MEDOTOLOGIA ANALÍTICA

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1 QUI102 MEDOTOLOGIA ANALÍTICA Apostila de Experimentos Juiz de Fora - MG II semestre

2 Cronograma Semana Data (Quarta-feira) 1 08-Aug Aula (Introdução) Atividades h h 2 15-Aug Aula (Amostragem e tratamento de amostras) 3 22-Aug Aula (Amostragem e tratamento de amostras) 4 29-Aug Aula (Amostragem e tratamento de amostras) 5 05-Sep P01 (Fotometria) Colóquios das práticas: P02, P03 e P Sep Prática P03 (EAM -Vis) 7 19-Sep Encontro Nacional de Química Analítica (Não haverá aula)* 8 26-Sep Ciclo de Práticas: P04 (HPLC) 9 03-Oct Ciclo de Práticas: P05 (EAA) Oct Ciclo de Práticas: P06 (EC) Oct Semana da Química (Não haverá aula) Oct 1ªApresentação: Proposta do projeto Oct Projetos - execução Nov Projetos - execução Nov Projetos - execução Nov Projetos - execução Nov 2ª Apresentação: Projeto - Resultados Dec Entrega do Relatório final do Projeto Aulas práticas P01 P02 P03 P04 Prática/Local Fotometria de Chama (EEC) Lab. Analítica Espectrometria UV/Vis (EAM) Lab. Analítica Espectrometria de Absorção Atômica (EAA) Lab. Analítica e Lab. Central analítica Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (HPLC) Lab. NUPIS/Lab Física Professor Estágio Docência: M.a Paola Coutinho Tutora: Fernanda Cerqueira Profa. Dra. Maria. Auxiliadora Est.Doc: M.a Paola Coutinho/Tutora: Fernanda Cerqueira Profa. Dra. Maria. Auxiliadora Est.Doc: M.a Paola Coutinho/Tutora: Fernanda Cerqueira Profa. Dra. Ma. Auxiliadora Tutora: Fernanda Cerqueira P05 Eletroforese capilar (EC) M.a. Renata Sato Tutora: Fernanda Cerqueira Temas dos Projetos: Grupo 1 - Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (HPLC), Grupo 2 - Espectrometria de absorção Atômica por chama (EAA) Critério de Avaliação Nota final= (valor) Prova 1 (20) + Prova 2 (20) + Relatórios (10) + 1ª Apresentação Projeto (15) + 2ª Apresentação final projeto (15) + Relatório do projeto (20) 2

3 Bibliografia 1. Harris, D. C. Análise Química Quantitativa, Editora LTC, 5 a edição, 2001 (6 a ed. 2005, 7 a ed. 2008) 2. Skoog, D. A. Leary J. J., Principles of Instrumental Analysis 4 a Edição, Saunders College Publishing, Fort Worth, 5 th edition, Skoog, D.A., West, D.M., Holler, F.J. Fundamentals of Analytical Chemistry, 6 a ed., Saunders, Philadelphia, 1992, ou versão condensada, mesmos autores, Analytical Chemistry, An Introduction, 6 a ed., Saunders, Philadelphia, Collins, C.H., Braga, G.L., Bonato, P.S. Fundamentos de Cromatografia. Campinas, Editora UNICAMP, Leite, F., Validação em análise química, 4 edição, Editora Átomo - Campinas, MATERIAL: INSTRUÇÕES GERAIS PARA CONFECÇÃO DOS RELATÓRIOS O trabalho científico realizado por uma pessoa ou um grupo só poderá ter utilidade para outras pessoas, se adequadamente transmitido. A forma de transmissão mais difundida é a da linguagem escrita, principalmente na forma de resumos, relatórios, artigos científicos e livros, dependendo da extensão, importância e público a ser atingido. Nos laboratórios acadêmicos e industriais são muito empregados os relatórios de experiências realizadas. Não existem normas rígidas da sua elaboração, mas, devido à sua provável importância na carreira profissional do aluno, serão dadas algumas recomendações que lhe serão úteis no progressivo aperfeiçoamento da sua técnica de redação científica. Ao fazer um relatório, o aluno deve conhecer claramente a questão abordada pela experiência e qual a resposta que obteve para ela. Esta formulação sintética servirá de linha diretriz para toda a redação, impedindo que se perca em divagações sobre assuntos colaterais ou considerações sobre detalhes sem importância. A linguagem empregada deverá ser concisa, correta e precisa. A redação deverá ser coerente quanto ao tempo dos verbos empregados, recomendandose expor os resultados das observações e experiências no passado, reservando o presente para as generalidades ou para as referências a condições estáveis. 3

4 É conveniente recorrer a tabelas e gráficos, pois permitem concentrar grande quantidade de informações. Os valores numéricos deverão estar acompanhados de unidades de medida preferencialmente pertencentes ao mesmo sistema. A unidade de medida deverá ser incluída também no cabeçalho das tabelas e nos eixos das figuras. Sempre que os valores numéricos forem muito grandes ou pequenos, convém multiplicar o valor por uma potência inteira de dez para que o número fique com um ou dois algarismos antes da vírgula, e com tantos quantos forem necessários para expressar a precisão após a vírgula. Após a redação do rascunho do relatório, este deverá ser examinado criticamente, como se estivesse sendo lido por uma pessoa estranha, verificando-se a clareza com que é expressa cada idéia e se não se pode fazê-lo com menor número de palavras, eliminandose adjetivos supérfluos, construções perifrásticas e repetição do mesmo assunto em pontos diferentes do relatório. O melhor relatório é aquele que cobre todo o assunto da maneira mais sucinta. A seguir, é apresentado um esquema sugestivo para os relatórios. A existência, a organização e o conteúdo de cada parte dependerão da experiência realizada. Os trabalhos devem ser impressos em papel branco, formato A-4, na cor preta, em uma só face, usando-se espaço 1,5 entre as linhas. Deve-se adotar caracteres do mesmo tipo para todo o trabalho, de forma a permitir uma melhor legibilidade, aconselha-se o tamanho 12, para o texto e tamanho menor para citações de mais de três linhas, notas de rodapé, paginação e legendas das ilustrações e das tabelas. Os títulos das seções devem ser separados do texto por dois espaços de 1,5cm. Mais informações, consultar o Manual para elaboração de trabalhos acadêmicos (PINHEIRO, 2008). TÍTULO DA PRÁTICA: 1. INTRODUÇÃO Fundamentos da técnica ou método. Aspectos relevantes sobre a amostra analisada Equações matemáticas. 2. OBJETIVO(S) DA EXPERIÊNCIA 3. PARTE EXPERIMENTAL Materiais, aparelhos, reagentes e soluções utilizados (especificações dos reagentes, grau de pureza, concentração das soluções, etc). Procedimento ou esquema simplificado da montagem experimental. Discussão de alguns detalhes técnicos ou características da instrumentação usada. Observações sobre o procedimento de trabalho, dificuldades, modificações e comportamento não esperado. 4

5 4. RESULTADOS Reações químicas: As equações e fórmulas devem ser destacadas no texto e se necessário, numeradas em algarismos arábicos entre parênteses. Tabelas: os dados obtidos e os resultados calculados devem ser apresentados em tabelas. As tabelas devem ser apresentadas conforme as Normas de Apresentação Tabular do IBGE (1993) e seu título na parte superior. Identificação das tabelas com número e título, legendas e citação das tabelas no texto com argumentações. Figuras: identificação das figuras (gráficos ou registros) com número, título, legendas, etc. Citação das figuras no texto com argumentações. Qualquer que seja o tipo de ilustração (figuras), sua identificação deve aparecer na parte inferior, precedida da palavra designativa, seguida do seu número de ordem no texto e de sua fonte. Devem ser inseridas mais próximas do texto a que se referem. Resultados finais. 5. DISCUSSÃO DOS RESULTADOS Principais fontes de erros, apreciação do seu efeito sobre os resultados e possibilidades de diminuí-los. Comparação dos resultados com valores publicados na literatura ou obtidos pelos outros grupos que realizaram a experiência, tentando justificar diferenças encontradas. Discussão das vantagens, potencialidades e limitações da técnica empregada quando comparada com outras, dificuldades encontradas e comportamento não esperado. Aperfeiçoamentos importantes da técnica já existentes (mas não disponíveis no laboratório) ou sugeridos pelos relatórios. Eventuais conclusões obtidas. 6. BIBLIOGRAFIA Relação das referências bibliográficas efetivamente consultadas na elaboração do relatório, identificando o número das páginas consultadas. Por exemplo, na elaboração destas recomendações: GUENTHER, W. B., Química Quantitativa: Medições e Equilíbrio, Trad. Moscovici, R., São Paulo, Blücher-EDUSP, 1972, p LUFT, C.P., Trabalho Científico: Sua Estrutura e Apresentação, Porto Alegre, 1962, p REY, L., Como Redigir Trabalhos Científicos, São Paulo, Blücher-EDUSP, 1972, p PINHEIRO, V. S. Manual para elaboração de trabalhos acadêmicos, Editora UFJF, Juiz de Fora,

6 Prática 1. Fotometria de Chama Determinação simultânea de sódio e potássio em diferentes marcas de bebidas isotônicas por fotometria de chama 1. OBJETIVOS: Familiarização com a técnica de emissão atômica em chama e aplicação à determinação de metais alcalinos em amostras reais. 2. PROCEDIMENTO 2.1. Preparo das soluções padrão e amostra Preparo de soluções padrão de Na +, K + e Li + para curva analítica - Preparar por diluição soluções para cada espécie (Na +, K + e Li + ) com água deionizada e utilizando balões de 50 ml a partir das soluções estoques de 100 mg L -1. OBS:1) As concentrações finais de Na + deverão ser: 1,0,10, 20, 30 e 40 mg L -1 ; 2) As concentrações finais de K + deverão ser: 1,0, 5,0, 10, 15 e 20 mg L -1 ; 4) As concentrações finais de Li + (usado como padrão interno) deverá ser: 20 mg L -1. Tabela 1: Medidas obtidas dos padrões no FOTÔMETRO Ensaio Na K Li Vol (ml) Sinal Vol (ml) Sinal Vol (ml) Sinal Branco Tabela 2: Teor de Na e K descrito no rótulo dos isotônicos: Marca Na (mg/ 200 ml) K (mg/ 200 ml) 6

7 Preparo da amostra Pipetar uma alíquota da amostra (a ser calculada pelo grupo) em um balão volumétrico de 50 ml de forma que o teor esperado fique dentro da faixa de calibração. Adicionar, no mesmo balão, uma quantidade da solução estoque de Li de forma que a concentração final seja de 20 mg L -1 e completar o volume com água deionizada até a marca de aferição. Realizar a preparação em duplicata (n=2) Realização das análises Preparo do equipamento (fotômetro) a) Tirar o plástico do equipamento; b) Ligar o fotômetro na tomada (verificar voltagem correta); c) Ligar o compressor na tomada; d) Ligar o fornecimento de gás (verificar se o botijão está cheio); e) Ligar o estabilizador do equipamento; e) Ligar o equipamento no botão LIGA; f) Escolher SETAGEM (clicar ENTRA; senha: SELEÇÃO-ENTRA-ESCAPE); g) Selecionar unidade (mg/l); resolução (0.1) e auto calibração; h) Selecionar LEITURA (clicar ENTRA); i) Abrir a válvula de gás no equipamento e acionar a ignição; j) Mergulhar o capilar de aspiração em água destilada; j) Regular o fluxo de gás até que os 10 cones azuis da chama se tornem nítidos e aguardar estabilização do equipamento. ANTES DE INICIAR AS LEITURAS, CALIBRAR O EQUIPAMENTO COM OS PONTOS MAIS ALTOS DA CURVA!!! 7

8 Leitura das soluções padrão (obtenção da curva analítica) e amostras Obter as leituras dos padrões (todas as soluções) e amostras, lembrando que a cada leitura deve-se passar água pelo capilar até o sinal do equipamento zerar. Tabela 3: Medidas obtidas para amostras no FOTÔMETRO Amostra/Marca Na K Li 3. QUESTÕES A SEREM ENTREGUES 1. Construa o gráfico da curva de calibração para os valores obtidos no fotômetro e calcule o valor do Fator de Resposta. 2. Determine o valor de Na e K nas amostras indicadas, compare com o valor rotulado descrito na tabela 2 e calcule o valor do erro relativo. 8

9 Prática 2: Espectrofotometria UV Vis OTIMIZAÇÃO DE UM MÉTODO ESPECTROFOTOMÉTRICO PARA QUANTIFICAÇÃO DE FERRO 1. Objetivo Estudar as propriedades colorimétricas de dois sistemas de complexação para o íon ferro, a fim de avaliar a possibilidade de sua utilização na determinação espectrofotométrica deste elemento. 2. Introdução teórica Os critérios para uma análise espectrofotométrica satisfatória são: (a) Especificidade da reação colorimétrica: Seletividade da reação. (b) Proporcionalidade entre a cor e a concentração: É desejável que o sistema siga a lei de Beer. (c) Estabilidade da cor: A cor produzida deve ser suficientemente estável para permitir a obtenção de uma leitura adequada. (d) Reprodutibilidade: O processo colorimétrico deve ter resultados reprodutíveis em condições experimentais específicas. (e) Limpidez da solução: A solução deve ser isenta de precipitado sempre que se faz comparação com um padrão límpido. (f) Alta sensibilidade: É desejável quando se trata da determinação de quantidades diminutas, que a reação colorimétrica seja altamente sensível. O Ferro(III) reage com o tiocianato para dar uma série de compostos intensamente coloridos, já o Fe(II) não reage. Dependendo da concentração do tiocianato pode ser obtida uma série de complexos, estes são vermelhos e podem ser formulados como [Fe(SCN) n ] 3-n (n= 1,2,...,6). Em baixas concentrações do íon tiocianato, a espécie colorida predominante é [Fe(SCN)] 2+, já em uma concentração de tiocianato de 0,10 mol L -1 a espécie predominante é [Fe(SCN) 2 ] 1+ e em concentrações muito elevadas é a [Fe(SCN) 6 ] 3-. Na determinação colorimétrica deve-se usar um grande excesso de tiocianato, porque este aumenta a intensidade e também a estabilidade da cor. O Ferro(II) reage com a ortofentrolina para formar um complexo de cor vermelho-alaranjado [Fe(o-phen) 3 ] 2+, cujo comprimento de onda de máxima absorção é 510 nm. A intensidade da cor é independente da acidez no intervalo de ph de 3 a 12 e é estável por longos períodos. Assim o Fe(III) pode ser reduzido com cloreto de hidroxilamônio (hidroxilamina) para Fe(II), e este determinado com a adição de ortofenantrolina. 9

10 Ácidos fortes devem estar presentes para reprimir a hidrólise do ferro, entretanto o ácido sulfúrico não é recomendado, porque os íons sulfato têm certa tendência a formar complexos com os íons Fe(III). Nesses dois métodos usados para a determinação de ferro serão estudados os comportamentos dos complexos [Fe(SCN) 6 ] 3- e [Fe(o-phen) 3 ] 2+ com relação ao tempo, ph e excesso de ligante, a fim de identificar o melhor método para quantificação do ferro. 3. Parte Experimental - Vidrarias: 12 balões de 10,00 ml 1 micropipeta de volume variável de 20 a 200 µl 1 micropipeta de volume variável de 1000 a 5000 µl 2 buretas de 10,00 ml 8 béqueres de 25 ml 1 par de cubetas de vidro 3 conta-gotas Pisseta com água destilada - Reagentes: HCl concentrado Solução estoque de Fe(III) mmol L -1 (1 mmol L -1 ) NH 4 SCN 0,30 mol L -1 NaOH 2 mol L -1 1,10-fenantrolina 0,30 % (m/v) NH 2 OH.HCl 10 % (m/v) Acetato de sódio 2 mol L -1 - Equipamento: Espectrofotômetro Balança analítica 4. Preparo do aparelho a) Ligar o espectrofotômetro na tomada (VERIFICAR A VOLTAGEM CORRETA); b) Esperar 15 minutos para estabilizar a lâmpada; c) Escolher o modo absorvância; d) Colocar a cubeta contendo água destilada no compartimento de leitura e clicar AUTOZERO; e) Colocar a cubeta contendo o complexo no equipamento e realizar a leitura de absorvância. 10

11 5. Procedimento 5.1. Sistema Fe(III)-tiocianato Espectro de absorção a) Pipetar 600 µl da solução estoque de Fe(III) para um balão de 10,00 ml; b) Acrescentar 400 µl da solução de NH 4 SCN 0,30 mol L -1 ; c) Agitar e completar o volume do balão com água destilada; d) Ler os valores de aborvância do complexo Fe(III)-tiocianato variando o comprimento de onda de 400 a 560 nm (Tabela 1). Tabela 1: Dados obtidos para espectro de absorção Comprimento de onda / nm Absorvância Comprimento de onde de máxima absorvância: Efeito do tempo a) Usar a solução prepara no item anterior para estudar o efeito do tempo na estabilidade do complexo Fe(III)-tiocianato; b) Ler a absorvância em intervalos regulares de 30 minutos por um período de 2 horas (Tabela 2). Tabela 2: Dados obtidos para estudo do tempo de reação Tempo / seg Absorvância O complexo foi estável no intervalo estudado? 11

12 Efeito do volume de complexante (tiocianato) a) Preparar 6 balões volumétricos de 10,00 ml usando 600 µl da solução estoque de Fe(III); b) Acrescentar diferentes volumes (de acordo com a tabela abaixo) de NH 4 SCN 0,30 mol L -1 com o auxílio de uma micropipeta; c) Agitar e completar o volume do balão com água destilada; d) Ler os valores de absorvância do complexo Fe(III)-tiocianato para cada balão volumétrico (Tabela 3). Tabela 3: Dados obtidos para volume de complexante Volume de NH 4 SCN / µl Absorvância O volume de agente complexante alterou o valor de absorvância? Por quê? Efeito do ph do meio complexante a) Preparar 5 balões volumétricos de 10,00 ml usando 600 µl da solução estoque de Fe(III); b) Acrescentar 400 µl da solução saturada de NH 4 SCN 0,30 mol L -1 ; c) Acrescentar nos balões; 50 µl HCl conc ; 50 µl HCl 0,10 mol L -1 ; 0, 20 µl e 100 µl de NaOH 2 mol L -1, respectivamente; d) Agitar e completar o volume do balão com água destilada; e) Medir o ph de cada um dos balões; d) Ler os valores de aborvância do complexo Fe(III)-tiocianato variando o ph do meio (Tabela 4). 12

13 Tabela 4: Dados obtidos para estudo do efeito do ph Balão ph Absorvância O ph do meio alterou os valores de absorvância? Este complexo apresenta uma boa estabilidade quanto à acidez do meio? 5.2. Sistema Fe(III)-1,10-fenantrolina Espectro de absorção a) Pipetar 400 µl da solução estoque de Fe(III) para um balão de 10,00 ml; b) Acrescentar 100 µl de hidroxilamina (NH 2 OH.HCl) 10 % (m/v) e agitar para reduzir o Fe(III) para Fe(II); c) Acrescentar 200 µl de acetato de sódio 2 mol L -1 e 200 µl de 1,10-fenantrolina 0,30 % (m/v); d) Completar o volume do balão com água destilada e homogeneizar; e) Ler os valores de aborvância do complexo [Fe(o-phen) 3 ] 2+ variando o comprimento de onda de 400 a 560 nm (Tabela 5). Tabela 5: Dados obtidos para espectro de absorção Comprimento de onda / nm Absorvância Comprimento de onde de máxima absorvância: 13

14 Efeito do tempo a) Usar a solução prepara no item anterior para estudar o efeito do tempo na estabilidade do complexo [Fe(o-phen) 3 ] 2+ ; b) Ler a absorvância em intervalos regulares de 30 minutos por um período de 2 horas (Tabela 6). Tabela 6: Dados obtidos para estudo do tempo de reação. Tempo / seg Absorvância O complexo foi estável no intervalo estudado? Efeito do volume de complexante (1,10-fenantrolina) a) Preparar 6 balões volumétricos de 10,00 ml usando 400 µl da solução estoque de Fe(III); b) Acrescentar 100 µl de hidroxilamina (NH 2 OH.HCl) 10 % (m/v) e agitar para reduzir o Fe(III) para Fe(II); c) Acrescentar 200 µl de acetato de sódio 2 mol L -1 e diferentes volumes (de acordo com a tabela abaixo) de 1,10-fenantrolina 0,30 % (m/v) com o auxílio de uma micropipeta; d) Agitar e completar o volume do balão com água destilada; e) Ler os valores de absorvância do complexo [Fe(o-phen) 3 ] 2+ para cada balão volumétrico (Tabela 7). Tabela 7: Dados obtidos para estudo do volume do complexante. Volume de C 12 H 8 N 2 / µl Absorvância O volume de agente complexante alterou o valor de absorvância? Por quê? 14

15 Efeito do ph do meio complexante a) Preparar 4 balões volumétricos de 10,00 ml usando 400 µl da solução estoque de Fe(III); b) Acrescentar 100 µl de hidroxilamina (NH 2 OH.HCl) 10 % (m/v) e agitar para reduzir o Fe(III) para Fe(II); c) Acrescentar 200 µl de 1,10-fenantrolina 0,30 % (m/v) com o auxílio de uma micropipeta; d) Acrescentar nos balões; 50 µl HCl conc ; 50 µl HCl 0,10 mol L -1 ; 200 µl de CH 3 COONa 2 mol L -1 ; 100 µl de NaOH 2 mol L -1, respectivamente. e) Agitar e completar o volume do balão com água destilada; e) Medir o ph de cada um dos balões; d) Ler os valores de absorvância do complexo [Fe(o-phen) 3 ] 2+ variando o ph do meio (Tabela 8). Tabela 8: Dados obtidos para estudo o efeito do ph. Balão ph Absorvância O ph do meio alterou os valores de absorvância? Este complexo apresenta uma boa estabilidade quanto à acidez do meio? Qual dos dois sistemas mostrou-se melhor para a determinação do ferro? 5.3. Quantificação do teor de ferro(iii) em uma amostra desconhecida Curva Analítica a) Preparar 5 balões volumétricos de 10,00 ml usando diferentes volumes da solução estoque de Fe(III); b) Acrescentar os demais reagentes necessários para a reação colorimétrica do ferro com o ligante que apresentou melhores resultados nos estudos anteriores; c) Agitar e completar o volume do balão com água destilada; d) Ler os valores de absorvância do complexo para cada balão volumétrico (Tabela 8). 15

16 Amostra desconhecida a) Preparar 1 balão volumétrico de 10,00 ml usando 100 µl da solução amostra; b) Acrescentar os demais reagentes necessários para a reação colorimétrica do ferro como realizado para preparar a curva analítica; c) Agitar e completar o volume do balão com água destilada; d) Ler os valores de absorvância do complexo (Tabela 9). Tabela 9: Dados obtidos para leitura curva analítica e amosta. Padrão Volume da solução [Fe(III)] / µmol L -1 Absorvância estoque de Fe(III) / µl Amostra Amostra Amostra Questionário 1) Discutir clara, porém brevemente, os métodos tiocianato e 1,10-fenantrolina como reagentes colorimétricos para o ferro, incluindo nesta discussão os seguintes pontos: a) tempo de estabilidade do complexo formado, b) quantidade de reagente colorimétrico e c) efeito do ph do meio na formação do complexo. 2) Interpretar qualitativamente a curva de absorvância versus volume de 1,10- fenantrolina obtida experimentalmente. 3) Se o complexo [Fe(o-phen) 3 ] 2+ estiver dissociado apreciavelmente, o que você esperaria obter na curva de absorvância versus volume de 1,10-fenantrolina. 4) Sabe-se que o Fe(II) e a 1,10-fenantrolina formam um complexo 1:3 estável ([Fe(ophen) 3 ] 2+ ). A partir deste fato e dos dados obtidos na curva de absorvância versus volume de 1,10-fenantrolina calcule a concentração molar da 1,10-fenantrolina na solução original usada no laboratório. 5) Defina o sistema que você adotaria para realizar uma determinação quantitativa do ferro. Explique o porquê da sua escolha. 16

17 Prática 3. Espectrometria de absorção atômica com chama (FAAS) Determinação de Cobre em Aguardente 1. Objetivo 1.1. Determinação de cobre em aguardente pelos métodos de calibração externa, matrixmatching e de adição de padrão utilizando a técnica de espectrofotometria por absorção atômica Avaliação do efeito do solvente Familiarização com a técnica espectrometria de absorção atômica com chama (FAAS). 2. Instrumental Espectrômetro de absorção atômica com chama F AAS, modelo Thermo Scientific SOLAAR M5 3. Procedimento 3.1. Conhecendo a concentração da solução padrão de cobre disponível no laboratório, calcule os volumes necessários para preparar as soluções das Tabelas 1, 2 e 3 em balões volumétricos de 10 ml Para a curva analítica usando matrix-matching, realizar a diluição dos padrões usando 4 ml de uma solução de etanol a 40% v/v Para a curva analítica por adição de padrão, proceda a diluição dos padrões usando 4 ml da amostra Diluir 4 ml das amostras de aguardente para balões de 10 ml. Completar os volumes com água deionizada até a marca de aferição do balão, realizar esse procedimento em triplicata Antes de proceder às leituras deixar a chama ligada por 10 min Meça a absorbância das soluções, em 324,7 nm, utilizando a chama ar-acetileno, anotando os dados obtidos nas tabelas. 17

18 Obs.: Aspirar água entre cada nova solução a ser analisada. Obs.: Caso os valores de concentração cobre nas amostras estejam fora da curva de calibração fazer outra diluição das amostras Ao fim do experimento, deixe passar água destilada pelo queimador por alguns minutos, desligue o aparelho, certificando-se de que a chama está apagada e os registros de gás, fechado. 4.Parte experimental Tabela 1. Curva analítica em meio aquoso. Balão (10 ml) Cobre (mg L -1 ) Volume de Cobre (ml) 1 Branco 0,0 2 1,0 3 3,0 4 5,0 5 10,0 Absorvância Tabela 2. Curva analítica em etanol. Balão (10 ml) Cobre (mg L -1 ) Volume de etanol 40% v/v (ml) 6 Branco 0,0 4,0 7 1,0 4,0 8 3,0 4,0 9 5,0 4, ,0 4,0 Volume de Cobre (ml) Absorvância Tabela 3. Curva analítica por adição de padrão. Balão (10 ml) Cobre (mg L -1 ) Volume de amostra (ml) 11 1,0 4,0 12 3,0 4,0 13 5,0 4, ,0 4,0 Volume de Cobre (ml) Absorvância 18

19 5. Cálculos e Resultados 5.1. Construa as curvas de calibração (externa, simulação de matriz e adição de padrão) de absorbância em função da concentração de cobre Determine a concentração (mg L -1 ), desvio padrão, desvio padrão relativo e o intervalo de confiança (95%) para cobre na amostra de cachaça (n = 3) Compare os resultados entre si usando teste t adequado (use como referência o método das adições de padrão) Avaliar a qualidade da amostra de aguardente investigada a partir dos resultados obtidos. 19

20 Prática 4. HPLC Determinação de ácido paracetamol e cafeína em medicamentos por HPLC 1. Instrumentação Equipamento: HPLC Agilent 1100 serie equipado com injetor manual, alça de amostragem de 20µL, sistema desgaseificador, bomba quaternária, detector UV-VIS de múltiplos comprimentos de onda, software Agilent Chemistation LC Systems. Coluna: C8 Zorbax eclipse XDB (150 mm x 4,6 mm de diâmetro interno, 5 m de diâmetro de partícula) ph metro Balança analítica Ultra-som 2. Materiais e reagentes Metanol grau HPLC Ácido fosfórico 85 % m/m grau HPLC Cafeína p.a Paracetamol p.a. Amostra de medicamentos Filtros para seringa com membrana de PTFE 0,45 μm Seringas descartáveis Micropipetas e ponteiras Vidraria Microtubos de centrifuga 2 ml Grau e pistilo 3. Procedimento 3.1. Preparo da solução H 3 PO 4 ph 2,5: Coloque cerca de 800 ml de água deionizada em um béquer com capacidade de 1 L e introduza o eletrodo de vidro do phmetro na água. Sobre agitação constante, adicione na água pequenos incrementos de H 3 PO 4 concentrado (grau HPLC), até atingir o ph 2,5. 20

21 3.2. Solução para diluição dos padrões e amostras - solução H 3 PO 4 ph 2,5/metanol (60:40 v/v): Misture 60 ml da solução de H 3 PO 4 ph 2,5 com 40 ml de metanol. Utilize esta solução para preparar as soluções padrões e amostras. Transfira uma alíquota desta solução para um microtubo previamente rotulado com CAL Preparo das soluções padrões: Solução padrão estoque Pese em béqueres distintos (10,0 ml) cerca de 40,0 mg de paracetamol e 25,0 mg de cafeína. Adicione cerca de 5 ml da solução anteriormente preparada (item 3.2) e leve as soluções ao ultrassom até total dissolução (até 5 min é suficiente). Transfira quantitativamente cada uma das soluções para um balão volumétrico de 10,0 ml e complete o volume até a marca de aferição com a solução do item 3.2. A partir das massas dos padrões pesadas, calcule as concentrações de paracetamol mg/ml e cafeína mg/ml nas soluções padrão denominadas estoques, na solução padrão mistura e nas soluções da curva analítica Solução padrão individual para identificação dos picos no cromatograma Transfira 50 µl de cada uma das soluções padrões estoques (4,00 e 2,50 mg ml -1 ) para um microtubo e acrescente cerca de 1,5 ml da solução do item 3.2. Filtre cada uma das soluções preparadas em filtro de seringa com membrana de PTFE 0,45 µm em outro microtudo e deixe-as reservadas Solução padrão mistura (MIX) Transfira as alíquotas das soluções padrões estoques (3.31) de paracetamol e cafeína para o mesmo balão volumétrico (5,00 ml) e complete o volume até a marca de aferição com a solução do item 3.2. Depois de homogeneizar, transfira a solução para um béquer de 10 ml, aspire a solução com um seringa descartável de 5 ml e filtre esta solução em filtro de seringa com membrana de teflon (PTFE) de 0,45 m de porosidade. Esta solução é denominada Solução padrão mistura (MIX) e será utilizada para preparar as soluções da curva analítica. A partir da concentração das soluções estoque e suas alíquotas, calcule as concentrações de paracetamol mg/l e cafeína mg/l nesta solução. 21

22 3.3.4 Curva analítica Prepare as soluções da curva analítica (5 níveis de concentração) a partir da diluição da solução padrão mistura MIX, conforme o esquema apresentado na figura 1. Transfira as alíquotas da solução MIX para os respectivos balões volumétricos de 1,00 ml. Complete o volume do balão com a solução para diluição, homogeneíze e transfira as soluções preparadas para microtubos de 2 ml, previamente rotulados: CAL 2, CAL 3, CAL 4 e CAL 5. O microtubo CAL 1 deve conter apenas a solução de diluição que será o branco da curva. Estas soluções serão injetadas no HPLC. Calcule as concentrações em mg/l de paracetamol e cafeína em cada uma das soluções da curva analítica e complete os dados na Tabela 2. Sol. padrão paracetamol 4,00 mg/ml Curva analítica Sol. padrão cafeína 2,50 mg/ml Alíquota 500 L Balão volumétrico 5,00 ml Alíquota 100 L Solução padrão mistura (MIX) Paracetamol ( mg/l) e cafeína ( mg/l) Filtro de membrana PTFE 0,45 m Líquido filtrado CAL 1 PAR 0 mg/l CAF 0 mg/l CAL 2 CAL 3 CAL 4 CAL 5 40 L 80 L 120 L 160 L Balão volumétrico 1 ml PAR CAF mg/l mg/l Balão volumétrico 1 ml PAR CAF mg/l mg/l Balão volumétrico 1 ml PAR CAF mg/l mg/l Balão volumétrico 1 ml PAR CAF mg/l mg/l Figura 1: Esquema de preparo da solução padrão mistura e curva analítica. 22

23 3.4. Preparo das amostras: Pese um comprimido do medicamento e triture em um grau de porcelana. Calcule o valor massa da amostra a ser pesada. Em três béqueres (25 ml) distintos, pese porções com cerca de mg da amostra triturada. Adicione cerca de 5 ml da solução H 3 PO 4 ph 2,5/metanol (60:40 v/v) (item 3.2) em cada um dos béqueres e leve a solução ao ultrassom por 5 min. Após este tempo, transfira a solução para um balão de 10 ml e complete o volume com a solução para diluição (item 3.2). Filtre a solução em filtro de seringa com membrana de PTFE 0,45 m de porosidade e transfira 100 L do filtrado para um balão de 5,00 ml. Complete o volume do balão com a solução para diluição (item 3.2) e transfira alíquotas das amostras para microtubos previamente identificados. Injete as amostras no HPLC (Figura 2). Massa da amostra? mg H 3 PO 4 ph 2,5/MeOH (60:40) Ultrassom (5 min) H 3 PO 4 ph 2,5/MeOH (60:40) Balão volumétrico (10 ml) resíduo Filtro de membrana 0,45 M filtrado Alíquota 100 L Balão volumétrico (5 ml) Figura 2: Esquema de preparo das amostras. HPLC 3.5. Parâmetros do HPLC Transfira a solução H 3 PO 4 ph 2,5 para frasco âmbar no canal D e metanol para o frasco no canal C e água deionizada no frasco do canal A. Purgue 30 ml de solvente em cada um dos canais (A, B e C). Eluir cada canal por 15 minutos com fluxo de 3 ml min -1. Condicione a coluna por 15 a 20 min com a composição inicial da fase móvel, Solução H 3 PO 4 ph 2,5/metanol (60:40 v/v). Neste mesmo tempo, ligue a lâmpada UV e aguarde o sinal estabilizar. 23

24 Crie um método para análise no HPLC com os seguintes parâmetros (Tabela 01): Tabela 01: Parâmetros analíticos para determinação cafeína e paracetamol por HPLC com detecção no UV. Gradiente: Tempo (min) Canal A % H 3 PO 4 ph 2,5 Canal B % MeOH Fluxo (ml/min) P max (Bar) Tempo de análise (min): Tempo para estabilizar o sinal (min): Detector (nm): A B C D E 1) Injete a solução padrão de paracetamol e a solução padrão de cafeína individuais para identificar o tempo de retenção de cada analito e a ordem de eluição. 2) Injete as soluções padrões da curva analítica: CAL 1, CAL 2, CAL 3, CAL 4 e CAL 5. 3) Injete as amostras preparadas em triplicata. OBS: TODAS AS SOLUÇÕES INJETADAS NO HPLC DEVEM SER PREVIAMENTE FILTRADAS EM MEMBRANA DE 0,45 M. Após as análises: 4) Desligue a lâmpada. 5) Limpe o sistema passando água por 15 min com fluxo de 1 ml/min pela coluna para remover a solução ácida utilizada na fase móvel. 6) Eluir pela coluna acetonitila ou metanol por 5 min com fluxo de 1 ml/min. 7) Limpe a válvula de injeção, na posição inject, com água (1 a 2 ml) e metanol (1 a 2 ml). 9) Desligue o equipamento. 24

25 3.6. Orientação para tratamento dos dados obtido na prática Trabalhando com o software do HPLC Construa a curva analítica utilizando o software do HPLC e imprima os relatórios da curva analítica e das análises das amostras utilizando o software. Determine as massas em mg e os valores de % m/m dos analitos presentes no comprimido do medicamento analisado, utilizando os dados do software, acompanhados dos respectivos valores de incertezas. Compare os resultados obtidos com os valores referenciados pelo fabricante do medicamento. Apresentem no relatório da prática (Tabela) os dados obtidos no software do HPLC (curva analítica, concentrações dos compostos nas mostras injetadas, mg e % m/m dos compostos no medicamento, precisão e exatidão da análise) Trabalhando com planilhas do Excel Com os valores de áreas obtidos para obtidos para as injeções das soluções da curva analítica, elabore uma planilha no Excel para construção da curva analítica. Obtenha a equação da reta e as incertezas da inclinação, intercepto e regressão. Calcule os limites de detecção e quantificação com base nos dados da curva analítica. Determine a massa em mg de paracetamol por comprimido do medicamento e o intervalo de confiança 95% de confiabilidade. Determine a % m/m de paracetamol e intervalo de confiança 95% de confiabilidade. Determine a massa em mg de cafeína por comprimido do medicamento e o intervalo de confiança 95% de confiabilidade. Determine a % m/m de paracetamol e intervalo de confiança 95% de confiabilidade. Compare os resultados obtidos com os valores referenciados pelo fabricante do medicamento. Apresente no relatório da prática (Tabela) os dados obtidos na planilha do Excel (curva analítica, concentrações dos analitos nas mostras injetadas, massas (mg) e % m/m dos analitos no medicamento e precisão da análise. 25

26 Tabela 02: Valores de áreas e tempos de retenções obtidos para injeção no HPLC-UV das soluções padrões da curva analítica. Obs. Preencha a tabela com os valores de concentração calculados para as soluções preparadas no item Tempo de Retenção (min) Analito Curva analítica Concentração (mg L -1 ) Área do pico ( ) Cal 1 Cal 2 Cal 3 Cal 4 Cal 5 Cal 1 Cal 2 Cal 3 Cal 4 Cal 5 Dados das amostras: Medicamento: Composição: Massa comprimido: Tabela 03: Valores de áreas obtidos para a análise das amostras. Amostra Massa amostra (mg) Área pico Área pico ( ) ( ) MATERIAL DISPONÍVEL: 26

27 Prática 5 Eletroforese capilar Determinação de acidez livre em óleos vegetais 1. Objetivos Familiarização com a técnica de eletroforese capilar; Determinação dos ácidos graxos livres majoritários e da acidez livre em amostras de azeite de oliva extravirgem e comparar com o perfil em óleo de soja, Comparação entre os resultados obtidos por eletroforese capilar e os obtidos com a metodologia oficial (titulação volumétrica). 2. Metodologia As análises serão realizadas em um equipamento de eletroforese capilar modelo Agilent CE 7100 equipado com detector UV/Vis de arranjo de diodos. Para fins de comparação, serão realizadas análises por titulação volumétrica segundo o método oficial das Normas Analíticas do Instituto Adolfo Lutz Materiais e Reagentes Banho-maria, banho de ultrassom; balança analítica Balões volumétricos de 5,0 e 10,0 ml; erlenmeyers de 125 ml; bureta de 25 ml; pipeta Pasteur; micropipetas e ponteiras; Capilar de sílica fundida com revestimento externo de fluoropolímero (TSH); vials para equipamento de eletroforese Soluções de padrão de ácido tridecanoico (C13:0); tampão NaH 2 PO 4 /Na 2 HPO 4 (ph~6,86); dodecilbenzeno sulfonato de sódio (SDBS); polioxietileno lauril éter (Brij L23); hidróxido de sódio 0,1 mol L-1 (padronizada) e fenolftaleína 1%; Acetonitrila (ACN); 1-octanol; etanol; tolueno; Água deionizada. 27

28 2.2. Procedimento Extração dos ácidos graxos livres da amostra: Aquecer em banho-maria, a 60ºC, cerca de 50 ml de etanol, controlando a temperatura com um termômetro; Pesar 0,75 g de azeite extravirgem (em duplicatas autênticas) e 1,50 g de óleo de soja, em balões volumétricos de 5,0 ml. Adicionar o padrão interno (ácido tridecanoico) nos balões para uma concentração final de 0,5 mmol L -1 ; Completar o volume dos balões com o etanol aquecido, agitar em vórtex por 1 min e esperar resfriar; Transferir uma alíquota da fase etanólica (superior) para os vials de análise. Preparo do eletrólito de corrida: A partir das soluções estoques, prepare, em um balão de 10 ml, o eletrólito com a seguinte composição: 15 mmol L -1 de solução tampão NaH 2 PO 4 /Na 2 HPO 4 (ph ~ 6,86); 4,0 mmol L -1 de SDBS; 8,3 mmol L -1 de Brij L23; 45% v/v de ACN; 2,1% v/v de 1-octanol; Completar o volume com água deionizada; Deixar em banho de ultrassom por 10 minutos para degaseificação; Transferir o eletrólito para 3 vials. Parâmetros instrumentais: Dimensões do capilar: 48,5 cm de comprimento total (40 cm efetivos até o detector), 75 µm de diâmetro interno e 375 µm de diâmetro externo; Temperatura no cartucho do capilar: 25ºC; Comprimento de onda de detecção: 224 nm (detecção indireta); Injeção da amostra: 12 mbar por 4 s; Tensão elétrica: + 19 kv 28

29 Obs.: Antes do primeiro uso, os capilares devem ser condicionados através de flush com NaOH 1,0 mol L -1 (40 min), água deionizada (15 min) e solução do eletrólito (15 min). Entre as corridas, condicionamento com NaOH 1,0 mol L -1 (2 min), água deionizada (2 min) e solução de eletrólito (2 min). Para isso, prepare um vial com NaOH 1,0 mol L -1, um com água deionizada e mais dois vials vazios que servirão como descartes. Cálculos e resultados: Nos eletroferogramas, integrar os picos referentes aos ácidos graxos palmítico, oleico e linoleico e do padrão interno, ácido tridecanoico, obtendo as áreas; Quadro 1. Áreas dos analitos nas amostras de azeite de oliva. Ácido graxo Área réplica 1 Área réplica 2 Tridecanoico (C13:0 - PI) Palmítico (C16:0) Oleico (C18:1) Linoleico (C18:2) A partir da expressão (1), é possível determinar o teor de acidez, em ácido oleico, em azeites de oliva (Expressão 2). A acidez deve ser expressa em porcentagem (% m/m) de ácido oleico, levando-se em consideração a massa pesada e a diluição feita no preparo da amostra. A AG AG = F A PI r [PI] (1) % acidez em C18:1c = MM C18:1c [C13: 0]V A xi F r A C13:0 m 100 (2) 29

30 onde [AG] é a concentração do ácido graxo e A AG é a área encontrada para o ácido graxo correspondente, [PI] é a concentração do padrão interno e A PI é a área encontrada para o padrão interno, e F r é um fator de resposta previamente obtido através de curvas analíticas utilizando as mesmas condições de análise, A xi é a área de cada AGL nas amostras (C18:1c, C16:0, C18:2cc), A C13:0 é a área do PI, [C13:0] é a concentração do PI (0,5 mmol L -1 ), V é o volume em litros, m é a massa da amostra em miligramas e MM C18:1c é a massa molecular de C18:1c (282,5 g mol -1 ). Os fatores de resposta para cada um dos 3 ácidos podem ser encontrados na referência [2]. Quadro 2. Concentrações dos analitos Ácido graxo Fator de resposta (F r ) [AG] mol L -1 réplica 1 [AG] mol L -1 réplica 2 Palmítico (C16:0) 0,622 Oleico (C18:1) 0,526 Linoleico (C18:2) 0,604 Titulação volumétrica (apenas para o azeite extravirgem) Pese 1,75 g de azeite extravirgem em um erlenmeyer de 125 ml (em triplicata); Adicione 25 ml de uma mistura etanol/tolueno 1:1 v/v ao erlenmeyer; Adicione também o indicador fenolftaleína (2 a 3 gotas) ao erlenmeyer; Prepare uma bureta de 25 ml com solução de NaOH ~ 0,1 mol/l padronizada; Titule a amostra até o aparecimento de coloração rosa que perdure por 30 s. Para os cálculos da titulação, utilize a equação: % acidez em ácido oleico = V NaOH. [NaOH]. 8,945 m a 30

31 onde V NaOH é o volume gasto na titulação (em ml); [NaOH] é a concentração do titulante (em mol/l); m a é a massa de amostra utilizada (em g); e 8,945 é um fator de correção para o ácido oleico. Quadro 3. Percentual de acidez, por titulação volumétrica. Réplica Massa de amostra (g) V NaOH (ml) % acidez (ác. oleico) Questões para o relatório Qual a função do SDBS na composição do eletrólito de corrida? E a função do tampão? Calcule a concentração de cada ácido graxo e a acidez livre dos óleos vegetais analisados e expresse este resultado em porcentagem de ácido oleico. Compare os resultados obtidos por eletroforese capilar com os obtidos por titulação volumétrica usando a abordagem estatística adequada e dizendo se os métodos diferem entre si em um intervalo de 95% de confiança. Discuta possíveis vantagens e desvantagens entre os dois métodos. Pesquise na literatura os valores permitidos de acidez para o azeite extravirgem e discuta se os valores obtidos experimentalmente estão de acordo com a legislação. Explique se seria possível identificar algum tipo de fraude no azeite por eletroforese capilar. 5. Referências 1. INSTITUTO ADOLFO LUTZ. Normas analíticas do Instituto Adolfo Lutz:: Métodos Químicos e Físicos para Análise de Alimentos, 3. ed. São Paulo: IMESP, 1985, p SATO, R. T. et al. Rapid Separation of Free Fatty Acids in Vegetable Oils by Capillary Zone Electrophoresis. Phytochem Analysis, 2014, 25,