QUÍMICA TEORIA E EXERCÍCIOS COMENTADOS Prof. WAGNER BERTOLINI

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3 O sucesso da técnica consiste em se escolher as fases adequadas para a efetiva separação dos componentes da amostra. A cromatografia gasosa apresenta exatamente os mesmos conceitos, mas, tem este nome porque, neste caso, a fase móvel é sempre um gás e a amostra tem que estar no estado gasoso ao entrar no cromatógrafo. Ela pode ser volatilizada logo após a injeção, porém, antes de entrar na coluna. A eluição é feita por um fluxo de fase móvel gasosa inerte. Em contraste, com muitos outros tipos de cromatografia, a fase móvel não interage com as moléculas do analito; sua única função é transportar o analito através da coluna. Dois tipos de cromatografia gasosa são encontrados: cromatografia gás-líquido (CGL) e cromatografia gás-sólido (CGS). Na cromatografia gás-líquido, a fase móvel é um gás, enquanto a fase estacionária é um líquido retido na superfície de um sólido inerte por adsorção ou ligação química. Na cromatografia gás-sólido, a fase móvel é um gás, ao passo que a fase estacionária é um sólido que retém os analitos por adsorção física. A cromatografia gás-sólido permite a separação de gases de baixa massa molecular, como os componentes do ar, sulfeto de hidrogênio, monóxido de carbono e óxido de nitrogênio. Para melhor compreensão do que ocorre no cromatógrafo, podemos utilizar o esquema a seguir: Prof Wagner Bertolini Perito Criminal Estratégia Concursos 2

4 A fase móvel em cromatografia gasosa é denominada gás de arraste (sabe por que? Porque arrasta a amostra) e deve ser quimicamente inerte. O hélio é a fase móvel gasosa mais comum, embora o argônio, o nitrogênio e o hidrogênio sejam também empregados. Esses gases estão disponíveis em cilindros pressurizados. Reguladores de pressão, manômetros e medidores de vazão são necessários para se controlar a vazão do gás. Injetor O injetor consiste de um sistema no qual a amostra entra no equipamento. Do modo que este foi concebido só é possível injetar amostras no estado líquido ou gasoso. Produtos sólidos devem ser inicialmente solubilizados em um solvente. No injetor a amostra, normalmente com um solvente, é aquecida e torna-se vapor. Aqui surge o primeiro item a ser considerado no processo de análise por cromatografia a gás, ou seja, as propriedades da amostra a ser analisada. As propriedades da amostra que permitem que ela seja analisada por esta técnica são: - A amostra deve ser homogênea: a amostra quando adicionada em um solvente deve formar uma solução homogênea, pois, caso contrário não será representativa do todo, sendo causa de erro, pois, analisaremos apenas a parte solúvel da amostra no solvente utilizado. Prof Wagner Bertolini Perito Criminal Estratégia Concursos 3

5 - A amostra deve ter estabilidade térmica: no processo de vaporização a amostra não pode se decompor. Se ocorrer a decomposição da amostra durante a injeção desta os resultados obtidos não serão coerentes com a amostra. Normalmente a decomposição é observada no aspecto do cromatograma obtido. - A amostra deve ser volátil: no processo de vaporização a amostra tem que passar totalmente para o estado gasoso. Parte da amostra não pode deixar de volatilizar, pois, se isto ocorrer a análise não será referente à totalidade da amostra e, sim, apenas à parte dela. Os injetores, devido sua importância, tiveram uma adaptação devido à evolução tecnológica dos equipamentos utilizados em cromatografia gasosa. Atualmente existem 2 tipos de injetores, que são denominados de injetor direto ou com divisor de amostra (split). Os injetores diretos fazem com que a amostra introduzida após a volatilização atinja a coluna, sem perda de material. Já os injetores com divisor de amostra fazem uma divisão do volume injetado e somente uma pequena parte do material introduzido entra na coluna. Por que se faz isto? A razão de divisão da amostra é ajustada em função do diâmetro da coluna, tipo de gás de arraste, da sensibilidade do método, etc. Coluna A coluna é o elemento fundamental do processo, uma vez que é responsável pela efetiva separação dos produtos. A coluna fica em um reservatório (forno) parecido com uma estufa, cuja temperatura pode ficar constante ou ser alterada durante a análise. As colunas ficam enroladas dentro do forno, parecendo uma bobina. Prof Wagner Bertolini Perito Criminal Estratégia Concursos 4

6 Quando a temperatura permanece constante denomina-se análise isotérmica e quando a temperatura varia durante o processo de análise, denomina-se eluição com gradiente de temperatura. No mercado existem dois tipos de colunas quanto ao diâmetro: Coluna empacotada: que consiste de tubo de metal preenchido com um recheio que pode variar (e é a fase denominada estacionária) ou coluna capilar que consiste de tubo de sílica fundida. Neste caso a fase estacionária é colocada na superfície interna do tubo. Colunas capilares são utilizadas em temperaturas que superam os 400ºC. Isto requer fases estacionárias especiais e tubos que não se decomponham. Em função disto os tubos de muitas colunas são os feitos de aço inoxidável. A eficiência de uma coluna é dada em número de pratos teóricos que vem a ser um segmento de reta na qual a amostra esta teoricamente em perfeito equilíbrio com as fases estacionária e móvel. O processo de separação dos componentes da amostra é bem complexo e existem vários fatores para que esta ocorra. Entretanto, podemos generalizar o processo em dois itens principais: Prof Wagner Bertolini Perito Criminal Estratégia Concursos 5

7 - A polaridade da fase estacionária: a fase estacionária como é um produto químico, tem polaridade inerente a sua característica e os componentes da amostra entrando em contato com a fase estacionária pode se solubilizar mais ou menos. Podemos utilizar para isto, o conceito de que na solubilidade o semelhante solubiliza o semelhante. Portanto, se uma determinada amostra tiver 2 compostos com polaridades diferentes, um deles pode ter mais afinidade com a fase estacionária ficando mais tempo dissolvido nesta, ficando atrasado em relação ao outro que ficou menos em contato com a fase estacionária. Portanto, quanto maior a interação com a fase estacionária, maior o tempo de retenção relativo. - Ponto de ebulição: considerando-se que na amostra existem 2 compostos com polaridade similar, mas, com pontos de ebulição diferentes, o que tiver menor ponto de ebulição vai atingir a saída da coluna mais rapidamente. Na verdade, além das propriedades físico-químicas dos componentes da amostra, existem outros fatores como: eficiência da coluna, condições de temperatura da análise, etc, que afetam a qualidade da separação cromatográfica. Vejamos um exemplo da influência da temperatura em que se realiza a técnica, para uma mesma coluna e analito: Prof Wagner Bertolini Perito Criminal Estratégia Concursos 6

8 Existem várias fases estacionárias e as colunas são denominadas com uma sigla que pode ser referente ao composto contido na fase estacionária ou um código estabelecido pelo fabricante. Para se relacionar e comparar os vários tipos de colunas um dos critérios é a polaridade relativa, que é dada pelas constantes de Mc Reynolds Detector Após os componentes da amostra saírem da coluna devidamente separados, estes devem ser reconhecidos. Prof Wagner Bertolini Perito Criminal Estratégia Concursos 7

9 Criaram-se os equipamentos denominados de detectores, que conseguem perceber a variação da composição do gás de arraste e transformam esta variação em sinal elétrico. Tais equipamentos são chamados de detectores e é fundamental que forneçam respostas proporcionais à concentração dos componentes. Vejamos uma representação esquemática da atuação de um detector (observe a chegada do analito no detector e o perfil do cromatograma): Foram desenvolvidos dezenas de detectores e muitos têm sido investigados e empregados em separações cromatográficas a gás. Descreveremos, primeiramente, as características que são as mais desejáveis para um detector e todos devem apresentar algumas características consideradas específicas: seletividade, sensibilidade, resposta, ruído e linearidade. Características desejáveis para um detector ideal (lembre-se: nem todas estas características são encontradas em um único detector): O detector ideal para a cromatografia gasosa apresenta as seguintes características: 1. Sensibilidade adequada 10-8 a g de soluto/s. 2. Boa estabilidade e reprodutibilidade. 3. Resposta linear aos solutos que se estenda a várias ordens de grandeza. Prof Wagner Bertolini Perito Criminal Estratégia Concursos 8

10 4. Faixa de temperatura desde ambiente até pelo menos 400ºC. 5. Um tempo de resposta curto e independente da vazão. 6. Uma alta confiabilidade e facilidade de uso. O detector deve, na medida do possível, tolerar a ação de operadores inexperientes. 7. Similaridade de resposta a todos os solutos ou, alternativamente, uma resposta altamente previsível e seletiva a uma ou mais classes de solutos. 8. Não deve destruir a amostra. Vamos destacar algumas destas: Seletividade: os detectores, dependendo de suas características, podem ser sensíveis a alguns produtos, a algumas classes de produtos ou a várias classes de produtos. Os detectores são classificados quanto a sua seletividade como: Universal: detecta qualquer produto que pode sair da coluna cromatográfica. Seletivo: detecta classe de produtos. Específico: detecta apenas um produto ou grupo de produtos. Sensibilidade: os detectores são equipamentos eletrônicos e medem a quantidade de produto que sai pela coluna por unidade de tempo. Dependendo do detector somente acima de uma quantidade de massa é que consegue gerar um sinal que pode ser quantificado. Em geral, as sensibilidades nos detectores atuais situam-se na faixa de 10-8 a g do soluto/s. Resposta: a resposta de um detector está relacionada diretamente a sua sensibilidade e corresponde à quantidade de sinal elétrico relacionada com uma determinada massa de um composto. Prof Wagner Bertolini Perito Criminal Estratégia Concursos 9

11 Ruído: como o detector é um equipamento eletrônico existe um sinal elétrico associado e inerente ao equipamento que não pode ser eliminado. Tal sinal gerado é denominado de ruído. O ruído de um equipamento é responsável diretamente pela sensibilidade deste. Quanto maior o ruído, menor sua sensibilidade. Linearidade: é a relação entre a concentração da amostra e a resposta do detector. Ou seja, existe uma faixa de concentração em que o detector responde linearmente. A faixa de linearidade do detector é dada pela razão entre a maior e menor concentração em que o equipamento é linear. Nas determinações quantitativas, sempre construímos um gráfico para avaliar se estamos dentro da faixa de linearidade do detector. Vejamos a tabela abaixo, que traz os principais tipos de detectores e algumas de suas características: DETECTORES EM CROMATOGRAFIA GASOSA ISTO É MUITO IMPORTANTE!!!!! Numerosos métodos têm sido descritos para detecção dos vapores orgânicos eluídos num cromatógrafo a gás. Os principais métodos de detenção são classificados de acordo com as propriedades físicas que configuram o mecanismo de detecção. Os detectores são classificados como: universal, seletivo e específico. Os detectores de ionização de chama e condutividade térmica respondem na presença de todos os compostos orgânicos e são, portanto, considerados detectores universais. Outros detectores respondem somente na presença de um heteroátomo em particular (por exemplo, fotométrico de chama e termoiônico são considerados detectores específicos). O de captura de elétrons é considerado seletivo, pois detecta qualquer substância que apresente grupo atômico capaz de captar elétrons. Prof Wagner Bertolini Perito Criminal Estratégia Concursos 10

12 Tabela comparativa dos diferentes detectores usados em CG: Detector Seletividade Detectabilidade Ionização de maioria dos compostos 100pg Chama (FID) orgânicos Condutividade Térmica (TCD) Captura Eletrônica (ECD) Fotométrico de Chama (FPD) Termoiônico (TSD) Fotoionização (PID) Universal haletos, nitratos, nitrilas, peróxidos, anidridos, organometálicos enxofre, fósforo, estanho, boro, arsênio, germânio, selênio, cromo fósforo, nitrogênio, enxofre, boro, estanho, antimônio, arsênio, chumbo alifáticos, aromáticos, cetonas, ésteres, aldeídos, aminas, heterociclos, compostos organoenxofre, alguns organometálicos 1ng 50fg 100pg 10pg 2pg Cada detector demanda um gás de arraste específico para seu melhor desempenho TCD: He e H2 FIC: N2 e H2 ECD: N 2, Ar + 5% CH 4 Na cromatografia gasosa, os detectores mais comuns são: Detector por condutividade térmica (DCT): utiliza a perda de calor para detectar a presença de um produto que sai da coluna. Ou seja, Prof Wagner Bertolini Perito Criminal Estratégia Concursos 11

13 baseia-se na propriedade de corpos quentes em perderem calor com uma velocidade que depende da condutividade térmica dos gases que os envolve e de sua composição. O detector de condutividade térmica utiliza como corpo quente (sensor) filamentos de tungstênio aquecidos por uma corrente elétrica e dispostos em oposição numa ponte de Wheatstone. Neste tipo de detector, é necessário ter uma coluna de referência. Quando o gás de arraste sai da coluna levando os componentes da amostra passa sobre um dos filamentos enquanto que no outro filamento continua passando o gás de arraste (coluna de referência) a temperatura do filamento se altera, causando mudança em sua resistência elétrica. A mudança da resistência é, então, medida pela ponte de Wheatstone gerando um sinal que é enviado ao registrador. O detector de condutividade térmica tem a propriedade de ser universal, mas apresenta baixa sensibilidade e baixa região de linearidade. Prof Wagner Bertolini Perito Criminal Estratégia Concursos 12

14 Detector de ionização de chama (FID): baseia-se no fato de que partículas carregadas em um gás têm a propriedade de conduzir eletricidade e a condutividade elétrica deste gás é proporcional à quantidade de íons contidos no gás. O gás de arraste ao sair da coluna entra na fonte de ionização onde existe uma chama em que os componentes do gás são queimados. A chama encontra-se dentro de um campo elétrico alimentado por uma fonte contínua. Quando o gás de arraste sai da coluna levando os componentes da amostra ocorre a queima dos mesmos e surgem radicais livres que na presença do campo elétrico são ionizados e aumentam a corrente elétrica. A variação da corrente elétrica gera um sinal que é amplificado e enviado para o registrador. O detector de ionização tem a propriedade de ser seletivo, pois, só identifica compostos orgânicos, mas apresenta alta sensibilidade e alta região de linearidade. Paralelamente não detecta a água. Grupos funcionais como carbonila, álcool, halogênicos e amínicos produzem poucos ou nenhum íon na chama. Além disso, o detector é insensível para gases não combustíveis como H2O, CO2, SO2 e NOx. Prof Wagner Bertolini Perito Criminal Estratégia Concursos 13

15 Essas propriedades tornam o detector de ionização em chama muito mais útil para a análise de amostras orgânicas, incluindo aquelas contaminadas com água e com óxidos de nitrogênio e enxofre. O detector de ionização exibe uma sensibilidade alta (10 13 g/s), larga faixa linear de resposta (10 7 ) e baixo ruído. Geralmente, é robusto e fácil de usar. Uma desvantagem do detector de ionização em chama é que ele destrói a amostra durante a etapa de combustão. Prof Wagner Bertolini Perito Criminal Estratégia Concursos 14

16 Detector por captura eletrônica (DCE): baseia-se no fato de que o gás de arraste que sai da coluna é bombardeado por partículas beta (elétron), geradas por uma fonte de radiação. Estes elétrons são responsáveis por uma corrente elétrica. Quando o gás de arraste sair da coluna levando os componentes da amostra, e contiver moléculas que podem capturar elétrons, ocorre a diminuição desta corrente. Tal diminuição é proporcional à concentração destas moléculas. A variação da corrente elétrica gera um sinal que é amplificado e enviado para o registrador. O detector por captura eletrônica tem a propriedade de ser seletivo, pois, só identifica compostos como halogenetos orgânicos, nitrilas, nitratos e organometálicos. Detector termoiônico: é um tipo específico de detector por ionização onde metais alcalinos sofrem ação de um potencial elétrico, gerando um plasma. Este detector baseia-se no fato de que o gás de arraste que sai da coluna, após sofrer ionização entra em contato com o plasma gera uma corrente elétrica. Quando o gás de arraste sai da coluna levando os componentes da amostra, e contiver átomos de Prof Wagner Bertolini Perito Criminal Estratégia Concursos 15

17 nitrogênio e fósforo, estes reagem com o plasma, gerando íons negativos, ocorrendo aumento desta corrente, e que é proporcional à concentração destes íons. A variação da corrente elétrica gera um sinal que é amplificado e enviado para o registrador. O detector termoiônico tem a propriedade de ser seletivo, pois, só identifica compostos de nitrogênio e fósforo. Vejamos um esquema geral para os tipos de detectores: UNIVERSAIS SELETIVOS ESPECÍFICOS Geram sinal para Detectam apenas Detectam substâncias qualquer substância substâncias com que possuam eluida. determinada determinado elemento propriedade físico- ou grupo funcional em química. suas estruturas Espectro de massas (Aqui vai só uma ideia do uso deste como detector). Um dos detectores mais poderosos para a cromatografia gasosa é o espectrômetro de massas. A combinação da cromatografia a gás e a espectrometria de massas é conhecida como CG-MS (do português cromatografia gasosa e do inglês mass spectrometry). Um espectrômetro de massas mede a razão massa/carga (m/z) de íons que são produzidos pela amostra. A maioria dos íons produzidos apresenta uma carga unitária(z =1), de forma que a maioria dos Prof Wagner Bertolini Perito Criminal Estratégia Concursos 16

18 espectrometristas de massas refere-se à medida de massa dos íons quando, na verdade, a razão massa/carga é que é medida. Espectro de massas do CO2: observe que o íon molecular aparece na razão m/z= 44 (C=12, O =16). Os íons de fragmentos aparecem a valores de m/z 28, 16 e 12. Estes correspondem ao CO+, O- e C-, respectivamente. Abaixo uma representação do acoplamento da cromatografia do tipo GCMS: Registrador Define-se como registrador um sistema potenciométrico onde o sinal enviado pelo detector é amplificado e um gráfico pode ser construído. Este é em forma de picos correspondendo cada pico a um produto que sai da coluna. Este gráfico é normalmente denominado de cromatograma. Atualmente com o avanço da tecnologia os registradores estão sendo substituídos por computadores. Do gráfico pode-se obter 2 informações importantes: Prof Wagner Bertolini Perito Criminal Estratégia Concursos 17

19 - tempo de retenção: corresponde ao tempo que uma substância gasta para percorrer desde o injetor, passando pela coluna e ser detectado. Para cada substância, em uma determinada coluna e condições estabelecidas, existe um tempo de retenção. O tempo de retenção serve para se identificar componentes da amostra injetada. - Área do pico: relaciona-se com a concentração do produto que gerou o pico. E é este recurso que torna a cromatografia uma técnica muito útil para análise de produtos químicos Análise Qualitativa A cromatografia pode ser utilizada como método de identificação e esta é feita através do tempo de retenção. A primeira etapa é obter o cromatograma e este fornece o que chamamos de perfil cromatográfico da amostra. O perfil pode informar quantas substâncias compõem a amostra. A partir do perfil, se tivermos padrões, podemos comparar os tempos de retenção e identificar estes produtos. Análise quantitativa A análise quantitativa por cromatografia gasosa normalmente é feita por dois métodos, em função da possibilidade da existência ou não de padrões. Quando não se tem padrão utiliza-se o processo denominado de porcentagem de área. Onde se deve inicialmente garantir que todos os componentes da amostra foram detectados pelo cromatógrafo. Neste tipo de análise é fundamental que se saiba se esta contem água ou solventes, pois isto irá ajudar a definir condições de análise e tipo de detector. Prof Wagner Bertolini Perito Criminal Estratégia Concursos 18

20 Depois de obter todas as áreas de cada pico, pode se calcular a somatória destas e relacionar esta somatória a 100%. Logo, cada pico terá sua parcela percentual. Esta técnica permite fornecer uma noção da composição de uma amostra. Quando é possível dispor de padrões, utiliza-se o processo denominado de porcentagem em peso que consiste em comparar a área do pico de interesse com a área do padrão. Em função do modo como se trabalha a porcentagem em peso esta pode ser denominada de padronização externa e de padronização interna. Padronização externa: a primeira atitude em uma análise quantitativa é determinar a faixa de linearidade do detector para a concentração que se pretende trabalhar. Depois disto, constrói-se uma curva de calibração com vários pontos (dependendo da metodologia empregada) e obtém-se a equação da reta. Com a área da amostra e esta equação da reta podemos calcular a concentração da amostra. Padronização interna: o raciocínio é o mesmo que para a padronização externa, entretanto, tanto na amostra como nas soluções padrões adiciona-se um produto com características similares à da amostra e procede-se da mesma maneira, como na padronização externa. Entretanto, na construção do gráfico utiliza-se a relação entre a área do padrão e a área do padrão interno. A vantagem da técnica por padrão interno é que se torna menos sensível a desvio de injeção da amostra e variações instrumentais. Vou colocar abaixo segue um trabalho que julgo interessante. Caso você não queira ler, pode pular esta parte e seguir seus estudos. Isto ocorreu em uma consultoria que prestei a uma indústria X. A indústria X comprava um óleo de uma indústria A que, Prof Wagner Bertolini Perito Criminal Estratégia Concursos 19

21 teoricamente, declarava ser a única fornecedora comercial para a finalidade desejada. E cobrava um preço mais alto em função disto. Conseguimos encontrar outro fornecedor, que chamarei aqui de fornecedor B, para a empresa X, com um preço muito mais em conta. A indústria A contestou a qualidade do material vendido pelo possível novo fornecedor e alegou que somente eles teriam a mistura de tensoativos comerciais e que ninguém teria aquela mistura de tensoativos que gerariam produtos melhores. O que fizemos? Fizemos uma análise do material das duas empresas. Levamos uns 3 meses para chegar ao resultado abaixo, onde analisamos após extrações e diferentes metodologias, a composição dos óleos das empresas A e B. Mesmo se você não souber nadinha de nada de cromatografia, você olha para os cromatogramas gasosos e conclui que os materiais das diferentes empresas são iguais ou diferentes? Segue trecho do relatório de pesquisa: Cromatografia gasosa da fase oleosa d Após a obtenção do óleo uma amostra deste foi submetida à cromatografia gasosa e o resultado obtido foi comparado aos óleos minerais A e B. O resultado segue abaixo (Figuras) e observa-se uma semelhança extremamente grande entre o óleo do A e do B. Pode-se concluir que a composição do A e do B.. Cromatograma do A Prof Wagner Bertolini Perito Criminal Estratégia Concursos 20

22 Cromatograma do B Sobreposição dos cromatogramas de A e B. (x1,000,000) Este estudo proporcionou à empresa X uma economia de uns R$ ,00 por ano, pois, esta passou a comprar da empresa B. Prof Wagner Bertolini Perito Criminal Estratégia Concursos 21

23 3. CROMATOGRAFIA LÍQUIDA (CLAE ou HPLC) QUÍMICA Todos os conceitos utilizados na cromatografia a gás podem ser transportados para a cromatografia liquida de alta eficiência, bastando ter em mente que a fase móvel agora é um líquido, daí o tipo de equipamento, colunas e detectores passam a ser fisicamente diferentes, mas com o mesmo conceito básico. A fase móvel agora é um solvente ou mistura de solventes, passando assim, a diferença de polaridade ser muito importante no processo de separação, já que as amostras não precisam sofrer ação da temperatura para se separar. Na verdade, estes compostos normalmente não suportam a temperatura empregada na cromatografia gasosa. Esta técnica é muito utilizada para produtos que não podem ser analisados por cromatografia a gás, pois sofrem decomposição quando aquecidos, como por exemplo, vitaminas, açúcares e etc. Para iniciarmos, vamos fazer comparações entre as cromatografias liquidas e gasosas, de uma maneira bem geral: Cromatografia gasosa x CLAE Na cromatografia gasosa (CG) é necessário que a amostra seja suficientemente volátil, a fim de que possa passar através da coluna na forma de vapor, e estável termicamente para não se decompor nas condições de separação. Os métodos de detecção utilizados em CG são mais rápidos e sensíveis, a aparelhagem mais fácil de ser manipulada e em geral mais barata. A CLAE requer somente que a amostra seja solúvel na fase móvel. Assim, a CLAE é um método ideal para a separação de espécies iônicas ou macromoléculas de interesse biológico e produtos naturais lábeis, bem como uma imensa variedade de outros compostos de alta massa molecular e/ou baixa estabilidade térmica. A CLAE possui como vantagens adicionais: duas fases cromatográficas Prof Wagner Bertolini Perito Criminal Estratégia Concursos 22

24 de interação seletiva com as moléculas da amostra, versus somente uma na CG e maior variedade de possíveis mecanismos de separação. As principais características de ambas as técnicas estão resumidas na tabela abaixo. E a conclusão que pode ser tirada sobre elas é que se complementam na análise de diferentes tipos de amostras. Prof Wagner Bertolini Perito Criminal Estratégia Concursos 23

25 Veja, também, um resumo das vantagens e limitações da CLAE (HPLC). Na cromatografia líquida a mistura de solutos é levada a migrar através da fase fixa, por meio de fluxo constante da fase móvel, sendo a diferença de velocidade de migração (migração diferencial) provocada por processo de competição pelo soluto, entre as duas fases. Em função disto teremos diferentes tipos cromatográficos, conforme se pode analisar pela tabela abaixo: Prof Wagner Bertolini Perito Criminal Estratégia Concursos 24

26 Características das colunas usadas em CLAE As colunas são constituídas de um pedaço de tubo de algum material inerte, de diâmetro interno uniforme e capaz de resistir à pressão em que serão usadas. O aço inoxidável é o mais usado entre todos os materiais. Existem também algumas feitas com vidro de paredes grossas, mas apresentam o inconveniente de não se conseguir conexões adequadas, entre o vidro e o metal e que resistam a altas pressões sem vazamento. Geralmente, o diâmetro interno das colunas para fias analíticos é ao redor de 3 a 5 mm e para colunas preparativas igual ou maior do que 10 mm. As colunas com microdiâmetro apresentam diâmetros internos entre 0.05 e 2 mm. O comprimento, na maioria dos casos, fica entre 10 e 50 cm, com exceção da cromatografia por exclusão onde, às vezes, usam-se colunas de comprimento maior ou várias colunas conectadas uma na outra. A capacidade da coluna e determinada pelo seu comprimento, diâmetro e material de recheio. As colunas são normalmente retas porque apresentam uma perda de eficiência quando são dobradas. Nos extremos da coluna coloca-se um disco de teflon ou metal poroso para evitar a perda do recheio ou mudanças na sua compactação. É importante que este disco retenha as partículas do recheio sem produzir um aumento muito grande na pressão. Nas colunas atuais é comum obter-se eficiência da ordem de pratos teóricos por metro de coluna, que é superior às eficiências normalmente obtidas em cromatografia gasosa com colunas recheadas. A fase móvel deve ser de alta pureza, como um solvente de grau cromatográfico, permitindo realizar análises de alta sensibilidade com detectores por fluorescência ou por absorbância no ultravioleta, onde Prof Wagner Bertolini Perito Criminal Estratégia Concursos 25

27 as impurezas da fase móvel podem absorver e diminuir a sensibilidade do detector para os componentes da amostra. Quando se utilizar cromatografia líquido-líquido, a fase móvel pode dissolver a fase estacionária. Para evitar isto, satura-se a fase móvel com a fase estacionária utilizando-se, para isso, uma pré-coluna contendo uma alta concentração da mesma fase estacionária. No preparo da fase móvel deve-se filtrar o solvente (trabalhar com filtro Millipore) e desgaseificá-lo (existem aparelhos acoplados ao cromatógrafo que já fazem isto automaticamente). Caso não se tenha o aparelho mencionado uma das maneiras de retirar gases do solvente é deixar o solvente no frasco dentro de banho ultrassom por, no mínimo, 15 minutos. Esse tempo varia conforme a solução a ser preparada. No caso de solvente orgânico com água, esse tempo pode ser maior. Por exemplo, em uma mistura de água e álcool, que é exotérmica, deve-se efetuar a mistura e, depois, desgaseificá-la. Em mistura de acetonitrila e água a desgaseificação deve ser feita em temperatura baixa devido à grande volatilidade da acetonotrila. Ao se trabalhar com água, tomar todos os cuidados para que não se forme fungo dentro da coluna. Lavar sempre o sistema abundantemente e passar um agente de esterilização (por ex, MeOH ou Acetonitrila). Para análise de açúcares utilizar água ligeiramente acidificada. O mesmo cuidado se deve ter quando se trabalha com solução tampão. Nesse caso uma atenção a mais deve ser dada. Não deixar o sistema parado quando se trabalha com tampão, pois pode produzir cristais do sal na região do pistão da bomba. Ao se reiniciar o trabalho esse sal cristalizado pode danificar o corpo do pistão. Equipamentos para CLAE As principais características que devem ser levadas em consideração na escolha de um equipamento para CLAE são: Prof Wagner Bertolini Perito Criminal Estratégia Concursos 26

28 - Versatilidade: o equipamento deve resolver amostras de diferentes tipos, servir a distintas técnicas cromatográficas e realizar o máximo de operações, tais como, gradiente de fase móvel, coleta das frações, reciclagem de frações, etc., necessárias às análises sofisticadas. - Rapidez: para se conseguir análises rápidas, deve-se obter as melhores condições de CLAE, isto é, fase móvel de baixa viscosidade, bomba de alta pressão e colunas com partículas de pequeno diâmetro (grande área de superfície, que ajuda os processos de separação). - Reprodutibilidade e Estabilidade: características essenciais para obter do equipamento um bom funcionamento, a longo prazo. O equipamento deve ter controle adequado sobre os parâmetros de operação, como vazão, temperatura, pressão e composição da fase móvel. - Sensibilidade: Um bom equipamento, mesmo trabalhando com pequenas quantidades de amostra, deve gerar sinais de intensidade apreciável. Detectores usados em CLAE Prof Wagner Bertolini Perito Criminal Estratégia Concursos 27

29 Uma instrumentação melhor é requerida para a CLAE, em relação à sensibilidade dos detectores, para monitorização do efluente que sai da coluna. Infelizmente as propriedades físicas ou físico-químicas da amostra e fase móvel são, muitas vezes, similares. Algumas soluções para o problema de detecção têm sido procuradas no desenvolvimento da CLAE: - Medidas diferenciadas de propriedades gerais de ambas: amostras e fase móvel - Medidas de uma propriedade da amostra que não é apresentada pela fase móvel. Detecção após a eliminação da fase móvel. Uma variedade de detectores tem sido desenvolvida para CLAE, baseando-se em uma destas soluções. Um detector ideal para a CLAE seria aquele com as seguintes características: -Alta sensibilidade e baixo limite de detecção - Resposta rápida a todos os solutos - Insensibilidade a mudanças na temperatura e na vazão da fase móvel. - Resposta independente da fase móvel - Pequena contribuição ao alargamento do pico pelo volume extra da cela do detector. - Resposta que aumente linearmente com a quantidade do soluto - Não destruição do soluto. - Segurança e conveniência de uso. - Informação qualitativa do pico desejado. Propriedades de alguns detectores usados em CLAE Prof Wagner Bertolini Perito Criminal Estratégia Concursos 28

30 Abaixo segue um estudo de um estudo feito por mim, para uma mistura complexa de compostos vendidos industrialmente. Novamente repito: se não for de seu interesse passe adiante. Abaixo vou colocar trechos de pesquisa de desenvolvimento de uma metodologia analítica cromatográfica para tentar chegar à melhor separação possível. E esta nem precisaria ser muito requintada porque as amostras seriam, depois, usadas para um estudo em espectro de massas (que não precisa de separações muito boas. Em alguns casos nem precisa de separação. Mas, em função dos nossos objetivos na pesquisa buscamos chegar ao melhor perfil cromatográfico possível, dispendendo o menor tempo para isto). Observe a evolução dos cromatogramas obtidos, lembrando que a mistura é muito complexa e temos casos de isômeros. Estudo cromatográfico do Foram realizados estudos cromatográficos (HPLC) visando a escolha de coluna cromatográfica, de fase móvel e condições de análise. O Prof Wagner Bertolini Perito Criminal Estratégia Concursos 29

31 objetivo destes estudos é definir a melhor condição para se analisar e obter frações através de cromatografia preparativa. Com as frações obtidas novos estudos serão realizados visando determinar a massa molar dos possíveis compostos presentes no.. Para tanto, preparou-se uma solução estoque deste produto e algumas diluições, que serão empregadas no estudo analítico. Preparo da amostra: Pesou-se 15 mg de e dissolveu-se em 1 ml de Acetonitrila. A partir desta solução fez-se diluições para a obtenção de soluções a 1500 µg/ ml, 1500 µg/ ml e 200 µg/ml. Algumas colunas testadas foram escolhidas em função de artigos científicos que relatam estudos com tensoativos. Buscou-se analisar as possíveis fases móveis, comprimentos de onda no UV (detector), fluxo, etc. Como a mistura é de composição desconhecida, o estudo é bastante empírico e exige uma série de tentativas com as diferentes variáveis a serem determinadas e especificadas. Objetivo deste experimento: verificar se o produto é eluido da coluna e se o comprimento de onda é sensível à presença deste. Resultado: houve a presença de pico no cromatograma, o que indica que o comprimento de onda escolhido pode ser um dos possíveis a serem empregados. (aqui as variações que fiz em fase móvel, comprimento de onda, tipo de coluna, isocrático ou não, etc) CONDIÇÕES EXPERIMENTAIS: CONDIÇÕES EXPERIMENTAIS: ARQUIVO: DATA: 11 ABRIL 2012 COLUNA C4 VIDAX FLUXO 1 ml/min Comprimento onda detector: 215 nm Prof Wagner Bertolini Perito Criminal Estratégia Concursos 30

32 FASE MÓVEL:acetonitrila e água, ambos com 0,1% de Ácido Trifluoracético (TFA) : GRADIENTE 80 a 20 % de água em 50 minutos. ANALITO:. A CONC 1500 MICROGRAMAS CONDIÇÕES EXPERIMENTAIS: ARQUIVO: DATA: 11 ABRIL 2012 COLUNA: C4 VIDAX FLUXO 1 ml/min Comprimento onda detector: 215 nm FASE MÓVEL:acetonitrila e água, ambos com 0,1% de Ácido Trifluoracético (TFA) CONDIÇÕES: GRADIENTE 80 a 20 % de água em 50 minutos. ANALITO: A CONC 1500 MICROGRAMAS CONCLUSÕES: a coluna empregada ou a fase móvel usada não foram adequadas. Portanto, buscou-se encontrar uma fase móvel e para isto empregou-se nova coluna. B) COLUNA HILIC CONDIÇÕES EXPERIMENTAIS: ARQUIVO: DATA: 11 ABRIL 2012 Sem COLUNA FLUXO 1 ml/min Comprimento onda detector: 215 nm FASE MÓVEL:acetonitrila e água, ambos com 0,1% de Ácido Trifluoracético (TFA) CONDIÇÕES: GRADIENTE 20 a 80 % de água em 50 minutos. ANALITO: A CONC 1500 MICROGRAMAS CONDIÇÕES EXPERIMENTAIS: ARQUIVO: Prof Wagner Bertolini Perito Criminal Estratégia Concursos 31

33 DATA: 12 ABRIL 2012 COLUNA HILIC FLUXO 0,3 ml/min Comprimento onda detector: 195 nm QUÍMICA FASE MÓVEL:acetonitrila e água, ambos com 0,1% de Ácido Trifluoracético (TFA) CONDIÇÕES: isocrático com 10% de água em 50 minutos. ANALITO: A CONC 1500 MICROGRAMAS Buscou-se avaliar o comprimento de onda mais indicado ou de maior sensibilidade para os compostos. Observou-se que este comprimento de onda se mostrou mais sensível ao. Portanto, deverá ser empregado até obter uma fase móvel que permita melhores resultados. As primeiras tentativas mostram uma separação entre componentes do.. Porém, devido às características observadas nos cromatogramas (perfis dos picos), novas tentativas de mudanças das condições experimentais serão realizadas. Entre os cromatogramas abaixo foram realizadas mudanças envolvendo fluxo e composição da fase móvel, bem como do analito empregado, pois, buscaremos avaliar comparativamente os. comerciais em estudo além do. e para isto as condições cromatográficas devem também ser adequadas para os demais tensoativos além do.. RESULTADOS: VWD1 A, Wavelength=195 nm (WAGNER\ARQUIVOS\13ABRI~1 M88_2001.D) Norm min Observe que os picos são largos. Isto significa que podemos ter mais Prof Wagner Bertolini Perito Criminal Estratégia Concursos 32

34 de um composto eluindo simultaneamente. Os picos devem ser os mais altos e finos, para poderem indicar uma boa resolução. Na prática, nem sempre se consegue tal resultado. Acompanhe a evolução destes picos conforme as mudanças que foram feitas quanto a fase móvel, fluxo, etc. VWD1 A, Wavelength=195 nm (WAGNER\ARQUIVOS\13ABRI~1\M88_B000.D) Norm min VWD1 A, Wavelength 195 nm (WAGNER\ARQUIVOS\13ABRI~1\M88_B001.D) Norm min VWD1 A, Wavelength=195 nm (WAGNER\ARQUIVOS\13ABRI~1\M D) Norm mn Prof Wagner Bertolini Perito Criminal Estratégia Concursos 33

35 VWD A, Wavelength= 95 nm (WAGNER ARQUIVOS 3ABRI~ M D) Norm min S VWD1 A, Wavelength=195 nm (WAGNER\ARQUIVOS\13ABRI~1\SPAN8003.D) Norm min VWD1 A, Wavelength=195 nm (WAGNER\ARQUIVOS\13ABRI~1\TWEEN802.D) Norm min Prof Wagner Bertolini Perito Criminal Estratégia Concursos 34

36 VWD1 A, Wavelength=203 nm (WAGNER\ARQUIVOS\18ABRI~1\WAG18AB5.D) Norm mn VWD1 A, Wavelength=203 nm (WAGNER\ARQUIVOS\18ABRI~1\WAG18A13.D) Norm min Norm. VWD1 A, Wavelength 203 nm (WAGNER\10MA O02.D) VWD1 A, Wavelength 203 nm (WAGNER\ARQUIVOS\23ABRI~1\WAG20A07.D) min Prof Wagner Bertolini Perito Criminal Estratégia Concursos 35

37 mau VWD1 A, Wavelength 203 nm (WAGNER\10MAIO02.D) VWD1 A, Wavelength 203 nm (WAGNER\10MAIO03.D) min 4. QUESTÕES PROPOSTAS 01. (2016 CESPE - POLÍCIA CIENTÍFICA PE - Perito Criminal - Medicina Veterinária). A cromatografia líquida de alta eficiência é um método que a) utiliza as propriedades fluorescentes de um intercalante de DNA para detectar a amplificação de um gene-alvo. b) tem como princípio de funcionamento a diferença de afinidade de diferentes compostos de uma amostra complexa com a fase estacionária para separação desses compostos, quando submetidos a um fluxo de fase móvel líquida. c) tem como princípio de funcionamento a queima da amostra para análise dos compostos por detecção dos átomos constituintes dessa amostra. d) é largamente utilizado para a análise de compostos voláteis complexos, como as vitaminas do leite. e) não pode ser associado a um detector do tipo espectrômetro de massa, pois as amostras submetidas à cromatografia tornam-se líquidas, impossibilitando seu uso no espectrômetro. Resolução: Prof Wagner Bertolini Perito Criminal Estratégia Concursos 36

38 Questão teórica, que traz a seguinte alternativa como a correta: tem como princípio de funcionamento a diferença de afinidade de diferentes compostos de uma amostra complexa com a fase estacionária para separação desses compostos, quando submetidos a um fluxo de fase móvel líquida. Resposta: B. 02. (2016 CESPE - POLÍCIA CIENTÍFICA PE - Perito Criminal Farmácia). Acerca de técnicas cromatográficas, assinale a opção correta. a) É impossível utilizar a cromatografia gasosa para a investigação de substâncias voláteis. b) A diferença de peso molecular dos componentes de uma mistura é o que permite a separação desses componentes por cromatografia. c) Na técnica de cromatografia em camada delgada (CCD) de fase normal, a fase estacionária é normalmente sílica e a fase móvel, um solvente orgânico ou mistura de solventes com caráter apolar. d) A cromatografia líquida de alta eficiência tem alto poder de resolução devido ao tamanho da coluna cromatográfica utilizada, que pode atingir até 1 m de comprimento. e) Na cromatografia gasosa, a fase estacionária é sólida e a fase móvel é um gás inerte. Resolução: a) Errado. Pode-se empregar a cromatografia gasosa exatamente para estes compostos. b) Errado. A diferença de peso não é o fundamento da técnica. Mais importante que o peso molecular podemos citar a solubilidade, por exemplo c) Na técnica de cromatografia em camada delgada (CCD) de fase normal, a fase estacionária é normalmente sílica e a fase móvel, um solvente orgânico ou mistura de solventes com caráter apolar. CORRETO. Prof Wagner Bertolini Perito Criminal Estratégia Concursos 37

39 d) Errado. Não se tem coluna com este comprimento. e) Podemos ter diferentes fases, não apenas as mencionadas. Resposta: C. 03. (2016 IADES - PC-DF - Perito Criminal Química). Após a apreensão de drogas pela polícia, amostras são retiradas e levadas à perícia, onde são realizados ensaios analíticos utilizando técnicas cromatográficas. Acerca desse assunto, assinale a alternativa correta. a) Em cromatografia líquida, a coluna de fase reversa é utilizada para a separação de espécies polares. b) Em cromatografia de íons, é utilizada coluna em fase reversa. c) A cromatografia em camada delgada (CCD) é comumente utilizada acoplada ao espectrômetro de massas. d) Em cromatografia gasosa, podem ser utilizadas colunas com fase estacionária líquida ou sólida. e) Em cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE), são utilizadas pré-colunas com o intuito de diminuir as oscilações das bombas. Resolução: a) Em cromatografia líquida, a coluna de fase reversa é utilizada para a separação de espécies polares. ERRADO. As espécies são, em geral, apolares. b) Em cromatografia de íons, é utilizada coluna em fase reversa. Errado. Veja o item acima. Íons são carregados. Usa-se coluna de troca iônica, por exemplo. c) A cromatografia em camada delgada (CCD) é comumente utilizada acoplada ao espectrômetro de massas. ERRADO. Isto é impossível. Acoplar massa com CCD é uma ideia ridícula quanto à execução. d) Em cromatografia gasosa, podem ser utilizadas colunas com fase estacionária líquida ou sólida. CORRETO. e) Em cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE), são utilizadas pré-colunas com o intuito de diminuir as oscilações das bombas. Prof Wagner Bertolini Perito Criminal Estratégia Concursos 38

40 ERRADO. Pré-coluna é para preservar a coluna, não tem nenhuma conexão com fluxo de solvente. Resposta: D. 04. (2016 CESPE - POLÍCIA CIENTÍFICA PE -Perito Criminal Química). Acerca das técnicas cromatográficas, assinale a opção correta. a) A eficiência de uma coluna usada em cromatografia líquida diminui à medida que o tamanho das partículas do recheio dessa coluna diminui. b) Na análise quantitativa mediante cromatografia líquida de alta eficiência, o produto da intensidade pela largura da base do pico do cromatograma é usado para determinar a concentração do analito. c) A análise por cromatografia gasosa é limitada a amostras em estado gasoso e sob temperatura ambiente. d) Para aumentar a eficiência de separação entre compostos em cromatografia, busca-se controlar as condições de eluição para se obter picos largos. e) Na cromatografia por partição de fase reversa, a fase estacionária é apolar, e a fase móvel, polar. Resolução: a) A eficiência de uma coluna usada em cromatografia líquida diminui à medida que o tamanho das partículas do recheio dessa coluna diminui. ERRADO. A eficiência aumenta com a diminuição do recheio b) Na análise quantitativa mediante cromatografia líquida de alta eficiência, o produto da intensidade pela largura da base do pico do cromatograma é usado para determinar a concentração do analito. Errado. A concentração é determinada pela área sob a curva do pico. c) A análise por cromatografia gasosa é limitada a amostras em estado gasoso e sob temperatura ambiente. Errado. O composto pode ser sólido ou líquido. Basta que ele volatilize nas condições de análise Prof Wagner Bertolini Perito Criminal Estratégia Concursos 39

41 d) Para aumentar a eficiência de separação entre compostos em cromatografia, busca-se controlar as condições de eluição para se obter picos largos. Errado. Não temos que buscar aumentar a base do pico. Existem recursos para melhorar a separação. Não esta. e) Na cromatografia por partição de fase reversa, a fase estacionária é apolar, e a fase móvel, polar. CORRETO. Resposta: E. 05. (2014 VUNESP - SAAE-SP Químico). Detectores por ionização de chama são muito usados em cromatografia gasosa. Apesar do amplo emprego, esses de tectores apresentam como limitação a) o pequeno intervalo de resposta linear. b) a baixa sensibilidade para a detecção de hidrocarbo netos. c) a baixa sensibilidade na detecção de compostos contendo heteroátomos. d) a detecção de impurezas como água e CO2 presentes no gás de arraste e) a interferência de alterações na velocidade de fluxo da fase móvel na produção de sinais. Resolução: Vimos na parte teórica que a limitação se dá com compostos com heteroátomos. Resposta: C. 06. (2013 IBFC - PC-RJ - Perito Criminal Farmácia). Em caso de exposição aos vapores de tolueno, o procedimento analítico mais indicado é a determinação de: a) Tolueno e 2,3-tolueno epóxido inalterados no sangue por cromatografia com fase gasosa b) Ácido hipúrico na urina por cromatografia com fase gasosa. c) Dimetilfenol na urina por cromatografia com fase gasosa. Prof Wagner Bertolini Perito Criminal Estratégia Concursos 40

42 d) Fenol na urina por cromatografia com fase gasosa e) Benzaldeído na urina por cromatografia com fase gasosa Resolução: Coloquei esta questão aqui para que você saiba que a técnica podes ser empregada na área de toxicologia. Vamos à resolução. Não é preciso, para você que não conheça farmacologia quais as transformações que ocorrem no metabolismo. O tolueno é um solvente orgânico, tendo seu metabólito o-cresol como principal responsável pelos danos neurológicos. Os biomarcadores encontrados em uma pessoa exposta a tolueno são: Na urina: O acido hipurico na urina é o principal marcador de intoxicação ao tolueno. No sangue: tolueno Resposta: B. 07. (QUÍMICO - UFPE 2013). Eugenol e trans-anetol são compostos presentes em óleos essenciais obtidos de especiarias. Em relação a esses dois compostos, é correto afirmar que: a) o eugenol apresenta um ponto de ebulição menor que o transanetol. b) o eugenol é um ácido fraco em água. c) os compostos devem apresentar fator de retenção (Rf) muito próximos em cromatografia de camada delgada de sílica gel (CCD), por ambos serem apolares. d) o eugenol deve apresentar um fator de retenção (Rf) em CCD de sílica gel maior que o trans- anetol. e) apenas o eugenol pode realizar ligações de hidrogênio com a água. Resolução: Prof Wagner Bertolini Perito Criminal Estratégia Concursos 41

43 O eugenol apresentará maior ponto de ebulição que o trans-anetol pois apresenta mais interações do tipo ponte de hidrogênio e mais oxigenio em sua molécula. Por apresentar a função fenol este será um ácido fraco em água. Não são apolares. Por ser mais polar o eugenol interagem mais intensamente com a sílica gel (polar) e terá menor Rf. O trans-anetol pode fazer pontes de hidrogênio através do sseu átomo de oxigenio do grupo éter (mesmo não sendo um caso típico de ponte). Resposta B 08. (TÉCNICO DE LABORATÓRIO UNIPAMPA - CESPE 2013). No sistema de injeção de um cromatógrafo gasoso, utilizando-se uma coluna capilar, o divisor de amostras pode ser mantido desligado por um breve período de tempo (um a dois minutos, por exemplo), visando aumentar o limite de quantificação do método analítico. ( ) Certo ( ) Errado Resolução: Se o divisor de amostras fica desligado automaticamente maior quantidade de analito será injetada na coluna, o que leva a um aumento no limite de quantificação. Resposta Correto 09. (TÉCNICO DE LABORATÓRIO UNIPAMPA - CESPE 2013) A cromatografia gasosa é a técnica analítica mais utilizada para a separação de espécies não voláteis e termicamente instáveis. ( ) Certo ( ) Errado Resolução: A cromatografia gasosa é usada para substâncias que volatilizam com certa facilidade, sem sofrer decomposição térmica. Analisam-se os gases produzidos. O enunciado afirma o oposto Resposta: Errado 10. (TÉCNICO DE LABORATÓRIO UNIPAMPA - CESPE 2013). Prof Wagner Bertolini Perito Criminal Estratégia Concursos 42