APLICAÇÃO DA ELETROFORESE CAPILAR PARA ANÁLISE DE NITRITO E NITRATO EM AMBIENTES AQUÁTICOS: TEORIA E PRÁTICA DENISE DO CARMO SOARES

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1 APLICAÇÃO DA ELETROFORESE CAPILAR PARA ANÁLISE DE NITRITO E NITRATO EM AMBIENTES AQUÁTICOS: TEORIA E PRÁTICA DENISE DO CARMO SOARES ORIENTADOR: MARCONE AUGUSTO LEAL DE OLIVEIRA JUIZ DE FORA 2007

2 INTRODUÇÃO A concentração de nitrato e nitrito é um importante índice da qualidade da água e de alimentos. Quando ingerido pelo homem, o nitrato sofre ação microbiana na saliva e é reduzido a nitrito, o qual reage com aminas, dando origem a compostos nitrosos, como as nitrosaminas, que são carcinogênicos. Em crianças, o nitrito pode provocar a metaemoglobinemia, doença que causa o impedimento do transporte de oxigênio dos alvéolos pulmonares para os tecidos, o que pode levar à morte (WOLFF e WASSERMAN, 1972; SWANN, 1975). A quantificação de nitrato e nitrito em extratos de diferentes origens pode ser feita por colorimetria, destilação, potenciometria, espectrofotometria na região ultravioleta, cromatografia gasosa e cromatografia líquida (SAH, 1994; ANDERSON e CASE, 1999; SALOMEZ e HOFMAN, 2002). A análise dos íons também pode ser realizada através da Eletroforese Capilar, como por exemplo, descrito nos trabalhos de MARSHALL e TRENERRY (1996) para análise de alimentos; de BJERGEGAARD et al. (1995), que analisaram compostos biológicos, OEHRLE (1996), que analisou os ânions em amostras de água e BORIES et al. (1999) que analisaram fluidos biológicos. Grande número de metodologias analíticas têm sido propostas para determinação de íons nitrato e nitrito, incluindo a associação de procedimentos cromatográficos, espectrofotométricos e potenciométricos (MONSER et al., 2002, MIKUSKA e VECERA, 2001). Os métodos espectrofotométricos são freqüentemente empregados, pelos baixos limites de detecção, pela rapidez, simplicidade e versatilidade de reagentes cromogênicos (MONSER et al., 2002 e GUOZHEN et al., 1998).

3 Dentre os procedimentos mais conhecidos destaca-se o de Griess, desenvolvido em 1879, uma técnica simples e que se tornou oficial para quantificação de nitratos e nitritos, sob a forma do íon nitrito, após reação com sulfanilamida e etilenodiamina. A principal desvantagem é a necessidade de se empregar colunas de cádmio envelopado em cobre, para redução do nitrato e uma solução de cloreto de cádmio, para extração dos íons de amostras sólidas. A coluna de redução precisa ser regenerada após a passagem de algumas amostras e desta regeneração resultam resíduos que precisam ser descartados, bem como o próprio amalgama depois de um período de uso (MONSER et al., 2002, MOORCROFT et al., 2001 e BAUMGARTEN et al., 1996). Na determinação de nitrato em carnes e demais alimentos, o método oficial estabelecido pelo Ministério da Agricultura e Abastecimento (BRASIL, 1999) é o que promove a redução do nitrato a nitrito em meio alcalino pela passagem do extrato em coluna contendo Cd esponjoso, com posterior quantificação do N na forma de nitrito (N - NO - 2 ) por colorimetria. Esse procedimento foi proposto por FOLLETT e RATCLIFF (1963), para análise de nitrato e nitrito em carnes e seus derivados, e simplificado por LARA et al. (1978). Ele é utilizado pelo Instituto Adolfo Lutz, responsável por emitir laudos sobre contaminação de alimentos no Estado de São Paulo e apresenta como desvantagens ser trabalhoso, necessitar do uso de vários reagentes e expor o analista a eventuais riscos de saúde pelo contato com o cádmio (SAH, 1994). A determinação de nitrato por colorimetria pode ser feita direta ou indiretamente. Na determinação direta, são utilizados o ácido fenoldissulfônico (JOHNSON e ULRICH, 1950) ou o ácido salicílico (CATALDO et al., 1975). Na determinação indireta, conforme ULRICH (1948), e no método proposto por

4 FOLLETT e RATCLIFF (1963), o nitrato é reduzido a nitrito, o qual é quantificado (SAH, 1994). A determinação indireta do nitrato apresenta vantagens em relação à direta: maior sensibilidade, maior precisão e melhor seletividade, ou seja, é menos sujeita à interferência de outros íons (SAH, 1994). Outro procedimento colorimétrico de determinação indireta do nitrato é o descrito em ULRICH (1948) e modificado conforme MORAES e CANTARELLA (2003). Nesse procedimento, a redução do nitrato a nitrito é feita por uma mistura redutora contendo Zn em pó, BaSO 4 e MnSO 4 e apresenta como desvantagem a redução pelo Zn, pois esta reação é afetada pela temperatura e pelas condições do meio, e não é completa, pois nem todo o nitrato é reduzido no tempo de reação utilizado e, assim, há necessidade de fazer uma curva de calibração para cada lote de amostras, em cada dia de análise. O procedimento proposto por BREMNER e KEENEY (1965), em que o N - NO 3- é determinado por destilação dos extratos em microdestilador Kjeldahl e subseqüente titulação do destilado, foi proposto inicialmente para solo e apresenta vantagens em relação aos procedimentos colorimétricos, como ser livre de interferentes e não sofrer influência da cor do extrato. Diante da complexidade dos procedimentos para a análise de nitrito e nitrato, da possibilidade de interferência e dos altos limites de detecção que as técnicas clássicas oferecem, faz-se relevante o desenvolvimento e otimização de metodologias analíticas capazes de suprir tais deficiências. A eletroforese capilar tem se mostrado como alternativa atraente para a análise de íons, pois apresenta como vantagens frente aos demais procedimentos, o reduzido volume de amostra necessário para quantificação dos íons, a alta eficiência e precisão, o curto tempo de análise, a baixa exposição do analista a riscos de

5 saúde, rapidez na obtenção dos resultados, alta taxa de amostragem, praticidade da técnica e, muitas vezes, a ausência de qualquer pré-tratamento da amostra antes da injeção do analito. O presente trabalho tem como um dos objetivos, a aplicação da Eletroforese Capilar de Zona sob fluxo invertido, com detecção direta por UV, como técnica alternativa para análise de nitrato e nitrito em amostras de água provenientes de cinco pontos de coleta ao longo do Córrego São Pedro. A Tabela 1 resume alguns trabalhos realizados no período de 1995 a 2005, levando em consideração a composição do eletrólito, o tipo de detecção, o limite de detecção, o tempo de migração e a aplicação das metodologias.

6 TABELA 1: Alguns trabalhos ilustrando o uso da Eletroforese Capilar para análise de Nitrito e Nitrato COMPOSIÇÃO DO ELETRÓLITO TIPO DE DETECÇÃO LIMITE DE DETECÇÃO (µgl -1 TEMPO DE ) MIGRAÇÃO (min) NITRATO NITRITO NITRATO NITRITO APLICAÇÃO REFERÊNCIA 50mM surfactante, 18mM Detecção Direta 41,4µg/L 16,74µg/L 3,85 3,52 material BJERGEGAARD tetraborato de sódio, λ=235nm biológico et al. (1995), 30mM de hidrogenofosfato de sódio e 10% 2-propanol, ph 7. 4,5mM cromato Detecção Indireta UV, λ=254nm ,5 5,5 Água potável OEHRLE (1996), 15 mm tampão sulfato, Detecção Direta 460µg/L 4,0 ± 0,8 3,9 ± 0,8 fluidos BORIES et al. 2,5% modificador de λ=214nm biológicos (1999), fluxo OFM-OH - 25mM fosfato ph 6,8 Detecção Direta UV λ=214nm ,14 4,43 saliva GÁSPAR et al. (2005),

7 ELETROFORESE O fenômeno denominado eletroforese é definido como sendo a migração de espécies carregadas eletricamente, que ocorre quando as mesmas são dissolvidas ou suspensas em um eletrólito, através do qual uma corrente elétrica é aplicada (HEIGER, 1997). Esta técnica de separação foi desenvolvida pelo químico Arne Tiselius para o estudo de proteínas em soro (TISELIUS, 1930) e por este trabalho ele ganhou o prêmio Nobel em Este método, denominado solução livre, era bastante limitado devido à instabilidade do aparelho, e mais significativamente, pelos efeitos de difusão e aquecimento gerados pelo campo elétrico, os quais comprometiam a resolução (a separação) dos compostos. Estes efeitos foram minimizados com a introdução de suporte (gel ou papel) que ajudou a conter o movimento livre dos analitos, de forma que o efeito da difusão fosse diminuído. Entretanto este sistema oferecia um baixo nível de automação, tempos de análise longos e após a separação a detecção era feita visualmente. ELETROFORESE CAPILAR A eletroforese capilar (EC) é uma técnica que foi introduzida em 1981, por Jorgenson e Lukacs (JORGENSON E LUKACS, 1981) e tem sido aceita cada vez mais, como um importante método analítico. Em sua forma mais simples a EC é uma aproximação da técnica original, descrita por Tiselius, porém emprega-se um tubo capilar, preenchido com um eletrólito, conforme o próprio nome sugere. Portanto, é uma técnica de separação baseada na migração diferenciada de compostos neutros, iônicos ou ionizáveis, através de

8 uma solução (eletrólito) contida no interior de um tubo capilar (sílica fundida, teflon), mediante a aplicação de um campo elétrico (BIER, 1959 e DEYL, 1970) APLICAÇÕES A eletroforese capilar (EC) é uma técnica aplicável na determinação de uma grande variedade de amostras, incluindo hidrocarbonetos aromáticos, vitaminas hidro e lipossolúveis, amino ácidos, íons inorgânicos, ácidos orgânicos, fármacos, catecolaminas, substâncias quirais, proteínas, peptídeos e muitos outros. Uma característica que difere a EC das outras técnicas é a sua capacidade única para separar macromoléculas carregadas eletricamente de interesse tanto em indústrias de biotecnologia quanto em pesquisas biológicas. Por exemplo, o projeto Genoma Humano, que foi concluído recentemente, teve como meta obter a seqüência completa do DNA humano e para isso foi necessário distinguir os diversos polinucleotídeos, com massas molares, por volta de 200 a 500 Daltons (Dalton = u.m.a.) que diferiam entre si por um único nucleotídeo. Somente a EC tem resolução suficiente para este tipo de separação. Além disso, o DNA humano contém cerca de 3 bilhões de nucleotídeos e as altas velocidades de análises, obtidas pela EC, permitiram que milhares de nucleotídeos fossem seqüenciados em um único dia (SKOOG, HOLLER E NIEMAN, 1998). INSTRUMENTAÇÃO Geralmente o funcionamento de um equipamento de eletroforese capilar - EC (Figura 1), envolve a aplicação de alta voltagem, tipicamente 5 a 30 kv em um capilar de diâmetro reduzido gerando correntes na faixa de 10 a 100 ma. O

9 uso do capilar apresenta várias vantagens, particularmente com respeito ao aquecimento Joule. Dispositivo para controle da temperatura Caixa de acrílico Aquisição de dados Fonte de alta tensão Capilar Detector Eletrodo Eletrodo Reservatório de entrada Reservatório de saída Figura 1 - Esquema de um equipamento de eletroforese capilar A alta resistência elétrica do capilar permite a aplicação de campos elétricos altos, pois gera um aquecimento mínimo, além disso o formato de capilar propicia uma dissipação eficiente do calor gerado.o uso de campos elétricos altos resulta em tempo de análise curto, alta eficiência e resolução. Na eletroforese capilar, o capilar é preenchido com uma solução tampão e suas extremidades são mergulhadas em recipientes, que contém a solução tampão, e onde é aplicado um campo elétrico, que gera uma corrente no interior do capilar. Os eletrodos são feitos de um material inerte, tal como, platina, e são também mergulhados na solução para fechar o circuito. O capilar passa através de um detector, usualmente um detector espectrofotométrico de absorção no UV/Vis.

10 Uma pequena quantidade de amostra é introduzida em uma das extremidades do capilar. A aplicação do campo elétrico provoca o movimento dos analitos em direção aos eletrodos. As separações em EC são baseadas na presença de um fluxo eletricamente induzido, denominado fluxo eletroosmótico (FEO), um fenômeno eletroforético que gera o fluxo da solução dentro do capilar, que faz com que os solutos se movimentem em direção ao detector. Este fluxo pode reduzir significativamente o tempo de análise ou forçar um íon a reverter a sua tendência de migração em direção a um eletrodo, pelo qual está sendo atraído, devido ao sinal de sua carga. Outros detalhes sobre o FEO serão discutidos mais adiante, em outro ítem. O gráfico, gerado pelo detector, tempo em função de resposta do detector é denominado eletroferograma (Figura 2). P5 2 * * tempo, min Figura 2: Exemplo de eletroferograma, onde 1 nitrito, 2 nitrato, * interferente. Eletrólito: 100mM tampão Tris/HCl, ph8,2; 0,15 mm CTAB. Condições de análise: temperatura 30ºC, 10 segundos * X 50mbar, λ=210nm, voltagem 20kV.

11 CAPILARES Os capilares podem ser de vidro (para l > 280 nm), teflon (flexível, transparente no UV, porém não pode ser usado com alta voltagem), ou sílica fundida, normalmente recoberta externamente com uma camada de proteção de polimida, que produz uma melhora na resistência mecânica, uma vez que é extremamente frágil e se quebra com facilidade. Uma pequena porção deste recobrimento é removida a fim de se formar uma janela para a detecção. A janela é então alinhada ao centro óptico do detector. Os capilares são, tipicamente, de 25 a 100 cm de comprimento com 15 a 100 µm de diâmetro interno. Nos instrumentos disponíveis comercialmente, os capilares são mantidos dentro de um dispositivo, denominado cassete, que facilita a inserção no instrumento e protege a janela delicada de detecção. A superfície interna do capilar pode ser quimicamente modificada por meio de ligação covalente com diferentes substâncias. Estes recobrimentos são utilizados para uma grande variedade de propósitos, tais como, reduzir a adsorção da amostra ou mudar a carga iônica da parede do capilar. O controle de temperatura ao redor do capilar é muito importante para assegurar separações reprodutíveis. O controle é feito geralmente por ar ou líquido refrigerante, os quais são forçados a passar através do cassete, onde se encontra o capilar. INTRODUÇÃO DA AMOSTRA Na EC, diferentemente das técnicas cromatográficas (Cromatografia Gasosa-CG e Cromatografia Líquida de Alta Eficiência-CLAE), a amostra não é injetada e sim introduzida no capilar pelo lado mais distante do detector

12 (SETTLE, 1997). Mesmo não sendo adequada a expressão "injeção", este termo será empregado neste texto por ser o mais freqüentemente utilizado. Volumes típicos de injeção são de 10 a 100 nl. O modo de injeção mais empregado em EC é o denominado hidrodinâmico, onde o capilar é mergulhado em um frasco contendo a amostra o qual é em seguida pressurizado, submetido ao vácuo ou erguido (efeito sifão) provocando a entrada de um certo volume de amostra no capilar. Uma outra alternativa é obtida através da inserção do capilar e do eletrodo no frasco da amostra seguida da aplicação de uma voltagem, sendo que solutos neutros são arrastados pelo FEO, ao passo que solutos carregados irão migrar para dentro do capilar, por causa do FEO e também da migração eletroforética. Este tipo de injeção é denominado de injeção eletrocinética (LI, 1992,GROSSMAN E COLBURN, 1992). DETECTORES O detector mais freqüentemente utilizado em EC é o espectrofotométrico de absorção no UV/Vis devido à sua natureza quase universal, ou seja, pode ser aplicado na detecção de várias classes de substâncias. A maioria dos instrumentos têm também detectores com arranjo de diodos disponíveis, o qual fornece um espectro de UV/Vis para cada substância detectada. Os detectores alternativos estão mostrados na Tabela 2. O acoplamento de EC com espectrômetro de massas é usualmente empregado para dar informações estruturais dos analitos (SETTLE, 1997).

13 Tabela 2. Detectores usados em eletroforese capilar e os seus limites de deteção aproximados Detector Limite de Deteção aproximado (g L -1 ) Absorção no UV-Visível 10-1 Absorção Indireta no UV-Visível 1 Fluorescência 10-3 Fluorescência Indireta 10-2 Fluorescência Induzida por Laser 10-6 Espectrômetro de Massa 10-4 Amperométrico 10-5 Condutividade 10-3 FLUXO ELETROSMÓTICO A parede do capilar de sílica contém grupos silanóis (SiOH) os quais se ionizam (SiO- + H+) quando em contato com soluções tampão com ph altos. Esta dissociação produz uma superfície carregada negativamente. Uma camada de contra-íon (cátions) é então formada próxima à parede do capilar a fim de manter a eletroneutralidade. Isto forma a dupla camada e cria uma diferença de potencial muito próxima à parede e este fenômeno é conhecido como potencial zeta. O potencial zeta é essencialmente determinado pela carga da superfície na parede do capilar (a carga é dependente do ph). Quando uma diferença de potencial (ddp) é aplicada, estes íons metálicos e suas moléculas associadas solvatadas com água migram em direção ao cátodo, Figura 4.

14 Superfície do capilar Plano de IHP OHP cisalhamento camada camada compacta difusa cátodo - solução ânodo Fluxo eletroosmótico (EOF) Figura 4 - Migração dos íons metálicos em direção ao cátodo Este movimento de íons resulta no movimento das espécies em direção ao detector e pode ser considerado como um fluxo eletricamente dirigido. O Nível do FEO é altamente dependente do ph do eletrólito, uma vez que o potencial zeta é governado pela ionização dos grupos silanóis (ácidos) da parede do capilar. Abaixo de ph 4, a ionização dos grupos silanóis é pequena e o FEO não é significante, enquanto que acima de ph 9 os silanóis ficam completamente ionizados e portanto o FEO é alto (Figura 5).

15 Figura 5 - A dependência do fluxo eletroosmótico em função do ph. A magnitude do fluxo eletroosmótico pode ser expressa em termos de velocidade ou mobilidade segundo as equações: em que: V FEO = velocidade do FEO; ε = constante dielétrica; ξ = potencial zeta; η = viscosidade; E= potencial aplicado; µ FEO = mobilidade do FEO. V FEO = (εξ/η)e µ FEO = εξ/η O potencial zeta é também dependente da força iônica da solução tampão. Um aumento da força iônica resulta na compressão da dupla camada e conseqüentemente uma redução do FEO.

16 O potencial zeta é gerado em todo o comprimento do capilar e portanto produz uma velocidade de fluxo uniforme sem gerar pressão. Se fizermos um corte no tubo capilar, como mostrado na Figura 6, verificamos que o perfil do FEO é do tipo plano (plug) e isto tem um efeito benéfico, uma vez que ele não contribui diretamente para o alargamento dos picos, pois as moléculas do soluto se moverão em velocidades muito próximas. Esta é uma grande vantagem da EC quando comparada ao perfil parabólico (fluxo laminar) da CLAE, característico do fluxo induzido por pressão. A solução em fluxo laminar move mais lentamente próximo a parede da coluna e mais rapidamente no centro, resultando em diferentes velocidades do soluto ao longo da coluna. Assim, quanto maior o tempo que o soluto despender para percorrer o leito da coluna mais largo se tornará o perfil do pico. Figura 6 - Perfil do fluxo eletroosmótico, comparado com o do fluxo pressurisado Um outro benefício do FEO é que ele gera o movimento de quase todas as espécies, apesar das cargas, na mesma direção. Sob condições normais (superfície carregada negativamente), o fluxo é do ânodo para o cátodo. Ânions serão conduzidos em direção ao cátodo uma vez que o fluxo gerado pode ser mais que uma ordem de magnitude maior que as mobilidades eletroforéticas.

17 Assim, cátions, neutros e ânions serão eletroferografados em uma mesma corrida, uma vez que eles migram na mesma direção. A Figura 2 mostra este processo. Cátions migram mais rápido, pois sofrem atração pelo cátodo, neutros são arrastados na mesma velocidade do FEO e não são separados e ânions migram mais lentamente uma vez que são atraídos para o ânodo, mas são arrastados pelo FEO em direção ao cátodo. TEMPO DE MIGRAÇÃO E MOBILIDADE O tempo requerido para um composto migrar do início do capilar para o ponto de detecção é chamado tempo de migração, e é dado pelo quociente entre a distância de migração e a velocidade. O tempo de migração e outros parâmetros experimentais podem ser usados para calcular a mobilidade aparente (µa) do soluto usando: µa = l /te = ll/tv µa = µe + µ FEO em que: V = voltagem aplicada; L = comprimento total do capilar; t = tempo de migração; E = campo elétrico; l = comprimento efetivo. Na presença do FEO, a medida da mobilidade é chamada de mobilidade aparente, µa. A mobilidade efetiva, µe, pode ser extraída da mobilidade aparente pela medida do FEO usando um marcador neutro que move com a

18 velocidade igual ao FEO. Exemplos de marcadores neutros incluem dimetilsulfóxido e acetona. Há duas medidas de comprimento no capilar, uma é denominada efetiva e a outra total. O comprimento efetivo é a medida do ponto de injeção até ponto de detecção. Para detecção espectroscópica on-capillary, este comprimento é tipicamente de 5 a 10 cm mais curto que o comprimento total. Para detecção off-capillary, por exemplo por espectrometria de massas, os dois comprimentos são equivalentes. O conhecimento de ambos os comprimentos é importante, uma vez que a mobilidade e o tempo de migração são definidos pelo comprimento efetivo, ao passo que o campo elétrico é definido pelo comprimento total. FONTES DE ALARGAMENTO DOS PICOS A separação na eletroforese é baseada nas diferenças nas mobilidades dos solutos. A diferença necessária para resolver dois solutos é dependente da distância entre os dois solutos. A dispersão, alargamento do pico do soluto, resulta das diferenças na velocidade do soluto, e pode ser definida como a largura do pico na linha de base, w b. Para um pico gaussiano: w b = 4σ em que: σ é o desvio padrão do pico (no tempo, comprimento ou volume). A eficiência, expressa pelo número de pratos, N, pode ser obtida por: N = (l/σ) 2 em que: l = comprimento efetivo do capilar.

19 σ 2 tot = w 2 /5,545 Pode, também, ser relacionado à altura de prato, H, por: H = l/n DIFUSÃO MOLECULAR O efeito que mais contribui para o alargamento do pico é causado pela difusão molecular do soluto ao passar ao longo do capilar (difusão longitudinal). Assim, a eficiência pode ser relacionada à difusão molecular em termos de cromatografia, que é: σ 2 = 2Dt = 2DlL/µ e V sendo: D = coeficiente de difusão do soluto. A partir das equações anteriores, obtém-se uma expressão eletroforética fundamental para o número de pratos: N = µ e Vl/2Dl = µel/2d Da equação acima, a razão para a aplicação de campo elétrico alto é evidente. Isto é devido ao fato que o soluto gasta menos tempo no capilar, quando campo elétrico alto é aplicado, as moléculas têm menos tempo para difundir. Além disso esta equação mostra que moléculas grandes, tais como proteínas e DNA, as quais têm baixo coeficiente de difusão, irão exibir menos dispersão que moléculas pequenas. Os valores de coeficiente de difusão de algumas substâncias estão listados na Tabela 3.

20 Tabela 3. Coeficientes de difusão de algumas substâncias, em água (25 C) Substância D x 10-5 (cm s -1 ) HCl 3,05 NaCl 1,48 Glicina 1,06 Citrato 0,66 Citocromo C 0,11 Hemoglobina (Humana) 0,069 O número de pratos pode ser determinado diretamente no eletroferograma, usando por exemplo: N = 5,54(t/w 1/2 ) 2 sendo: t = tempo de migração; w 1/2 = largura temporal do pico à meia altura AQUECIMENTO JOULE Durante a aplicação da voltagem, e portanto a passagem de corrente pelo capilar, pode ocorrer o aquecimento Joule (formação de gradiente de temperatura). Este aquecimento Joule causa a formação de correntes de convecção dentro do capilar, causando uma mistura das bandas já separadas, resultando na dispersão do pico. Este efeito pode ser minimizado pela aplicação de voltagens adequadas e uso de tampão com concentração mais baixa, aliado a um bom controle de temperatura. FLUXO ELETROOSMÓTICO O FEO, já foi descrito anteriormente, e, em princípio, o perfil plano resulta em um benefício, uma vez que não contribui diretamente para a dispersão das zonas. Entretanto se a amostra interage com a parede do

21 capilar, a eficiência pode ser diminuída devido à deformação do perfil do pico. Para contornar este problema podem ser adicionados modificadores no tampão ou modificar quimicamente a parede do capilar. DETECÇÃO ON-COLUMN Uma das causas do alargamento do pico em CLAE é o volume morto nas conexões, desse modo picos já separados na coluna tornam-se mais dispersos, chegando ao detector mais alargados, se houver volume morto nas conexões, ocorre uma re-mistura dos picos. Isto, não ocorre em EC pois a cela de detecção é localizada no próprio capilar (região sem revestimento). INJEÇÃO DA AMOSTRA Em adição à difusão molecular, uma outra fonte de alargamento do pico é o comprimento do volume de injeção. Um comprimento de poucos milímetros é bastante significativo dado que o comprimento de um capilar pode ser de 25 cm e a janela de detecção de 0,1 mm. Uma maneira de minimizar este problema é dissolver a amostra em um solvente de força iônica menor que a do tampão. Sob estas condições, o campo elétrico é maior na zona da amostra que no resto do capilar. Assim os íons se movem mais rapidamente até atingirem o tampão, onde o campo elétrico é menor, diminuindo portanto a velocidade. Este processo é facilitado quando a amostra é dissolvida em água pura ou em uma solução tampão diluída cerca de 10 vezes MODOS DE SEPARAÇÃO Hoje em dia a eletroforese é um nome genérico dado para uma série de técnicas de separação que envolvem a aplicação de um campo elétrico em um

22 capilar preenchido com uma solução tampão. As bases destas separações estão descritas a seguir (TAVARES, 1997). ELETROFORESE CAPILAR EM SOLUÇÃO LIVRE (ECSL) A separação de íons é a forma mais simples de EC e é denominada eletroforese capilar em solução livre. Muitos compostos podem ser separados rapidamente e facilmente por esta técnica. A separação em ECSL é baseada nas diferenças nas mobilidades eletroforéticas resultantes das diferentes velocidades de migrações de espécies iônicas no tampão, contido dentro do capilar. O mecanismo de separação é baseado nas diferenças na razão massa/carga dos solutos em um dado ph. Na ECSL espécies neutras não são separadas, porém permite a separação de cátions e ânions na mesma corrida. ELETROFORESE CAPILAR EM GEL (ECG) A separação de biomoléculas grandes, tais como DNA, por ECSL, às vezes é muito difícil de se obter devido à similaridade nas razões massa/carga. Assim ECSL muitas vezes não é suficiente para separar estes tipos de substâncias. Uma alternativa é preencher o capilar com um gel, onde o principal mecanismo de separação está baseado nas diferenças nos tamanhos dos solutos que migram através dos poros do polímero. Esta técnica é denominada eletroforese capilar em gel. Íons menores migram mais rapidamente enquanto que solutos maiores ficam mais tempo retidos. Além disso, o gel serve como um meio

23 anticonvectivo, minimizando a difusão dos solutos. Ele também previne a adsorção do soluto nas paredes do capilar e ajuda a eliminar a eletroosmose. Entretanto, o gel deve possuir certas características, tais como, ser estável termicamente e ter uma faixa de tamanho de poros apropriada (dependendo das massas molares dos solutos da amostra), para poder ser um meio eletroforético adequado. Esta técnica está sujeita à limitação de que espécies neutras não migram através do gel, uma vez que o FEO é suprimido. ELETROCROMATOGRAFIA CAPILAR MICELAR (ECCM) A ECCM foi inicialmente desenvolvida para a resolução de compostos neutros, os quais não podem ser separados usando simplesmente a ECSL. As condições de separação envolvem o uso de eletrólitos contendo níveis relativamente altos de surfactantes, tal como dodecilssulfato de sódio (SDS). Acima de uma determinada concentração, denominada de concentração micelar crítica (CMC), as moléculas de surfactante começam a agregar-se, formando micelas. A separação é baseada na partição das moléculas entre a fase micelar (pseudo-fase estacionária) e o tampão aquoso. As micelas de SDS têm carga negativa e migram contra o FEO. Entretanto, o FEO é suficientemente forte para forçar as micelas passarem pelo detector. Espécies carregadas positivamente são retardadas pela associação com micelas carregadas negativamente, moléculas neutras têm uma partição entre as fases micelar e aquosa do tampão e têm uma mobilidade intermediária, enquanto que moléculas carregadas negativamente são repelidas pelas micelas. As separações são conduzidas em ph onde há um FEO apreciável.

24 Solventes orgânicos e reagentes par-iônicos também podem ser adicionados no tampão para ajustar o fator de retenção e seletividade, exatamente como em fase reversa por CLAE. ECCM é especialmente útil para a resolução de solutos neutros insolúveis em água, como por exemplo esteróides. ELETROFORESE CAPILAR COM FOCALIZAÇÃO ISOELÉTRICA (ECFI) Na focalização isoelétrica capilar substâncias anfóteras são separadas com base em seus pontos isoelétricos (ph onde o número de moléculas que migra para o ânodo é igual ao número de moléculas que migra para o cátodo). Esta técnica é baseada na formação de um gradiente de ph, obtido pelo uso de substâncias conhecidas como anfólitos, que são geralmente ácidos poliméricos sintéticos (e.g., poliaminoácidos, ácidos policarboxílicos ou ácidos polissulfônicos). A aplicação de um campo elétrico na mistura de anfólitos gera a formação de um gradiente de ph. Os anfólitos são mantidos em um meio onde se usa um cátodo com ph alto, tipicamente hidróxido de sódio e um ânodo com ph baixo, tipicamente ácido fosfórico. As proteínas, que são anfóteras, irão se comportar de maneira idêntica e serão focalizadas em uma dada posição ditada pelo seu ponto isoelétrico (PI). Neste tipo de separação é necessário um passo adicional, pois os solutos não podem ser detectados in situ, pois quando eles atingem o seu PI eles param de se movimentar dentro do capilar e, portanto não atingem a cela do detector. Este passo pode ser feito de diferentes maneiras. Após a focalização, as zonas podem ser movidas no capilar, em direção ao detector,

25 por meio de pressão, que pode ser obtida por exemplo, elevando-se uma das extremidades do capilar. Alternativamente, após a focalização, a corrente do sistema é baixa pois somente íons OH- e H+ contribuem para a condutividade. Quando um sal, por exemplo cloreto de sódio, é adicionado ao anólito (reservatório ácido) ou ao católito, os íons cloreto irão predominar e irão aumentar a condutividade. Pelo princípio da eletroneutralidade, íons sódio podem ser trocados por prótons no tubo, gerando um gradiente desbalanceado. Isso causa a migração dos íons em direção ao detector. ISOTACOFORESE CAPILAR (IC) A principal diferença entre a isotacoforese e as outras técnicas em CE é que ela é realizada em um sistema de tampão descontínuo. A amostra é condensada entre dois tampões diferentes, um deles possui íons com a mais alta mobilidade no sistema e é denominado dianteiro, e um outro com íons com a mais baixa mobilidade no sistema, que é denominado terminador. Na prática, o reservatório de tampão do lado mais próximo ao detector e o capilar são preenchidos com o eletrólito dianteiro, o outro reservatório é preenchido com o outro eletrólito terminador e a amostra é injetada entre eles. Quando um campo elétrico é aplicado, os componentes da amostra começam a se separar em zonas de acordo com suas mobilidades. Quando um estado de equilíbrio é atingido, os componentes da amostra são separados em zonas que estão em contato umas com as outras, pois não há eletrólito carreador, e todas se movem na mesma velocidade. Nesta técnica o eletroferograma obtido contém uma série de patamares (degraus), onde cada degrau representa uma zona de um analito. Ao contrário

26 dos outros modos de EC, onde a quantidade de amostra presente pode ser determinada pela área do pico, como também em cromatografia, a quantificação em isotacoforese está baseada principalmente na medida do comprimento da zona, que é proporcional à quantidade de substância presente. ANÁLISES QUANTITATIVAS E QUALITATIVAS A análise qualitativa é feita através da comparação dos tempos de migração dos padrões com os tempos de migração das substâncias presentes na amostra e/ou através de espectros de UV/Vis (detector por arranjo de diodos) ou do espectro de massas (detector espectrômetro de massas). A quantificação das substâncias, com concentrações desconhecidas, presentes na amostra, é feita através do procedimento usual de calibração: 1) injeção de soluções dos padrões de concentrações conhecidas; 2) obtenção das respostas do detector para cada composto, em função da altura, área ou área dividida pelo tempo de migração; 3) construção da curva analítica (resposta do detector versus concentração); 4) injeção das amostras; 5) obtenção das respostas do detector para as amostras; 6) quantificação das substâncias através das curvas analíticas. VANTAGENS E LIMITAÇÕES A técnica de eletroforese capilar possui uma série de vantagens, tais como, - rapidez,

27 - versatilidade, - baixo custo por análise, alto poder se separação (resolução) e - consumo mínimo de amostras, reagentes e solventes. Além disso, oferece a possibilidade de automação e detecção on-line. Entretanto esta técnica oferece algumas limitações, pois não é adequada para a determinação de compostos voláteis, não-polares e de massa molar baixa, os quais são melhores determinados por cromatografia gasosa. Também não é muito adequada para a análise de polímeros não iônicos de massa molar alta e não é tão sensível quanto a cromatografia líquida de alta eficiência.

28 COMPOSTOS NITROGENADOS ANALISADOS Antes do desenvolvimento das análises bacteriológicas, as evidências e da contaminação das águas eram determinadas pelas concentrações de nitrogênio nas suas diferentes formas (nitrato, nitrito e nitrogênio amoniacal). Segundo VON SPERLING (1995) as principais características dos compostos nitrogenados são: a) é indispensável para o crescimento de vegetais e organismos em geral, pois é utilizado para síntese de aminoácidos; b) os processos bioquímicos de oxidação do amônio ao nitrito e deste para nitrato implicam o consumo de oxigênio dissolvido do meio, o que pode afetar a vida aquática quando a oxigenação do ambiente é menor que o consumo de oxigênio por esses processos; c) a identificação da forma predominante do nitrogênio pode fornecer informações sobre o estágio de poluição. Assim quando a poluição for recente, o perigo para a saúde será maior, pois nesse caso o nitrogênio se apresenta na forma orgânica e amoniacal, forma mais tóxica. As águas naturais, em geral, contêm nitratos em solução e, além disso, principalmente tratando-se de águas que recebem esgotos, podem conter quantidades variáveis de compostos mais complexos, ou menos oxidados, tais como: compostos orgânicos quaternários, amônia e nitritos. Em geral, a presença destes denuncia a existência de poluição recente, uma vez que essas substâncias são oxidadas rapidamente na água, graças principalmente à presença de bactérias nitrificantes. Por essa razão, constituem um importante índice da presença de despejos orgânicos recentes.

29 NITRITO É uma forma química do nitrogênio normalmente encontrada em quantidades diminutas nas águas superficiais, pois o nitrito é instável na presença do oxigênio, ocorrendo como uma forma intermediária. O íon nitrito pode ser utilizado pelas plantas como uma fonte de nitrogênio. A presença de nitritos em água indica processos biológicos ativos influenciados por poluição orgânica. O nitrogênio na forma de nitrito é o estado intermediário entre amônio e o nitrato, sendo também considerado um nutriente. Em baixas concentrações de oxigênio, pode haver redução do nitrato (denitrificação) parcial, elevando as concentrações de nitrito. Altas concentrações de nitrito podem significar uma grande atividade bacteriana e carência de oxigênio. (BAUMGARTEN e NIENCHESKI, 1995). O Nitrito, um estado intermediário do ciclo do nitrogênio, é formado durante a decomposição da matéria orgânica e prontamente oxidada a nitrato. Esses processos ocorrem em instalações de tratamento de água, sistemas de distribuição de água e águas naturais. Em águas superficiais a presença de nitritos pode indicar a decomposição parcial de matéria orgânica, descarga excessiva oriunda de estação de tratamento de água ou poluição industrial. Em águas poluídas a presença de nitrito pode indicar a presença de bactérias redutoras de nitrato quando as condições presentes são anaeróbias. Concentrações até 0,1 mg/l são inofensivas, já em concentrações entre 0,1 e 0,5 podem provocar danos a certas espécies de peixes. Existe perigo elevado em caso de concentrações superiores a 1 mg/l, pior ainda, se combinado com

30 teores baixos de cloretos e de oxigênio dissolvido, podendo causar metaemoglobinemia, também conhecida como doença do sangue marrom. NITRATO Nitrato é a forma mais completamente oxidada do nitrogênio. Ele é formado durante os estágios finais da decomposição biológica, tanto em estações de tratamento de água como em mananciais de água natural. Sua presença não é estranha, principalmente em águas armazenadas em cisternas em comunidades rurais. Nitratos inorgânicos, assim como o nitrato de amônia, são largamente utilizados como fertilizantes. É a forma mais estável do nitrogênio, sendo um dos principais nutrientes dos produtores primários. É regenerado por via bacteriana a partir do nitrogênio orgânico, que pela decomposição da matéria orgânica se transforma em nitrogênio amoniacal. Portanto, a produção do nitrato resulta da oxidação bacteriana do amônio, tendo o nitrito como intermediário (BAUMGARTEN e POZZA, 2001). O nitrato é um dos íons mais encontrados em águas naturais, geralmente ocorrendo em baixos teores nas águas superficiais, mas podendo atingir altas concentrações em águas profundas (APHA, 1992). O seu consumo através das águas de abastecimento está associado a dois efeitos adversos à saúde: a indução à metaemoglobinemia, especialmente em crianças, e a formação potencial de nitrosaminas e nitrosamidas carcinogênicas (BOUCHARD et al., 1992; AWWA, 1990). É a principal forma de nitrogênio configurado encontrado nas águas. Concentrações de nitratos superiores a 5 mg/l demonstram condições

31 sanitárias inadequadas, pois a principal fonte de Nitrogênio Nitrato são dejetos humanos e animais. Porém a legislação permite o teor de nitrato de até 10 mg/l, para corpos d água de classe 1, 2 e 3. Os nitratos estimulam o desenvolvimento de plantas, sendo que organismos aquáticos, como algas, florescem na presença destes.

32 REALIZAÇÃO DE AULA PRÁTICA OBJETIVO Utilizar a técnica de eletroforese capilar para analisar nitrito e nitrato em diferentes amostras de água. PROCEDIMENTOS 1) Coleta de água As amostras devem ser coletadas em recipiente devidamente limpo e constituído de material polimérico de 50mL. As amostras coletadas, em triplicata, na superfície do corpo d água, ao serem encaninhadas para o laboratório, devem ser devidamente identificadas com etiquetas, contendo o local, data e hora de coleta. Locais de coleta: Córrego São Pedro o Nascente o Represa São Pedro o Área urbanizada Lagoa dos Manacás Água da torneira Água do bebedouro Rio Paraibuna

33 2) Preparo da solução aquosa estoque padrão nitrito e padrão nitrato Após a realização dos cálculos estequiométricos, pesar sal suficiente de nitrato e nitrito de sódio ou potássio para o preparo de solução estoque com a concentração de 100,00 mmol L -1. 3) Preparo da solução aquosa estoque de tampão Tris/HCl (ph 8,20) Após a realização dos cálculos estequiométricos, pesar TRIS (2-amino- 2-(hydroxymethyl)-1,3-propanodiol) e ácido clorídrico, suficientes para o preparo de solução estoque com a concentração de 100,00 mmol L -1. As soluções são obtidas respectivamente da Pharmacia Biotech (Uppsala, Sweden) e da Quimex. A solução estoque deve ser armazenada em frasco de polietileno e mantida sob refrigeração em geladeira. 4) Preparo da solução aquosa estoque do tensoativo aniônico CTAB (brometo de cetiltrimetilamônio) Após a realização dos cálculos estequiométricos, pesar brometo de cetiltrimetilamônio (obtido da Sigma-Aldrich (Steinheim, Germany)) suficiente para o preparo de solução estoque com a concentração de 15,00 mmol L -1, com ph 8. A solução estoque deve ser armazenada em frasco de polietileno a temperatura ambiente. 5) Preparo da solução tampão Em um balão volumétrico de 10mL adicionar 5mL da solução aquosa estoque de tampão Tris-HCl e 150µL da solução estoque CTAB (brometo de cetiltrimetilamônio) e completar o volume com água destilada.

34 6) Preparo da solução padrão nitrito/nitrato (100 µg L -1 ) Em um balão volumétrico de 10mL adicionar 100µL da solução aquosa estoque do padrão de nitrito e nitrato e completar o volume com água destilada. 7) Preparo do vials Identificação dos vials Preenchimento dos vials com as devidas soluções (amostras, padrões, soluções para condicionamento do capilar, água para limpeza e lixo) solução Nº de vials volume NaOH 1 1,0 ml H 2 O 2 1,0 ml Lixo soda 3 1,0 ml Lixo tampão 4 vazio Eletrólito flush 5 1,0 ml Eletrólito voltagem 6 1,0 ml Eletrólito voltagem 7 1,0 ml Padrões 100µL P + 900µL H 2 O Amostra (A) 3 de cada 100µL H 2 O + 900µL A Amostra+Padrão 3 de cada 100µL P + 900µL A 8) Montagem do cartucho com o capilar Inserir com cuidado o capilar no cartucho (orientação do estagiário) 9) Limpeza dos eletrodos do aparelho de eletroforese capilar Retirar os eletrodos do aparelho (orientação do estagiário) Lavar com água e sabão Levar ao aparelho de limpeza ultrassônica, mergulhados em álcool isopropílico, por quinze minutos. Lavar com água destilada Esperar secar

35 10) Preparação do aparelho Inserção dos eletrodos (orientação do estagiário) Inserção do cartucho com o capilar (orientação do estagiário) Inserção dos vials 9) Uso do aparelho de Eletroforese Capilar Condicionamento do capilar o 5 minutos de solução aquosa de NaOH 1,00 mol L -1 o 5 minutos de água destilada o 15 minutos da solução tampão Preparação da seqüência de análise o Criar um arquivo no computador acoplado ao aparelho de EC, contendo a seqüência a ser analisada 10) Obtenção dos arquivos com os eletroferogramas gerados 11) Integração dos picos para quantificação dos nutrientes 12) Cálculo de recuperação da amostra Calcular a porcentagem de recuperação de cada amostra através da fórmula: Recuperação (%) = (Amostra + padrão) Amostra X 100 Padrão

36 BIBLIOGRAFIA CONSULTADA ANDERSON, K.A.; CASE, T.E. Evaluation of plant nitrate extraction techniques and effect on commonly used analytical methods of detection. Communications in Soil Science and Plant Analysis, v.30, p , BJERGEGAARD, C.; MOILER, P.; S0RENSEN, H. Determination of thiocyanate, iodide, nitrate and nitrite in biological samples by micellar electrokinetic capillary chromatography Journal of Chromatography, BORIES, P. N., SCHERMAN, E., DZIEDZIC, L. Analysis of Nitrite and Nitrate in Biological Fluids by Capillary Electrophoresis. Clinical Biochemistry, Vol. 32, N o 1, BRASIL Ministério da Agricultura e do Abastecimento. Secretaria de Defesa Agropecuária. Oficializa os métodos analíticos físico-químicos para controle de produtos cárneos e seus ingredientes. Instrução Normativa n. 20, de 21 de julho de Diário Oficial da República Federativa do Brasil, Poder Executivo, Brasília, 09 set Seção 1, p.30. FOLLETT, M.J.; RATCLIFF, P.W. Determination of nitrite and nitrate in meat products. Journal of the Science of Food and Agriculture, v.14, p , GROSSMAN, P. D. E COLBURN. J. C., Capillary Electrophoresis. Theory and Practice, Academic Press Inc., San Diego - California, GUOZHEN, P.; QINGI, X.; MEI, F.; Microchem. J HEIGER, D. N., High Performance Capillary Electrophoresis, Hewlett Packard Company, Publication Number E, JORGENSON, J. W. E LUKACS K. D., Zone Electrophoresis in Open-tubular Glass Cappilaries, Anal. Chem., LARA, W.H.; TAKAHASHI, M.Y.; SILVEIRA, N. Determinação de nitritos e nitratos em conservas de carne. Revista do Instituto Adolfo Lutz, v.38, p , LI, S. F. Y., Capillary Electrophoresis. Principles, Practice and Applications. Journal of Chromatography Library, MARSHALL, P. A.; TRENERRY, V. C. The determination of nitrite and nitrate in foods by capillary ion electrophoresis Food Chemistry, Vol. 51, No. 2, Elsevier, MIKUSKA, P.; VECERA, Z.; Anal. Chim. Acta, 2003.

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