O que é uma separação?
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- Irene Damásio Aveiro
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1 Universidade de São Paulo Instituto de Química de São Carlos Departamento de Química e Física Molecular Cromatografia: - Introdução - Cromatografia planar Álvaro José dos Santos Neto CROMA-IQSC O que é uma separação? COMPLETA PARCIAL 1
2 CROMATOGRAFIA Histórico M. TSWEET (1906 primeira publicação com o termo): Separação de misturas de pigmentos vegetais em colunas preenchidas com adsorventes sólidos e arrastados por éter de petróleo. éter de petróleo mistura de pigmentos CaCO 3 pigmentos separados Cromatografia = kroma [cor] + graph [escrever] (grego) O processo cromatográfico de separação? 2
3 DEFINIÇÃO Processo físico-químico que permite a separação de componentes de uma mistura, através da distribuição destes componentes em duas fases, que estão em contato íntimo. Fase móvel (líquido, gás ou fluido supercrítico), a qual passa em contato com a fase estacionária. Fase estacionária, a qual é fixa na coluna ou em uma superfície sólida. Os componentes que são fortemente retidos pela fase estacionária movem-se mais lentamente no sentido de deslocamento da fase móvel. Em contraste, os componentes que interagem fracamente com a fase estacionária movem-se mais rapidamente. Como conseqüência dessas migrações diferenciadas, os vários componentes da mistura se separam em bandas discretas e podem ser analisados qualitativamente ou quantitativamente. CLASSIFICAÇÃO Vários critérios são usados para a classificação das diferentes modalidades de cromatografia; em geral são relacionados com a técnica empregada, o mecanismo de separação e o tipo de fases utilizado. A forma física do sistema define a técnica: a fase estacionária pode ser colocada em um tubo cilíndrico (cromatografia em coluna), ou disposta sobre uma superfície planar (cromatografia planar). 3
4 CLASSIFICAÇÕES DA CROMATOGRAFIA CRITÉRIO DE CLASSIFICAÇÃO: FORMA FÍSICA PLANAR CROMATOGRAFIA COLUNA preparativa: 5-30 mm analítica: 2-5 mm microdiâmetro: < 2 mm FASE MÓVEL LÍQUIDO GÁS FLUIDO SUPERCRÍTICO LÍQUIDO FASE ESTACIONÁRIA LÍQUIDO SÓLIDO FASE LIGADA LÍQUIDO SÓLIDO FASE LIGADA SÓLIDO FASE LIGADA LÍQUIDO SÓLIDO EXCLUSÃO FASE LIGADA TROCA IÔNICA BIO AFINIDADE TIPO DE CROMATOGRAFIA MECANISMO DE SEPARAÇÃO CP CCD CCD CGL CGS CGFL CSS CSFL CLL CLS CE CLFL CTI CB (TLC)(HPTLC) (GC) (SFC) (HPLC (HPLC FN) FR) P A A/P P A A/P A A/P P A M A/P Q Q (Partição (Adsorção) (Mecânico) (Químico) Absorção) Partição / Absorção 4
5 Adsorção Exclusão 5
6 Troca Iônica (Bio)Afinidade 6
7 Cromatografia Planar CROMATOGRAFIA PLANAR CROMATOGRAFIA EM CAMADA DELGADA TLC (CCD) CROMATOGRAFIA EM PAPEL PC (CP) 7
8 CROMATOGRAFIA PLANAR Fator de retenção (retardamento): linha de chegada da fase móvel R f = d M d S d S d M1 d M2 d M3 linha de partida da fase móvel profundidade da fase móvel A cromatografia em camada delgada Desenvolvimento da separação Cálculo do fator de retenção 8
9 A cromatografia em camada delgada Barata e acessível Simples para comparações qualitativas Diversas amostras simultâneas Boa para triagem Bandas alargadas Relativamente lenta Difícil de automatizar Difícil de acoplar com espectrometria de massas O procedimento: passo a passo 9
10 O procedimento: passo a passo O procedimento: passo a passo Separação de alguns pigmentos carotenóides e clorofilas 10
11 O procedimento: passo a passo Observação direta Revelação química Observação sob radiação UV O meio de separação e a fase móvel Corpo da partícula de sílica Fase móvel: * Mistura de solventes pouco polares com solventes mais polares * + polar = + forte Ordem de eluição: * Menos polares > mais polares FASE ESTACIONÁRIA 11
12 A cromatografia em papel A cromatografia em papel Separação de alguns pigmentos de tintas 12
13 O meio de separação e a fase móvel CELULOSE Fase estacionária: algum solvente (ex. água, solv. pouco polar) Fase móvel: * Solventes com polaridade oposta àquela da fase estacionária Ordem de eluição: * FE polar = Menos polares > mais polares É APENAS O SUPORTE! * FE pouco polar = Mais polares > menos polares Cromatografia em Coluna 13
14 SINAL 10/10/2016 CROMATOGRAFIA EM COLUNA COLUNA RECHEADA DETECTOR TEMPO CROMATOGRAFIA EM COLUNA CROMATOGRAFIA GASOSA GC (CG) CROMATOGRAFIA LÍQUIDA LC (CL) CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTA EFICIÊNCIA HPLC (CLAE) 14
15 Cromatografia líquida em coluna (LC) - Clássica Cromatografias modernas Desenvolvimento de equipamentos para realizar as análises Busca por melhores separações Ampliação da aplicabilidade Cromatografia gasosa de alta resolução (HRGC) Cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) 15
16 Cromatografia gasosa de alta resolução HRGC (CGAR) Cromatograma Cromatógrafo Cromatografia líquida de alta eficiência HPLC (CLAE) Cromatograma Cromatógrafo 16
17 O que é o cromatograma? Resposta (Sinal analítico) Tempo Universidade de São Paulo Instituto de Química de São Carlos Departamento de Química e Física Molecular Álvaro José dos Santos Neto CROMA-IQSC 17
18 CROMATOGRAFIA GASOSA Aplicabilidade Quais misturas podem ser separadas por CG? (para uma substância qualquer poder ser arrastada por um fluxo de um gás ela deve ser dissolvida - pelo menos parcialmente - nesse gás) Misturas cujos constituintes sejam VOLÁTEIS DE FORMA GERAL: GC é aplicável para separação e análise de misturas cujos constituintes tenham PONTOS DE EBULIÇÃO de até 300 o C e que sejam termicamente estáveis. O Cromatógrafo a Gás Reservatório de Gás e Controles de Vazão / Pressão. 2 - Injetor (Vaporizador) de Amostra. 3 - Coluna Cromatográfica e Forno da Coluna. 4 - Detector. 5 - Eletrônica de Tratamento (Amplificação) de Sinal. 6 - Registro de Sinal (Registrador ou Computador). 18
19 Cromatógrafo à Gás Estação de gases Injetor Computador Forno e Coluna Painel de controle Forno com coluna Detector FID Gás de arraste Injetor Coluna capilar Computador 19
20 INSTRUMENTAÇÃO Microsseringas para Injeção LÍQUIDOS: Capacidades típicas: 1 L, 5 L e 10 L Microseringa de 10 L: êmbolo agulha (inox 316) corpo (pirex) Gases: Devem ser do tipo gas tight INSTRUMENTAÇÃO Injeção on-column de líquidos Ponta da agulha da microseringa é introduzida no início da coluna. 2. Amostra injetada é vaporizada instantaneamente no início da coluna. 3. Plug de vapor de amostra forçado pelo gás de arraste a fluir pela coluna. 20
21 INSTRUMENTAÇÃO Colunas: Definições Básicas EMPACOTADA = 3 a 6 mm L = 0,5 a 5 m CAPILAR = 0,1 a 0,5 mm L = 5 a 100 m Link:< 21
22 TEMPERATURA 10/10/2016 INSTRUMENTAÇÃO Temperatura da Coluna TEMPERATURA DA COLUNA CONTROLE CONFIÁVEL DA TEMPERATURA DA COLUNA É ESSENCIAL PARA OBTER SEPARAÇÃO REPRODUTIVEL EM CG INSTRUMENTAÇÃO Programação Linear de Temperatura A temperatura do forno pode ser variada linearmente durante a separação: Consegue-se boa separação dos componentes da amostra em menor tempo Parâmetros de uma programação de temperatura: T INI : Temperatura Inicial T FIM : Temperatura Final t INI : Tempo Isotérmico Inicial t FIM : Tempo Final do Programa T FIM T INI R R: Velocidade de Aquecimento t INI TEMPO t FIM 22
23 INSTRUMENTAÇÃO Detectores Dispositivos que examinam continuamente o material eluido, gerando sinal quando da passagem de substâncias que não o gás de arraste DETECTORES Definições Gerais Dispositivos que geram um sinal elétrico proporcional à quantidade eluida de um analito ~ 60 detectores já usados em CG ~ 15 equipam cromatógrafos comerciais 4 respondem pela maior parte das aplicações DCT TCD Detector por Condutividade Térmica DCE ECD Detector por Captura de Elétrons DIC FID Detector por Ionização em Chama DEM MSD Detector Espectrométrico de Massas 23
24 DETECTORES Classificação UNIVERSAIS: Geram sinal para qualquer substância eluida. SELETIVOS: Detectam apenas substâncias com determinada propriedade físico-química. ESPECÍFICOS: Detectam substâncias que possuam determinado elemento ou grupo funcional em suas estruturas DETECTORES Detector por Condutividade Térmica i Cela de Detecção do DCT: 1 Bloco metálico (aço) Entrada de gás de arraste 3 Saída de gás de arraste Filamento metálico (liga W- Re) aquecido 5 Alimentação de corrente elétrica para aquecimento do filamento 24
25 CORTE SUPERIOR 10/10/2016 DETECTORES Detector por Condutividade Térmica CELAS DA AMOSTRA CELAS DA AMOSTRA CELAS DE REFERÊNCIA CORTE LATERAL CELAS DE REFERÊNCIA DETECTORES Detector por Condutividade Térmica 25
26 DETECTORES Detector por Ionização em Chama SELETIVIDADE Seletivo para substâncias que contém ligações C-H em sua estrutura química. Quando um composto orgânico elui, ele é queimado. Como na sua queima são formados íons, a chama passa a conduzir corrente elétrica DIC CH 4 CO 2 O 2 DCT N 2 DETECTORES Detector por Captura de Elétrons PRINCÍPIO Supressão de um fluxo de elétrons lentos (termais) causada pela sua absorção por espécies eletrofílicas Um fluxo contínuo de elétrons lentos é estabelecido entre um ânodo (fonte radioativa b -emissora) e um cátodo. Na passagem de uma substância eletrofílica alguns elétrons são absorvidos, resultando uma supressão de corrente elétrica. 26
27 ABUNDÂNCIA 10/10/2016 ANÁLISE QUALITATIVA Espectrometria de Massas PRINCÍPIO A amostra é fragmentada e ionizada em um padrão característico da espécie química. 1 Moléculas da amostra são bombardeadas por elétrons (electron impact = EI) ou íons (chemical ionization = CI): ABCDE + e - ABCDE e - 2 O íon formado se fragmenta: ABCDE.+ AB. + CDE + ABCDE.+ AB + + CDE. ABCDE.+ A + + BCDE. 3 Os fragmentos iônicos formados são separados magneticamente de acordo com suas massas moleculares e contados: O gráfico do número de íons formados em função da razão Massa / Carga dos íons é o ESPECTRO DE MASSAS do analito MASSA / CARGA ANÁLISE QUALITATIVA Espectrômetro de Massas Câmara de Ionização 2 Saída de Vácuo 3 Analisador de Massas - Quadruplo 4 Detector 27
28 ANÁLISE QUALITATIVA Espectro de Massas m / Z - CO m /Z = 80 m /Z = (CO + H) m /Z = 79 ANÁLISE QUALITATIVA Espectro de Massas m / Z m /Z = 90 28
29 massa molecular 10/10/2016 Universidade de São Paulo Instituto de Química de São Carlos Departamento de Química e Física Molecular Álvaro José dos Santos Neto CROMA-IQSC ESCOPO DA HPLC POLARIDADE DO SOLUTO insolúvel em água solúvel em água espécies MM>10 4 : cromatografia por exclusão espécies iônicas de baixa MM: cromatografia por troca iônica espécies pequenas e polares, mas não-iônicas: métodos de partição (série homóloga) espécies não-polares: cromatografia por adsorção (isômeros estruturais, hidrocarbonetos alifáticos) 10 2 ADSORÇÃO não-polar permeação em gel polar não-iônico PARTIÇÃO fase normal fase reversa EXCLUSÃO iônico filtração em gel TROCA IÔNICA Figura 28-1 Skoog p642 vp 29
30 Instrumentação HPLC Diagrama de blocos - HPLC RESERVATÓRIOS FASE MÓVEL FORNO BOMBA INJETOR DETECTOR COLUNA 30
31 Exemplo: bombas reciprocante (duplo pistão) Válvula de injeção de amostras I 6 vias 2 posições I D D C C P Load ou Carregamento P Injection ou Injeção 31
32 Polaridade da fase móvel 10/10/2016 CROMATOGRAFIA DE FASE NORMAL (NP) Polaridade do soluto: a > b > c c b a tempo c b a tempo Nos trabalhos pioneiros usou-se fases altamente polares, como água e trietilenoglicol adsorvidos sobre sílica ou alumina e solventes apolares, como hexano ou éter isopropílico, eram usados como fase móvel; por razões históricas, este tipo de cromatografia é chamado de fase normal Em fase normal, o componente menos polar elui primeiro, devido a sua maior solubilidade na fase móvel; aumentando a polaridade da fase móvel tem o efeito de diminuir o tempo de eluição 32
33 Fases móveis - NPLC Fracas Médias Fortes Hexano Clorofórmio, acetonitrila, tetrahidrofurano Isopropanol, metanol Retenção aumenta com aumento da polaridade dos solutos. Picos assimétricos Ácido acético ou fórmico para ácidos. Amônia ou trietilamina para bases. Fases estacionárias - NPLC Compostos inorgânicos Grupos polares (FL) Característica Conveniência e reprodutibilidade Equilíbrio da coluna após mudança de fase móvel Estabilidade da coluna Seletividade para isômeros Uso com eluição gradiente Separação preparativa Sílica, alumina, carbono grafitizado poroso Diol, aminopropil e cianopropil Comentário FL são preferidas. Colunas de sílica requerem controle do conteúdo de água Colunas de sílica podem requerer tempo longo para equilíbrio Ambas estáveis, mas coluna de sílica tem vida mais longa Sílica preferida Não recomendado para colunas de sílica Sílica preferida pelo baixo custo, maior estabilidade, alta capacidade de amostra 33
34 Polaridade da fase móvel 10/10/2016 Fases estacionárias - NPLC CROMATOGRAFIA DE FASE REVERSA (RP) Polaridade do soluto: a > b > c a b c tempo a b c tempo Na cromatografia de fase reversa, a fase estacionária é apolar, um hidrocarboneto por exemplo (C18) e a fase móvel é relativamente polar (água, metanol, acetonitrila, etc) Em fase reversa, o componente mais polar elui primeiro, devido a sua maior solubilidade na fase móvel; aumentando-se a polaridade da fase móvel aumenta-se o tempo de eluição 34
35 Fases móveis - RPLC Modificador Força do solvente S (C18) Água - Metanol 2,6 Acetonitrila 3,2 Acetona 3,4 Etanol 3,6 2-Propanol 4,2 Tetrahidrofurano 4,5 Fases estacionárias - RPLC Sílica quimicamente modificada com octadecil (ODS, C18), octil (C8), fenil ou cianopropil. Polímeros sintéticos: copolímero do estirenodivinilbenzeno. C8 Si Fenil Si 35
36 EFEITO DO COMPRIMENTO DA CADEIA ALQUÍLICA Cadeias mais longas produzem recheios mais retentivos. 36
37 DETECTORES UV-Vis PRINCÍPIO: absorbância da luz pela amostra resposta seletiva: só detecta os componentes da amostra que absorvem a radiação no comprimento de onda selecionado; grande maioria das substâncias absorvem radiação UV (substâncias com elétrons ou elétrons desemparelhados), por exemplo olefinas, compostos aromáticos e compostos contendo >C=O, >C=S, -N=O e N=N- 37
38 Cela de Detecção volume é mantido pequeno para minimizar alargamento de banda: 1-10 L comprimento: 2-10 mm UV-Vis DETECTORES DE ABSORBÂNCIA UV-Vis arranjo de diodos 38
39 arranjo de diodos 39
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