pressão Voltagem Injeção Hidrodinâmica (Diferença de Pressão) pressão: positiva ou negativa gravidade Injeção hidrodinâmica com pressão positiva V i 4 ΔP r π t 8η L = (Poiseulle) T V i = volume injetado [m 3 = nl] ΔP = diferença de pressão entre as extremidades [Pa] r = raio da coluna [m] t = tempo de injeção [s] η = viscosidade [Pa.s = 10 3 cp] L T = comprimento total do capilar [ m] 45

46 Injeção Hidrodinâmica com Pressão Negativa 46

47 Injeção Hidrodinâmica por Gravidade (Sifonagem) ΔP = ρ gδh ΔP - Diferença de pressão entre as extremidades [Pa] ρ - Densidade da solução da amostra [Kg.m -3 ] g - Aceleração da gravidade [ N.Kg -1 ] Δh - Diferença de altura entre o nível dos líquidos [m] A injeção hidrodinâmica é razoavelmente reprodutível e pouco discriminatória e por isso bastante indicada para análises quantitativas. A reprodutibilidade dependerá da temperatura da amostra (viscosidade). 47

48 Injeção Eletrocinética Q i = ( µ + µ ) π r i i o L T 2 V c t i Q i = Quantidade de soluto i introduzido no capilar [M] V = Voltagem [V] C i = concentração [M] L T = comprimento total da coluna [m] Discriminação da amostra em introdução eletrocinética é inevitável, uma vez que a quantidade injetada depende da mobilidade iônica e eletroosmótica. Sempre haverá discriminação com relação às espécies mais lentas. 48

49 B) Sistemas de Detecção - Detectores Requerimentos do Sistema Volume da cela de detecção pequeno Pequena (mínima) contribuição para o alargamento do pico Faixa dinâmica de resposta ampla Fator de resposta rápido Inerte à mudança de T Uso confiável e conveniente Detecção tanto seletiva quanto universal Em resumo: Quase impossível encontrar um sistema com todos os requisitos. 49

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51 1- Ultravioleta / Visível (UV/Vis) - Absorbância A transmitância de um sistema ótico é dado pela razão entre a intensidade de luz emergente e luz incidente. T = I EM / I IN - Segundo a Lei de Lambert-Beer 1 log T = A = ε b c A = Absorbância da amostra [u.a.] ε = Absortividade molar [L.mol -1.cm -1 ] b = Caminho ótico [cm] C = Concentração [M] 51

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53 Alternativas para Aumentar o Caminho Ótico Cela em Z 2- Detecção por Fluorescência Seletivo e mais sensível do que o detector de absorção devido à redução do sinal de fundo. F O comprimento de onda da excitação e emissão dependem da natureza do analito 53

54 Fluorescência com Resolução Espectral 3- Espectrometria de Massas Características: - relativamente sensível - universal - altamente seletivo - informação qualitativa e quantidade Interfaces: - fluxo axial - junção líquida Electrospray - sem fluxo líquido 54

55 55

56 Outros Métodos de Detecção: Detectores Eletroquímicos: - potenciométrico - amperométrico - condutimétrico Detecção Indireta: - pode ser usado com detector universal - absorbância UV/vis, fluorescência, amperometria 56

57 C - Coluna Capilares A alma de cada sistema eletroforético - feita de sílica fundida, possui alta resistência mecânica, química, transparência no UV, disponibilidade de uma variedade de diâmetros interno e externo, alta condutividade térmica. Preparo básico de uma coluna capilar Corte um pedaço da coluna riscando a camada de poliimida com um cortador de vidro. Cuidadosamente dobre a coluna. Meça e corte outro pedaço de tamanho desejado de coluna. Remova alguns milímetros de poliimida de cada ponta (mini-tocha ou lâmina). Meça o comprimento efetivo da coluna (LD) e remova a poliimida, fazendo uma janela. Limpe a janela com acetona/metanol. Instale a coluna cuidadosamente no cartucho apropriado de cada instrumento. Faça uma lavagem com 1 M NaOH (10 min), depois com 0,01 M NaOH (30 min) e finalmente com tampão de separação (30 min). Sistema está pronto para uso. 57

58 Para operação em phs ácidos, a estabilização é mais exigente. Para utilização na faixa de ph 3-7 recomendase antes de cada análise: lavar com 0,1 M NaOH (5 min.) lavar com água bidestilada (2 min.) lavar com tampão de análise (10 min.) Para a armazenagem da coluna: lavar o capilar com água bidestilada secar o capilar com ar ou nitrogênio (2 min) retire o capilar Uso e preparo de colunas com interior recoberto Objetivos: evitar a adsorção de analitos - minimizar as interações soluto-parede; estabilização/eliminação do EOF sobre ampla faixa de ph; reprodutibilidade no preparo; estável por longos períodos e grande numero de corridas. Implicações eliminação do fluxo eletrosmótico; cátions analisados com polaridade normal neutros não migrarão e ânions serão eliminados da coluna 58

59 odot odot ác ác ânodo EOF µc cátions neutros ânions µa ânodo EOF = zero neutros µc cátions 59

60 ác ânions analisados com polaridade reversa: neutros não migrarão e cátions serão eliminados odot neutros µa EOF = zero ânions ânodo Inversão de fluxo eletrosmótico: 60

61 odot ác EOF ânodo µa ânions neutros cátions µc 61

62 Tipos de Recobrimento recobrimento covalente recobrimento dinâmico a) Filme polimérico covalente: mudança estrutural da superfície da sílica. Modificação da superfície com poliacrilamidas ligação via siloxano: baseia-se no uso do composto bifuncional (Hjerten, 1985) 62

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64 VI - MODOS DE OPERAÇÃO EM CE Métodos em Solução Métodos em Meio Polimérico Métodos Cromatográficos Métodos em Solução Eletroforese Capilar de Zona (CZE) Isotacoforese Capilar (CITP) Focalização Isoelétrica Capilar (CIEF) 64

65 A) Eletroforese Capilar de Zona (CZE) - Também descrito como eletroforese em solução (FSCE) T = 0 E = 0 T 1 > 0 E > 0 T 2 > T 1 E > 0 B) Isotacoforese Capilar (CITP) - Seletividade baseada na mobilidade de cada espécie - Separação efetuada a velocidade constante T = 0 E = 0 TB LB T 1 > 0 E > 0 TB LB T 2 > T 1 E > 0 TB LB 65

66 condutividade tempo C) Focalização Isoelétrica Capilar (CIEF) - Separação efetuada de acordo com o valor de ponto isoelétrico de (pi) de cada proteína - Seletividade baseada no gradiente de ph imposto T = 0 E = 0 T 1 > 0 E > 0 T 2 > T 1 E > 0 P > 0 66

67 67

68 Métodos em Meio Polimérico Eletroforese Capilar com Gel (CGE) Eletroforese Capilar com Polímeros Enovelados (CEPS) T = 0 E = 0 T1 > 0 E > 0 T2 > T1 E > 0 68

69 A) Eletroforese Capilar com Gel (CGE) Aplicação à classe de compostos que apresentam mesma razão q/m. Proteínas desnaturadas com SDS (SDS-PAGE) DNA - O O - O O O P O O P O - O O N N O N NH 2 O P O N O O N H H N N O N NH 2 N O N H N O N NH 2 Mecanismo de Separação em CZE µdna α q/m q/m = cte sem separação Mecanismo de Separação em CGE µdna α 1/m HO 69

70 Seletividade em CGE logu = logu K T ep 0 R 0, ,00010 mobility (cm 2 /sv) 0, , , Base Number Eletroforese Capilar com Gel (CGE) Aplicação à classe de compostos que apresentam mesma razão q/m. DNA Proteínas desnaturadas com SDS Seletividade baseada no tamanho molecular dos compostos Ordem de migração proporcional ao tamanho 70

71 B) Eletroforese Capilar com Soluções Poliméricas (CEPS) Mesmos mecanismos que CGE Grande vantagem de poder renovar toda a matriz de separação Grande longevidade da coluna (>200 corridas) Existência do Limiar de Novelamento (C*) Dinâmica de Enovelamento do Polímero e da Formação do Poro em Função da Concentração do Polímero A) C < C*; representação de uma solução diluída C* B) C C*, limiar de enovelamento ξ C) C > C*, solução enovelada com tamanho médio do poro (ξ) mensurável 71

72 Seletividade em CEPS log u [cm 2 V -1 s -1 ] A) B) C) base number Métodos Cromatográficos Cromatografia Eletrocinética Micelar (MEKC) Eletrocromatografia Capilar (CEC) 72

73 A) Cromatografia Eletrocinética Micelar (MEKC) Introduzida em 1984 por Terabe, foi um dos grandes avanços da eletroforese capilar. Permite a separação e análise de compostos neutros e hidrofóbicos por um processo verdadeiramente cromatográfico. Micela: Surfactantes em soluções diluídas, agem como surfactantes, em soluções concentradas acima de um certo valor crítico (cmc) os surfactantes se ordenam em micelas. Concentração Micelar Crítica (cmc): Valor Característico de cada surfactante para se agregar na micela Para SDS, cmc ~ 8 mm 73

74 Detergente CMC # molec. [mm] Aniônicos Ác. Cólico Ác. Glicólico 13 2 Sulfato sódico de dodecila 8 62 Catiônicos Cloreto de cetiltrimetil 1 71 amônio Brometo dodeciltrimetil amônio Zwiteriônicos CHAPS 8 10 CHPSO 8 11 Não-Iônicos n-decil- β -D- 2,2 glucopiranosídeo Triton X-100 0,

75 Partição: O soluto, na maioria dos casos, neutros, particionará entre a solução aquosa e o interior hidrofóbico do micela Processo Geral de Separação: SDS é adicionado ao tampão (6 < ph <10) acima de sua CMC. A micela migra em direção oposta ao EOF. Os solutos, particionados entre o tampão e a micela, migrarão na mesmo proporção do particionamento 75

76 Tipicamente: µ eo = cm 2.V -1.s -1 µ mc = cm 2.V -1.s -1 µ ap = cm 2.V -1.s -1 Se: E = 300 V cm -1 e L = 50 cm, a janela de migração abrangeria de t o = 5,6 min a t mc = 28 min. Ordem de Eluição Compostos altamente hidrofílicos: t i = t eo Compostos altamente hidrofóbicos: t i = t mc Compostos intermediários: t eo < t i < t mc 76

77 Parâmetros de Retenção em MEKC A) Fator de Capacidade: A migração/retenção de um composto neutro será dada pelo fator de capacidade k nmc no. molesde solutona micela k' = = n no. molesde solutona faseaquosa aq Experimentalmente: k' = t eo 0 < k'< ti (1 t t i eo t mc ) Uso de modificadores orgânicos: Reduz particionamento Reduz interações hidrofóbicas Aumenta a solubilidade de compostos hidrofóbicos Modificadores: Metanol Acetonitrila Isopropanol Ciclodextrina (cavidade hidrofóbica) 77

78 B) Eficiência: Em condições normais, N > , somente limitado pela difusão Em condições menos ideais, efeito Joule pode contribuir para o alargamento da banda. A cinética de transferência de massa micela/solução pode diminuir a eficiência Interações iônicas C) Seletividade (α): Mede a afinidade relativa de dois solutos pela micela. α = k k ' 2 ' 1 Fatores que afetam a seletividade: Surfactantes: a cadeia alifática o núcleo polar interações diferenciadas com compostos ionizáveis 78

79 Fatores que afetam a seletividade: ph : muito importante em CE, é normalmente imprevisível em MEKC - ph 6,0 p/ obter EOF estável ionização dos analitos Tipo de Tampão: caso típico p/ borato um complexo aniônico particiona menos do que um soluto não complexado. Temperatura: grande efeito: solubilidade equilíbrio cinética D) Resolução: R s = N 4 teo 1 ' α 1 k 2 tmc ' α k teo 1+ k tmc ' 1 eficiência seletividade capacidade janela de retenção 79

80 B) Eletrocromatografia Capilar (CEC) Colunas capilares de CE preenchidas com fases de HPLC Fluxo movido por EOF e não bombas de pressão Uso de fases móveis de HPLC tamponadas Mecanismo de separação primariamente cromatográfico (fase reversa) Vantagens da CEC Separação de compostos similares Instrumentação única CE e CEC Separação de compostos neutros e hidrofóbicos Compatibilidade com MS N > HPLC; α melhor que em CE Baixo consumo de solventes 80

81 Origem do EOF em CEC Parede do tubo de sílica fundida Superfície das partículas de sílica u e ε0ε rrt σ 2 2cF = η 1/ 2 E Dispersão em CEC Perfil plano de fluxo 81

82 82