Electroforese de proteínas plasmáticas

Transcrição

1 6ª aula prática Electroforese de proteínas plasmáticas 1º Ano, Turma 6 Bioquímica I FMUC

2 Objectivos Análise qualitativa de proteínas plasmáticas (separação por electroforese) Compreender a utilidade deste teste Identificar e interpretar alterações ao proteinograma normal.

3 A electroforese é um método de separação (por migração diferencial), identificação e quantificação dos constituintes de uma fase sólida com carga, em suspensão numa fase líquida tamponada, onde se aplica um campo eléctrico contínuo Princípio fundamental Partículas carregadas positivamente(catiões) Partículas carregadas negativamente(aniões) eléctrodo de sinal negativo (cátodo) eléctrodo de sinal positivo (ânodo)

4 As proteínas apresentam carácter anfotérico, devido à existência de grupos ácidos (COOH) e grupos básicos (NH 2 ) em cada aminoácido. Assim, a sua carga eléctrica depende do ph do meio. ph > PI proteína com carga negativa, migra para o ânodo (+) ph < PI proteína com carga positiva, migra para o cátodo ( ) ph = PI proteína com carga nula, não sofre migração

5 Carga eléctrica mobilidade electroforética (velocidade de migração das proteínas) Peso molecular A deslocação das partículas é ainda influenciada por: Viscosidade Constante dieléctrica Força iónica do meio (n.º de iões do meio) Temperatura ph Nota A solução tampão é importante numa electroforese para manter constantes a força iónica do meio e o ph, de modo a que todas as proteínas da amostra tivessem a mesma carga.

6 Tipos de electroforese I Electroforese livre, em meio líquido II Electroforese de zona ou de suporte, sob diversos materiais de suporte Papel de filtro Agarose Acetato de celulose Gel de amido Poliacrilamida

7 II Electroforese de zona ou de suporte 3 Fases 1) Separação das diferentes fracções proteicas (electroforese propriamente dita); 2) Revelação (fixação, coloração e lavagem dos meios de suporte). Neste caso como são apenas cadeias peptídicas, utiliza-se um corante específico, o Ponceau S; 3) Leitura avaliação quantitativa das diversas fracções, por leitura num densitómetro a um determinado comprimento de onda.

8 Papel de filtro saturado com tampão + - Folha de acetato/celulose impregnada com tampão Ânodo Amostra de soro Cátodo Electroforese Folha de celulose e acetato Densitometria Electroforese de zona ou de suporte

9 Proteinograma Electroforético Normal 5 zonas de migração/bandas A mais intensa corresponde à albumina peso molecular e carga eléctrica negativa As seguintes correspondem, respectivamente, às globulinas α1, α2, β e γ.

10 Electroforese de proteínas plasmáticas Proteinograma soro, normal Fonte:

11 Proteinograma Electroforético Normal A cada banda do proteinograma corresponde a um pico, cuja altura é directamente proporcional à intensidade da coloração e cujo integral da sua superfície é proporcional à quantidade relativa. A coloração apresentada pelas bandas das diversas proteínas traduz a sua abundância no soro humano. Mais intensa a coloração + abundante a proteína no soro humano Por isso, através da observação da coloração das diferentes bandas já podem ser diagnosticadas algumas anomalias

12 Valores normais das proteínas do soro plasmático e suas proporções Grupo Valores Normais Albumina 4,5 g/dl (64,3%) 4,0 5,2 g/dl (57,1 74,3 %) Globulinas 2,5 g/dl (35,7 %) α1 0,31 g/dl (4,4%) α2 0,48 g/dl (6,9%) β 0,81 g/dl (11,6 %) γ 0,90 g/dl (12,9%) 1,9 2,7 g/dl (27,1 38,6%) 0,2 0,4 g/dl (2,9 5,7%) 0,4 0,7 g/dl (5,7 10,0%) 0,7 0,9 g/dl (10,0 12,9%) 0,7 1,4 g/dl (10,0 20,0%) Razão Albumina / Globulina: 1,8 (1,4 a 2,7) Proteina total: 6,0 8,0 g/dl (média 7 g/dl)

13 Aplicação clínica da Electroforese Os fluidos biológicos são uma mistura heterogénea de proteínas electroforese aplicada ao estudo de proteínas séricas, da urina, do líquido céfalo-raquídeo, lipoproteínas e glicoproteínas séricas. Exame requisitado frequentemente na prática clínica diária, devido: Valor no auxílio do diagnóstico de várias doenças Avaliação do estado funcional do doente As alterações do proteinograma sérico devem-se a: Perda de uma determinada fracção proteica Excesso de produção de algumas fracções proteicas Produção anormal de algumas proteínas Doenças neoplásicas, metabólicas e infecciosas

14 Procedimento Separação das diferentes fracções proteicas 1. Mergulhámos tiras de acetato em tampão, durante umas horas(pelo menos 2h). 2. Colocámos 500 ml de tampão frio em cada um dos compartimentos da tina de electroforese. Ligámos durante 15 minutos a 200V para estabilizar. 3. Enchemos os poços do porta amostras com o soro a analisar. 4. Retirámos e enxugámos as folhas de acetato entre duas folhas de papel de filtro e colocámo-las nas pontes respectivas. 5. Mergulhámos os aplicadores nas amostras e fizemos uma aplicação prévia sobre o papel de filtro para verificar o bom funcionamento do aplicador. 6. Mergulhámos de novo os aplicadores nas amostras e aplicamos sobre o acetato deixando permanecer durante, aproximadamente, 10 segundos. 7. Introduzimos as pontes com as tiras na tina, verificámos a voltagem (200V) e deixámos correr durante 50 minutos.

15 Procedimento Revelação e Leitura 8. Retirámos as tiras de electroforese, cortámos as pontas do acetato e corámos em Ponceau S a 0,5% (em TCA a 5%) durante 6 minutos. 9. Lavámos em dois banhos sucessivos de ácido acético a 5% até o acetato ficar branco. 10. Desidratámos em metanol durante cerca de 4 minutos. 11. Retirámos as tiras do metanol, deixámo-las ao ar uns segundos e colocámos em solução diafanizadora durante 5 minutos. 12. Escorremos as tiras e aplicámo-las sobre lâminas de vidro cuidadosamente lavadas com álcool e secas. 13. Secámos em estufa a 50-60º C durante, aproximadamente, 10 minutos. 14. As tiras seriam depois lidas em densitómetro a 525nm.

16 Resultados

17 Resultados ânodo cátodo Alb. α 1 α 2 β γ Sentido da migração

18 Discussão No proteinograma obtido podem ser observadas 5 zonas de migração ou bandas que correspondem à albumina e às globulinas α1, α2, β e γ Verificou-se uma migração do pólo negativo (cátodo) para o positivo (ânodo), pois as proteínas foram colocadas num meio com ph básico (8.6) > PI (PI albumina=4.5; PI γ-globulina=7.5), logo ficam carregadas negativamente, migrando para o ânodo.

19 Discussão A coloração apresentada pelas bandas das diversas proteínas traduz a sua abundância no soro humano: Quanto mais intensa for a coloração, mais abundante é a proteína no soro humano. A banda que apresenta a coloração mais intensa é a correspondente à albumina, seguida da globulina γ, β, α2 e α1 está de acordo com a abundância no sangue A observação da coloração das diferentes bandas é um auxiliar de diagnóstico, dado que permite detectar anomalias nos valores destas fracções proteicas no soro (Ex: diagnóstico da cirrose hepática: diminuição da albumina, aumento das gamaglobulinas).

20 Discussão A distância de migração em relação ao ponto de aplicação expressa a mobilidade electroforética que depende dos factores já referidos. A banda cuja distância ao ponto de aplicação é maior, corresponde à proteína que apresenta menor peso molecular e que está carregada mais negativamente (albumina), ou seja migrou mais rapidamente. Imediatamente a seguir à banda da albumina encontram-se as bandas das globulinas α1, α2, β e γ, respectivamente (ordem crescente de peso molecular e decrescente de carga negativa). A globulina γ é aquela que apresenta maior peso molecular e a que está carregada menos negativamente por isso migra menos.

21 Num meio dotado de corrente contínua, as proteínas migram em função da carga, e de diversos factores, parando em diferentes zonas, obtendose uma separação na forma de bandas. A carga eléctrica característica de cada proteína determina o local até onde conseguem migrar definindo a sua posição no suporte de acetato de celulose. Quanto menor for a carga negativa aliada a cada proteína, menor vai ser a sua migração para o pólo positivo. A velocidade de migração é: Conclusão directamente proporcional à sua carga eléctrica inversamente proporcional ao seu peso molecular também depende de outros factores como a força iónica do meio e a temperatura embora os mais determinantes sejam os dois já referidos em cima.