Cromatografia líquida de alta eficiência

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1 Cromatografia líquida de alta eficiência

2 O que é cromatografia líquida? A cromatografia fundamenta-se na migração diferencial dos componentes de uma mistura, o que ocorre devido a diferentes interações entre duas fases imiscíveis, sendo uma fase fixa que tem uma grande área superficial chamada fase estacionária, e a outra um fluido que se move através da fase estacionária sendo chamada de fase móvel. Na cromatografia líquida a fase móvel é líquida! (LANÇAS, 1993; DEGANI; CASS; VIEIRA, 1998).

3 Principio da cromatografia líquida AMOSTRA SOLVENTE Coluna contendo fase estacionária. Ação da gravidade! Tempo

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5 Tipos de cromatografia líquida: CROMATOGRAFIA LÍQUIDA PLANAR COLUNA CCD CP HPLC CONVENCIONAL ADOSRÇÃO PARTIÇÃO IÔNICA EXCLUSÃO

6 Primeiro, o que é HPLC? HPLC É uma abreviação do nome em inglês : High Performance (Pressure) Liquid Cromatography. Historia da HPLC: - Década de 60 : O começo da HPLC como High pressure LC! - Década de 70 : Com a melhora do material da coluna e da instrumentação, HPLC passa a ser High Performance LC! - Década de 80: A partir dessa década houve um boom do HPLC Evolução da técnica: UPLC, RRLC, UFLC...

7 Vantagens da HPLC FE é utilizada inúmeras vezes. Versatilidade: Único requisito é a solubilidade na FM. Tempo reduzido de análise. Alta resolução. Análise qualitativa: t R, espectro de absorção no UV (DAD), MS. Análise quantitativa: desvios menores do que 5%. Boa detectabilidade: Absorção de UV-Vis de comprimento de onda variável g; Fluorescência: g; Automatização

8 Limitações da HPLC Alto custo do instrumento Alto custo de manutenção Alto custo de operação Falta de detector universal sensível Índice de refração: baixa detectabilidade (10-6 g), pouco estável. Espectrômetro de massas: ~US$ ,00 Necessidade de experiência no seu manuseio

9 Como é um HPLC comercial? Reservatórios dos solventes e sistema de degaseificação. Bomba. Injetor. Coluna. Detector.

10 Instrumentação para HPLC

11 Instrumentação para HPLC

12 Reservatório para a fase móvel Filtro do reservatório : Captar a fase móvel e evitar que partículas suspensas na FM obstruam os capilares ou contaminem a bomba. Filtros de 10 a 40 um Limpeza periódica!!

13 Características da fase móvel Ser de alto grau de pureza ou fácil purificação Dissolver a amostra sem decompor seus componentes Não decompor ou dissolver a fase estacionária Ter baixa viscosidade Compatível com o tipo de detector Polaridade adequada para permitir a separação dos componentes da amostra. Degaseificação da FM: Garanti a reprodutibilidade da vazão Estabilidade da linha base.

14 Métodos de degaseificação Ultrassom: Muito lento, pouco eficiente, requer agitação, em geral o pior método quando usado sozinho Vácuo + ultrassom: Rápido, eficiente, refazer a cada 12 hrs. Purga com Hélio: Contínuo, hélio é razoavelmente caro, leva a aumento de vazamentos, maior custo operacional. Degaseificador on-line: Contínuo, remove o ar logo antes de entrar na bomba, investimento alto inicial (melhor opção a longo prazo)

15 Instrumentação para HPLC

16 Sistema de bombeamento Têm por finalidade enviar um fluxo constante e reprodutível de FM para o sistema cromatográfico REQUISITOS: Ser de material inerte Pressões de até 6000 psi (~400 atm) Vazão contínua, sem pulsos (ou, se pulsando, com amortecedor de pulsos) Vazões de 0,1 a 10 ml/min (aplicações analíticas) Controle de vazão e reprodutibilidade melhor que 1 %

17 Sistema de bombeamento Tipos de bombas: Pneumática Deslocamento Recíproca

18 Bomba pneumática Vantagens: Baixo custo Livre de pulsações Desvantagens: Baixa pressão (até 2000 psi) Baixo volume Não permite gradiente Vazão depende da pressão de retorno e viscosidade da fase móvel

19 Bomba de deslocamento Vantagens: Vazão independe da pressão de retorno e viscosidade da fase móvel Livre de pulsações Desvantagens: Baixo volume Não permite gradiente

20 Bomba recíproca Vantagens: Pressão elevada (até psi) Pequeno volume interno (35 a 400 µl) Permite gradiente Desvantagem: Fluxo pulsado Alto custo

21 Sistema de bombeamento Isocrático : + A composição da fase móvel permanece constante ao longo da análise. + Capaz de separa um número limitado de analitos. Gradiente + A composição da fase móvel varia durante a análise. + Sistema aplicado com a polaridade dos compostos presentes na amostra, é muito diferente. + Separação de amostras complexas.

22 Separação isocrática e por gradiente A eluição isocrática é feita com um único solvente (ou mistura de solventes). Se um solvente não propiciar uma eluição suficientemente rápida de todos os componentes, então pode ser utilizada uma eluição por gradiente.

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26 Com base nas eluições isocráticas foi elaborado o gradiente a seguir.

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28 Instrumentação para HPLC

29 Sistema de Injeção INJEÇÃO MANUAL - As amostras são introduzidas com seringas. - Após virar a alça, a amostra é carregada pela fase móvel até o início da coluna. AMOSTRADOR AUTOMÁTICO - As amostras são postas em um frasco localizado dentro do amostrador. - O amostrador automático : 1- Mede o volume correto para injeção. 2- Injeta a amostra. 3 Prepara o injetor para uma próxima amostra

30 LOAD Sistema de Injeção Injetor Rheodyne Diagrama de fluxo Bomba Coluna Bomba Coluna

31 Sobrecarga de Volume da amostra Para aproveitar de todos os pratos que uma colina possui, não se deve injetar um volume maior que 1% do volume da coluna vazia. V max (µl)=π(raio) 2 (comprimento)(0,01)

32 Instrumentação para HPLC

33 Coluna Geralmente em aço inox ( mais popular, maior pressão) + Coluna de vidro reforçado (até 600 psi, utilizada para biomoleculas) + PEEK polímero ( biocompatível e quimicamente inerte com a maioria dos solventes) + Preço: > US$ Tipos de colunas + Analíticas : diâmetro interno (i.d) 1,0-4,6 mm, comprimento mm. + Preparativas: i.d 4,6 mm, comprimento mm. A escolha de uma coluna apropriada é o ponto crítico para o sucesso da análise.

34 Pré-coluna Localizada entre o injetor e a coluna Colunas de 2 a 5 cm, i.d igual ao da coluna. Mesma FE da coluna de separação. Protege a coluna Custo reduzido Pré-coluna!

35 Coluna Fase estacionária. + As colunas são recheadas com partículas porosas com diâmetro de 1,8 5 μm. + Estas partículas porosas na coluna têm geralmente uma fase ligada quimicamente sobre a sua superfície, que interage com os componentes da amostra para separá-los um do outro.

36 Condicionamento da Coluna Necessário para que haja um perfeito equilíbrio da FM e da FE. Coluna nova: 4-8 horas Coluna parada há alguns dias: 2 horas Coluna de uso diário: 15 minutos. Lembre-se: a coluna deve ser guardada em solvente orgânico.

37 LC com fase quimicamente ligada

38 Síntese da FE.

39 Modos de HPLC HPLC Adsorção Partição Iônica Exclusão

40 Tipos de cromatografia líquida: Adsorção: O mecanismo de separação: competição entre moléculas da amostra e da fase móvel em ocupar os sítios ativos da fase estacionária, sólido. (Sílica) Fase estacionária (polar) é afetada com frequência pela retenção de moléculas de alta polaridade como álcoois, água. Partição: (CLL ou CFL) CLL: O mecanismo de separação: baseia-se nas diferentes solubilidades que apresentam os componentes da amostra na fase móvel e na fase estacionária.(sílica purificada) O maior inconveniente desta técnica é a solubilidade da fase estacionária na fase móvel. CFL: A fase estacionária está imobilizada por meio de ligações químicas. (Normal ou Reversa)

41 Fase normal x Fase reversa Fase normal: fase estacionária polar; fase móvel apolar (n-alcanos, clorofórmio, acetato de etila); solutos neutros; polaridade soluto t. retenção; mecanismo retenção: adsorção Fase reversa: fase estacionária apolar; fase móvel polar (tampões, água, metanol, acetonitrila, THF); solutos apolares, não-iônicos; polaridade f. móvel t. retenção; mecanismo retenção: interações apolares com radicais da coluna.

42 Fase Normal Si-OH + R 3 SiCl Si-O-Si-(CH 3 ) 2 R + HCl OH Si silanol livre R = Ciano (-C 2 H 4 CN) Diol (-C 3 H 6 OCH 2 CHOHCH 2 OH) Amina ( C 3 H 6 NH 2 )

43 Polaridade da fase móvel CROMATOGRAFIA DE FASE NORMAL Polaridade do soluto: a > b > c c b a tempo c b a Nos trabalhos pioneiros usou-se fases altamente polares, como água e trietilenoglicol adsorvidos sobre sílica ou alumina e solventes apolares, como hexano ou éter isopropílico, eram usados como fase móvel; por razões históricas, este tipo de cromatografia é chamado de fase normal tempo Em fase normal, o componente menos polar elui primeiro, devido a sua maior solubilidade na fase móvel; aumentando a polaridade da fase móvel tem o efeito de diminuir o tempo de eluição

44 Fase reversa

45 Polaridade da fase móvel CROMATOGRAFIA DE FASE REVERSA Polaridade do soluto: a > b > c a b c Na cromatografia de fase reversa, a fase estacionária é apolar, um hidrocarboneto por exemplo (C18), e a fase móvel é relativamente polar (água, metanol, acetonitrila, etc) tempo a b c tempo Em fase reversa, o componente mais polar elui primeiro, devido a sua maior solubilidade na fase móvel; aumentando-se a polaridade da fase móvel aumenta-se o tempo de eluição

46 Efeito do comprimento da cadeia na retenção.

47 Tipos de cromatografia líquida: Iônica: A fase estacionária é, normalmente, uma resina de poliestireno e divinilbenzeno, a qual são ligados grupos iônicos, como por exemplo, -SO - 3 trocadores fortes de cátion -CO - 2 trocadores fracos de cátion -NR + 3 trocadores fortes de ânions -NH 2 R + trocadores fracos de ânions Os grupos iônicos têm um contra-íon (com carga oposta) que pode ser deslocado pelos íons da fase móvel de carga similar a ele. Exclusão: A separação é efetuada de acordo com o tamanho efetivo das moléculas. A coluna é recheada com matéria inerte cujos poros têm tamanho controlado. Onde, as moléculas menores penetram a maioria dos poros.

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49 Instrumentação para HPLC

50 Características de um detector Sensibilidade e seletividade adequada Ampla faixa linear Baixo volume interno Resposta Rápida Boa estabilidade e reprodutibilidade Não destruir a amostra

51 Características de um detector Baixo volume interno O volume do detector é a região do fluxo cromatográfico ao qual o detector responde. Grande volume alargamento dos picos registrados. Resposta Rápida O sistema de detecção deve idealmente apresentar um sinal que represente um exato instante de uma porção do caminho (volume do detector). Detector lento picos deformados (baixo e largo) e com cauda longa.

52 Características de um detector Boa estabilidade e reprodutibilidade Alta confiabilidade e facilidade de uso Não destruir a amostra para: Permite coletar o eluato Utilizar um segundo tipo de detector

53 Detector por espectrofotometria UVvisível Um feixe de luz ultravioleta é dirigido através de uma célula de fluxo e um sensor mede a luz que passa através da célula. Quando um composto que absorve a energia da luz elui da coluna, ocorrerá uma alteração na quantidade de energia que incide sobre o sensor. Essa alteração da quantidade de energia é amplificada sistema de registro de dados. e dirigida para um Como resposta, um espectro de UV é obtido, o que pode ajudar na identificação de alguns compostos.

54 Detector por espectrofotometria UVvisível

55 Detector por espectrofotometria UV-visível

56 Detector por arranjo de diodos

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58 Detector por arranjo de diodos

59 Detector por espectrofotometria UVvisível Princípio de operação tipo Min. quanti. detectável (g/ml) Sensib. a temperatura Sensib. a vazão da f. móvel Útil com gradientes Aplicabilidade Absorvância de luz na faixa UV-visível Seletivo, depende de propriedades do composto 10-9 Baixa Não Sim Compostos que absorvem no selecionado

60 Detector por fluorescência Em comparação com detectores de UV-Vis, os detectores de fluorescência oferecem uma maior sensibilidade e seletividade, que permite quantificar e identificar compostos e impurezas em matrizes complexas em níveis extremamente baixos. Os detectores de fluorescência detectam apenas substâncias que apresentam fluorescência.

61 Detector por fluorescência

62 Detector por fluorescência Princípio de operação tipo Excitação com luz produz emissão fluorescente Altamente seletivo Min. quanti. detetável (g/ml) 10-9 (excitação a laser: ) Sensib. a temperatura Sensib. a vazão da f. móvel Útil com gradientes Aplicabilidade Baixa Não Sim Compostos ou derivados que fluorescem

63 Detector por índice de refração A capacidade de um composto ou solvente para desviar a luz, fornece uma maneira de detectá-lo. O IR é uma medida da capacidade de uma molécula em desviar a luz em uma fase líquida. A quantidade de deflexão é proporcional à concentração. O detector IR é considerado universal porém, pouco sensível e sofre com a variação da temperatura.

64 Detector por índice de refração

65 Detector por índice de refração Princípio de operação tipo Mudança no índice de refração da fase móvel Universal, depende de propriedade da f. móvel Min. quanti. detetável (g/ml) 10-7 Sensib. a temperatura Sensib. a vazão da f. móvel Útil com gradientes Aplicabilidade alta Não Não Geral

66 Detector eletroquímico Princípio de operação tipo Oxidação ou redução em potencial fixo Seletivo, depende de propriedades do composto Min. quanti. detetável (g/ml) Sensib. a temperatura Sensib. a vazão da f. móvel Útil com gradientes Aplicabilidade Média Sim Não Espécies que oxidam ou reduzem

67 Detector por condutividade elétrica

68 Detector por condutividade elétrica Princípio de operação tipo Condutividade elétrica devida a presença de íons Seletivo, depende de propriedades do composto Min. quanti. detetável (g/ml) 10-8 Sensib. a temperatura Sensib. a vazão da f. móvel Útil com gradientes Aplicabilidade Média Sim Não Soluções aquosas com compostos iônicos

69 E aqui termina a aula,!!!!!

70 Referências bibliográficas SKOOG, D. A., HOLLER, F. J., NIEMAN, T. A. Princípios de análise instrumental. 5ª. Ed., COLLINS, C. H., BRAGA, G. L., BONATO, P. S. Introdução a métodos cromatográficos. WESTON, A., BROWN, P. R. HPLC and CE - principles and practice

71 massa molecular ESCOPO DA CROMATOGRAFIA A LÍQUIDO espécies MM>10 4 : cromatografia por exclusão espécies iônicas de baixa MM: cromatografia por troca iônica espécies pequenas e polares, mas não-iônicas: métodos de partição (série homóloga) espécies não-polares: cromatografia por adsorção (isômeros estruturais, hidrocarbonetos alifáticos) Figura 28-1 Skoog p642 vp ADSORÇÃO POLARIDADE DO SOLUTO insolúvel em água não-polar permeação em gel polar não-iônico PARTIÇÃO fase reversa fase normal EXCLUSÃO solúvel em água iônico filtração em gel TROCA IÔNICA aplicações

72 HPLC x GC Comparação entre as características de GC e HPLC Fator GC HPLC Requisito p/ amostra volátil e termicamente estável solúvel na fase móvel Tipos de amostra gases, líquido e sólidos líquidos e sólidos Quantidade mínima detectável g (ECD) 10-9 g (UV) Tempo de análise minutos até poucas horas minutos até muitas horas Pratos teóricos por coluna Capacidade analítica até 200 componentes até 50 componentes Tempo de treinamento do operador cerca de 3 meses pelo menos 6 meses

73 (a) (b) (c) (d)