Universidade Federal de Juiz de Fora Instituto de Ciências Exatas Departamento de Química
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- Alexandra Sales Terra
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1 Prática 5. ELETROFORESE CAPILAR Determinação de acidez livre em óleos vegetais 1. Introdução A acidez em óleos vegetais é devido à reação de hidrólise de triacilglicerídeos, onde ácidos graxos livres são formados. 1 O teor de ácidos graxos livres é um dos mais importantes parâmetros no controle de qualidade de óleos vegetais, em especial, os azeites de oliva. 2, 3 Os ácidos graxos dividem-se em dois grupos: saturados (não possuem duplas ligações) e insaturados (com uma ou duas ligações duplas em sua estrutura molecular), sendo esses últimos predominantes nos óleos vegetais. 4 Tabela 1. Composição de alguns ácidos graxos em óleos vegetais. Percentual de Ácidos Graxos Gorduras Mirístico Palmítico Esteárico Oleico Linoleico Linolênico azeite de oliva , < 0,9 óleo de soja O método oficial para a determinação de acidez em azeites de oliva é a titulação volumétrica alcalina a frio, que consiste na dissolução da amostra em uma mistura de dietil-éter (ou tolueno) e álcool etílico, na proporção de 1:1 v/v, utilizando-se hidróxido de sódio como titulante e fenolftaleína, como indicador. 5 Alternativamente, a técnica de eletroforese capilar tem se mostrado adequada para a quantificação de ácidos graxos majoritários comumente encontrados nos óleos vegetais tais como o palmítico, oleico e linoleico, permitindo que, além de se determinar o teor de acidez, possa-se identificar individualmente cada ácido graxo, o que favorece a identificação de fraudes e o perfil dos ácidos graxos (AG) envolvidos no processo oxidativo de alimentos Objetivos
2 Familiarização com a técnica de eletroforese capilar; Determinação dos ácidos graxos livres majoritários e da acidez livre em amostras de azeite de oliva extravirgem e comparar com o perfil em óleo de soja, Comparação entre os resultados obtidos por eletroforese capilar e os obtidos com a metodologia oficial (titulação volumétrica). 3. Metodologia As análises serão realizadas em um equipamento de eletroforese capilar modelo Agilent CE 7100 equipado com detector UV/Vis de arranjo de diodos. Para fins de comparação, serão realizadas análises por titulação volumétrica segundo o método oficial das Normas Analíticas do Instituto Adolfo Lutz Materiais e Reagentes Banho-maria, banho de ultrassom e balança analítica; balões volumétricos de 5,0 e 10,0 ml; erlenmeyers de 125 ml; bureta de 50 ml; pipeta de Pasteur; micropipetas e ponteiras; capilar de sílica fundida com revestimento externo de fluoropolímero (TSH); vials para equipamento de eletroforese; padrões de ácido palmítico (C16:0), oleico (C18:1), linoleico (C18:2) e tridecanoico (C13:0); solução tampão NaH2PO4/Na2HPO4 (ph ~ 6,86); dodecilbenzeno sulfonato de sódio (SDBS); polioxietileno lauril éter (Brij L23); acetonitrila (ACN); 1-octanol; etanol; tolueno; hidróxido de sódio 0,1 mol/l (padronizado); hidróxido de sódio 1,0 mol/l; fenolftaleína 1%; água deionizada Procedimento Extração dos ácidos graxos na amostra: Aqueça a 60ºC, em banho-maria, cerca de 50 ml de etanol, controlando a temperatura com um termômetro; Pese 0,75 g de azeite extravirgem (em triplicatas autênticas) e 1,50 g de óleo de soja, em balões volumétricos de 5,0 ml. Adicione o padrão interno (ácido tridecanoico) nos balões para uma concentração final de 0,5 mmol/l; Complete o volume dos balões com o etanol aquecido, agite em vórtex por 1 min e espere esfriar;
3 Espere a separação de fases se completar ; Transfira uma alíquota da fase etanólica (superior) para os vials de análise. Identificação dos picos de cada analito: Para identificação dos picos durante as análises, prepare 3 vials, cada um contendo 0,01 ml de um dos 3 padrões de ácidos graxos, palmítico, oleico e linoleico, além de 0,5 ml da fase etanólica de qualquer uma das amostras preparadas anteriormente (observar o aumento do pico). Preparo do eletrólito de corrida: A partir das soluções estoques, prepare, em um balão de 10 ml, o eletrólito com a seguinte composição: 15 mmol/l de solução tampão NaH2PO4/Na2HPO4 (ph ~ 6,86); 4,0 mmol/l de SDBS; 8,3 mmol/l de Brij L23; 45% v/v de ACN; 2,1% v/v de 1-octanol; Completar o volume com água deionizada; Deixar em banho de ultrassom por 10 minutos para degaseificação; Transferir o eletrólito para 3 vials. Parâmetros instrumentais: Dimensões do capilar: 48,5 cm de comprimento total (40 cm efetivos até o detector), 75 µm de diâmetro interno e 375 µm de diâmetro externo; Temperatura no cartucho do capilar: 25ºC; Comprimento de onda de detecção: 224 nm (detecção indireta); Injeção da amostra: 12 mbar por 4 s. Voltagem: + 19 kv. Obs.: Antes do primeiro uso, os capilares devem ser condicionados através de flush com NaOH 1,0 mol/l (40 min), água deionizada (15 min) e solução do eletrólito (15 min). Entre as corridas, condicionamento com NaOH 1,0 mol/l (2 min), água deionizada (2
4 min) e solução de eletrólito (2 min). Para isso, prepare um vial com NaOH 1,0 mol/l e outro com água e mais dois vials vazios que servirão como descarte. Cálculos e resultados: Nos eletroferogramas, integre os picos referentes aos ácidos graxos palmítico, oleico e linoleico e do padrão interno ácido tridecanoico, obtendo as áreas; Tabela 2. Áreas dos analitos Ácido graxo Área réplica 1 Área réplica 2 Área réplica 3 Tridecanoico (C13:0) Palmítico (C16:0) Oleico (C18:1) Linoleico (C18:2) A concentração de cada ácido nos vials pode ser calculada utilizando a equação: onde [AG] é a concentração do ácido graxo e AAG é a área encontrada para o ácido graxo correspondente, [PI] é a concentração do padrão interno e API é a área encontrada para o padrão interno, e Fr é um fator de resposta previamente obtido através de curvas analíticas utilizando as mesmas condições de análise. Os fatores de resposta para cada um dos 3 ácidos podem ser encontrados na referência [2].
5 Tabela 3. Concentrações dos analitos Ácido graxo Fator de resposta (Fr) [AG] mol/l réplica 1 [AG] mol/l réplica 2 [AG] mol/l réplica 3 Palmítico (C16:0) 0,622 Oleico (C18:1) 0,526 Linoleico (C18:1) 0,604 A acidez deve ser expressa em porcentagem (% m/m) de ácido oleico, levando-se em consideração a massa pesada e a diluição feita no preparo da amostra. Titulação volumétrica (apenas para o azeite extravirgem) Pese 1,75 g de azeite extravirgem em um erlenmeyer de 125 ml (em triplicata); Adicione 25 ml de uma mistura etanol/tolueno 1:1 v/v ao erlenmeyer; Adicione também o indicador fenolftaleína (2 a 3 gotas) ao erlenmeyer; Prepare uma bureta de 25 ml com solução de NaOH ~ 0,1 mol/l padronizada; Titule a amostra até o aparecimento de coloração rosa que perdure por 30 s. Para os cálculos da titulação, utilize a equação: % acidez em ácido oleico = V NaOH. [NaOH]. 8,945 m a onde VNaOH é o volume gasto na titulação (em ml); [NaOH] é a concentração do titulante (em mol/l); ma é a massa de amostra utilizada (em g); e 8,945 é um fator de correção para o ácido oleico.
6 Tabela 4. Percentual de acidez, por titulação volumétrica. Réplica Massa de amostra (g) VNaOH (ml) % acidez (ác. oleico) Questões para o relatório Qual a função do SDBS na composição do eletrólito de corrida? E a função do tampão? Calcule a concentração de cada ácido graxo e a acidez livre dos óleos vegetais analisados e expresse este resultado em porcentagem de ácido oleico. Compare os resultados obtidos por eletroforese capilar com os obtidos por titulação volumétrica usando a abordagem estatística adequada e dizendo se os métodos diferem entre si em um intervalo de 95% de confiança. Discuta possíveis vantagens e desvantagens entre os dois métodos. Pesquise na literatura os valores permitidos de acidez para o azeite extravirgem e discuta se os valores obtidos experimentalmente estão de acordo com a legislação. Explique se seria possível identificar algum tipo de fraude no azeite por eletroforese capilar. 5. Referências 1. OSAWA, C. C.; GONÇALVES, L. A. G.; RAGAZZI, S., Potentiometric titration applied to free fatty acid determination of edible oils and fats. Quim Nova, 2006, 29, SATO, R. T. et al. Rapid Separation of Free Fatty Acids in Vegetable Oils by Capillary Zone Electrophoresis. Phytochem Analysis, 2014, 25, BALESTEROS, M. R. et al. Determination of olive oil acidity by CE. Electrophoresis, 2007, 28, DE OLIVEIRA, M. A. L. et al. 20 years of fatty acid analysis by capillary electrophoresis. Molecules, 2014, 19, INSTITUTO ADOLFO LUTZ. Normas analíticas do Instituto Adolfo Lutz:: Métodos Químicos e Físicos para Análise de Alimentos, 3. ed. São Paulo: IMESP, 1985, p
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