Curso: FARMÁCIA Disciplina: Bioquímica Clínica Título da Aula: Funcionamento do Espectrofotômetro. Glicemia. Professor: Dr.

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1 Curso: FARMÁCIA Disciplina: Bioquímica Clínica Título da Aula: Funcionamento do Espectrofotômetro. Glicemia. Professor: Dr. Fernando Ananias NOME: RA: ATIVIDADE PRÁTICA 1 A- ESPECTROFOTOMETRIA Espectroscopia por absorção óptica A absorção de radiação eletromagnética por átomos, moléculas e materiais em geral é uma propriedade que ajuda a caracterizá-los. Trataremos aqui de absorção na faixa do ultravioleta e visível, isto é, absorção de luz com comprimento de onda (λ) que varia de 180 a 800 nm. Esta é uma técnica muito utilizada em bioquímica e biofísica, seja para simples determinações de concentração, seja para investigação de mudanças estruturais mais complexas. Ondas eletromagnéticas são caracterizadas por comprimento de onda (λ) e freqüência (v), relacionadas com a velocidade da luz por: λ v = c. A energia do fóton da radiação incidente é dada por E = hv = hc / λ, onde h é a constante de Planck. A Espectroscopia por absorção óptica dá-se quando ocorrem transições entre níveis eletrônicos de uma molécula por mudança da energia quando esta é atingida por fótons. Para ocorrerem tais transições a energia do fóton hv deve corresponder à diferença de energia entre dois estados eletrônicos da molécula, que é da ordem de 1 ev. Cada estado eletrônico é composto por um grande número de estados vibracionais, separados por energias da

2 ordem de 0,1 ev. Por sua vez, os estados vibracionais são separados em estados rotacionais, espaçados por aproximadamente 0,01 ev (Fig. 3.1). O espectro de absorção eletrônica é caracterizado pela intensidade de luz absorvida, densidade óptica ou absorbância, e também pela posição de banda, energia. Níveis de energia para uma molécula pequena. São indicadas transições eletrônicas (e), vibracionais (v) e rotacionais (r). (Cantor e Schimmel, 1980). A diferença de energia entre estados eletrônicos encontra-se na faixa de energia dos fótons da radiação ultravioleta e visível. Desta forma a espectroscopia de absorção óptica nessa faixa é às vezes denominada absorção eletrônica. Em moléculas biológicas (moléculas de muitos átomos), cada estado eletrônico é desdobrado em um grande número de estados vibracionais, que se separam em estados rotacionais. Em conseqüência, os picos dos espectros de absorção podem ser bastante largos. As moléculas biológicas podem ser identificadas através de seu espectro de absorção. A equação que relaciona a quantidade de luz absorvida com a espessura e concentração de uma amostra diluída é descrita pela lei empírica de Lambert-Beer Absorbância é, portanto, uma grandeza adimensional e é usada em medidas de absorção óptica por ser proporcional à concentração, na faixa de validade da Lei de Lambert-Bier, isto é, para concentrações baixas. Os espectros de absorção são gerados pela medida da atenuação que um feixe de radiação eletromagnética sofre ao atravessar a amostra de um material em função de sua freqüência ou do comprimento de onda.

3 Absorbância - É a capacidade do material em absorver radiações em frequência específica. A determinação do melhor comprimento de onda de uma solução colorida é feita a partir de medidas espectrofotométricas a cada 25 nm, varrendo todo o espectro de luz visível ( nm). A partir disso, se

4 determina a Curva Padrão, Curva de Calibração ou Curva de Referência que corresponde a relação gráfica entre os valores de absorbância (A) e os valores de concentração. A partir da análise gráfica é possível verificar a linearidade da reação e calcular um fator de conversão de valores de absorbância em valores de concentração. B- DOSEAMENTO DE GLICOSE Doseamento de glicose (método da glicose-oxidase) A dosagem de glicose em fluídos biológicos como soro, LCR (liquor cefaloraquidiano) e urina são de extrema utilidade no diagnóstico de doenças que afetam o metabolismo glicídico. Vários métodos analíticos espectrofotométricos estão disponíveis para determinação da glicose em fluídos biológicos. Métodos baseados em reações de oxido-redução, reações com aminas aromáticas e enzimáticos podem ser utilizados. Contudo, metodologias utilizando sistemas enzimáticos estão, dia a dia, ganhando a preferência dos laboratórios clínicos, devido a sua simplicidade operacional, manuseio de reagentes não cáusticos e especificidade analítica. O método enzimático baseado na glicose oxidase catalisa a oxidação da glicose de acordo com a seguinte reação.

5 A H 2 O 2 formada reage com a 4-aminoantipirina e fenol, sob ação da enzima peroxidase, através de uma reação oxidativa de acoplamento formando o composto antipirilquinonimina, que possui cor vermelha. A intensidade da cor do composto formado é proporcional à concentração de glicose na amostra. Técnica: Branco (B) Padrão (P) Amostras (A) Padrão de Glicose (No 2) - 10 µl - Soro (amostra) µl Reagente Cromogênico (No 1) 1,0 ml 1,0 ml 1,0 ml Misturar e incubar a 37 o C por 15 minutos Retirar do banho-maria e ler as absorbâncias em 505 nm Cálculos: Glicose mg/dl = Abs. Amostra x 100 Abs. do Padrão Para obter valores em mmol/l mg/ dl x 0,0555 = mmol/l Valores de referência: (método da glicose-oxidase) a) Plasma (jejum 8-12 horas) - 70 a 100 mg/ dl b) Liquor - 40 a 74 mg/ dl CASO CLÍNICO: Um jovem de 16 anos foi internado com severa acidose metabólica. O valor de ph do sangue observado foi de 7,1 (normal: 7,35-7,45); 320 mg/dl de glicemia (normal: mg/dl); corpos cetônicos 23 mm (normal: <0,2 mm). O paciente apresentava também halitose cetônica. Seu homograma acusava um aumento de linfócitos. O paciente foi imediatamente tratado com insulina e após algum tempo observou-se que todos os parâmetros clínicos haviam voltado ao normal. O paciente ficou ainda sob observação para garantir que seu quadro clínico estava estável.

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