BIOQUÍMICA EXPERIMENTAL

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1 Departamento de Bioquímica Instituto de Química USP Apostila de protocolos BIOQUÍMICA EXPERIMENTAL QBQ 036N 203 Professores Carlos Takeshi Hotta Guilherme Menegon Arantes Esta apostila foi desenvolvida originalmente por: Bayardo B. Torres Iolanda M, Cuccovia Maria Têresa Machini Miranda Pedro Soares de Araújo Remo Trigoni Jr. Sandro R. Marana

2 Prática Lise de células de levedura Objetivos romper células de Saccharomyces cerevisiae. Reagentes Materiais Aparelhos água destilada células de levedura (fase log tardia) etanol (EtOH) banho de gelo pérolas de vidro 0,5 mm ø pipetadores centrífuga estufa freezer 00 mm fluoreto de α-fenilmetilsulfonila pipetas vórtice (PMSF) em EtOH hipoclorito de sódio 20 g/l (água sanitária) tampão fosfato 00 mm ph 7,0 com 5 mm EDTA (tampão de lise) provetas suporte para tubos tubos de centrífuga tubos de ensaio tubos Falcon Procedimento A Fracionamento celular ATENÇÃO! MANTENHA OS TUBOS DE ENSAIO EM GELO. Em um tubo de centrífuga com tampa colocar aproximadamente g (peso úmido) de células de leveduras crescidas até a fase logarítmica tardia 2. Adicionar 4 ml de tampão de lise 3. Ressuspender as células usando um vórtice 4. Adicionar 40 µl de PMSF (00 mm) em etanol 5. Homogeneizar em vórtice 6. Adicionar à suspensão 8 ml de pérolas de vidro lavadas e secas 7. Agitar ininterruptamente em vórtice durante min (processo de lise) 8. Resfriar em banho de gelo por min 9. Repetir as operações 7 e 8 por mais 4 vezes 0. Centrifugar a suspensão de células + pérolas de vidro a 850g por 2 min. Remover cuidadosamente o sobrenadante evitar coletar o material precipitado passando-o para um tubo Falcon limpo e identificado como LISADO 2. Manter o tubo LISADO em banho de gelo 3. Ressuspender o precipitado + pérolas de vidro em 4 ml de tampão de lise 4. Adicionar 40 µl de PMSF (00 mm) em etanol 5. Homogeneizar em vórtice 6. Repetir as etapas 0 a 5 por mais 2 vezes, reunindo os sobrenadantes no mesmo tubo LISADO 7. Usando uma proveta, determinar o volume do LISADO 8. Dividir o lisado em 3 alíquotas de igual volume e transferí-las para tubos Falcon 9. Identificar os tubos com o número do grupo para armazenagem em freezer a 20 o C Procedimento B Lavagem das pérolas de vidro (executado pelas técnicas). Transferir as pérolas de vidro para um erlenmeyer 2. Adicionar hipoclorito de sódio no erlenmeyer 3. Agitar algumas vezes durante 5 min 4. Descartar cuidadosamente o hipoclorito de sódio (2x) 5. Adicionar água no erlenmeyer 6. Lavar as pérolas 7. Descartar cuidadosamente a água 8. Repetir as etapas 6 a 8 por mais 5 vezes 9. Adicionar etanol no erlenmeyer 0. Colocar o erlenmeyer numa estufa e aguardar a secagem das pérolas 2

3 Prática 2 Dosagem de proteína Objetivos dosar colorimetricamente proteínas no lisado de Saccharomyces cerevisiae. Reagentes Materiais Aparelhos água destilada albumina 0,2 g/l lisado de leveduras (P) reagente de Bradford (ácido fosfórico 85%, Coomassie Blue G, metanol) papel de filtro cubetas para leitura pipetadores pipetas ponteiras suporte para tubos tubos de ensaio Procedimento A Curva-padrão de proteína. Adicionar em cada tubo os volumes de albumina e água estipulados na Tabela 2. Adicionar o reagente de Bradford 3. Homogeneizar em vórtice 4. Aguardar 5 minutos com os tubos em temperatura ambiente 5. Usar o branco para calibrar ( zerar ) o espectrofotômetro 6. Ler as absorbâncias a 595 nm 7. Completar a Tabela 2 8. Construir a curva-padrão para detecção de proteínas com reagente de Bradford espectrofotômetro vórtice tubos Albumina 0,2 g/l (µl) Tabela Água (µl) Branco 0 00,0 0 90, , , , , , , ,0 Reagente de Bradford tubos Tabela 2 Massa de proteína (mg) A 595 3

4 Procedimento B Dosagem de proteínas no lisado de Saccharomyces cerevisiae OBSERVAÇÃO: para esse procedimento é necessário que o lisado seja diluído. Para isso segue o procedimento para diluição 00x:. Transferir 0, ml do lisado para um tubo de ensaio grande identificado como L00X 2. Adicionar 9,9 ml de água destilada. 3. Homogeneizar em vórtice.. Adicionar em cada tubo os volumes de água e amostras do lisado diluído estipulados na Tabela 3 2. Adicionar o reagente de Bradford 3. Homogeneizar em vórtice 4. Aguardar 5 minutos com os tubos em temperatura ambiente 5. Usar o branco para calibrar ( zerar ) o espectrofotômetro 6. Ler as absorbâncias a 595 nm 7. Completar a Tabela 4 OBSERVAÇÃO: Caso a absorbância das amostras experimentais esteja fora dos limites das absorbâncias obtidas na curva-padrão, discuta com o professor ou monitor um novo valor de diluição. Tabela 3 tubos L00x (µl) Água (µl) Reagente de Bradford Branco 0 00,0 A 00 0,0 A ,0 A ,0 A ,0 Tabela 4 A A2 A3 A4 tubos A 595 4

5 Prática 3 Determinação da atividade enzimática Objetivos determinar a atividade da α-glicosidase no lisado de Saccharomyces cerevisiae. Reagentes Materiais Aparelhos água destilada lisado de leveduras (P) banho de gelo microplacas de 96 poços banho a 30 o C espectrofotômetro de 8 mm p-nitrofenil-α-glicosídeo (NPαGlc) pipetadores microplacas em água tampão fosfato 200 mm (ph 7,0) pipetas ponteiras vórtice tampão carbonato-bicarbonato 250 mm suportes para tubos de ensaio (ph,0) tubos de ensaio Procedimento A diluição do lisado de Saccharomyces cerevisiae ATENÇÃO! MANTENHA OS TUBOS DE ENSAIO EM GELO Abaixo segue o procedimento sugerido para a diluição da preparação do lisado de Saccharomyces cerevisiae.. Transferir 0,2 ml do lisado de Saccharomyces cerevisiae para um tubo identificado como L0X 2. Adicionar,8 ml de água destilada gelada e homogeneizar suavemente 3. Transferir 0,4 ml de L0X para um novo tubo identificado como L50X 4. Adicionar,6 ml de água destilada gelada e homogeneizar suavemente 5. Transferir 0,2 ml de L50X para um novo tubo identificado como L500X 6. Adicionar,8 ml de água destilada gelada e homogeneizar suavemente 7. Manter todos os tubos no gelo Procedimento B determinação da atividade da α-glicosidase ATENÇÃO! Este procedimento deve ser feito para cada uma das diferentes diluições do lisado que foram preparadas. Todos estes ensaios podem ser montados simultaneamente, iniciando o procedimento sempre pela adição do substrato. Somente quando todos os tubos já tiverem recebido o substrato deverá ser iniciada a adição das diferentes diluições de lisado.. Preparar os tubos em banho de gelo 2. Adicionar em cada tubo os volumes de NPαGlc estipulados na Tabela 3. Adicionar em cada tubo o lisado devidamente diluído 4. Transferir simultaneamente todos os tubos para o banho a 30 o C 5. Incubar os tubos pelos intervalos de tempos indicados na Tabela 6. Ao remover cada tubo, interromper a reação enzimática adicionando 2 ml de tampão carbonatobicarbonato ph,0 7. Agitar manualmente e deixar os tubos em temperatura ambiente 8. Colocar 00 µl de cada tubo em três pocinhos da sua microplaca de 96 poços, não se esqueça de anotar a posição de cada tubo 9. Uma vez que a placa esteja preparada, ler as absorbâncias a 420 nm no leitor de microplacas 0. Completar as Tabelas 2 a 4 5

6 Tabela tubos 8 mm tampão lisado diluído tempo de NPαGlc fosfato ph 7,0 incubação a 30 o C (min) 0, 0, 0, , 0, 0, , 0, 0, , 0, 0,2 20 Branco de enzima - - 0,4 20 Branco de substrato* 0,2 0,2 - - * preparar somente um tubo Tabela 2 L0x tubos réplica Branco de enzima Branco de substrato tubos réplica Branco de enzima Branco de substrato tubos réplica Branco de enzima Branco de substrato Tabela 3 L50x Tabela 4 L500x média média média.4 Curva padrão do NPαGlc Abs 420 nm y = x R² = NPαGlc (nmol) 6

7 Prática 4 Caracterização da enzima ph ótimo Objetivos Determinar o efeito do ph na atividade catalítica da α-glicosidase. Reagentes Materiais Aparelhos água destilada lisado de leveduras (P) banho de gelo microplacas de 96 poços banho a 30 o C espectrofotômetro de 8 mm p-nitrofenil-α-glicosídeo (NPαGlc) pipetadores microplacas em água tampão borato 200 mm (ph 8,0) tampão borato 200 mm (ph 9,0) tampão citrato 200 mm (ph 4,0) tampão citrato 200 mm (ph 5,0) tampão citrato 200 mm (ph 6,0) tampão carbonato-bicarbonato 250 mm (ph,0) pipetas ponteiras suportes para tubos de ensaio tubos de ensaio vórtice Procedimento A diluição do lisado de Saccharomyces cerevisiae Deve ser dada preferência para a diluição que gerou a melhor medida de atividade enzimática na prática anterior. Caso não seja possível utilizá-la, abaixo segue o procedimento sugerido para a diluição da preparação do lisado de Saccharomyces cerevisiae. Transferir 0,2 ml do lisado de Saccharomyces cerevisiae para um tubo identificado com L0X 2. Adicionar,8 ml de água destilada gelada e homogeneizar suavemente 3. Transferir 0, ml de L0X para um novo tubo identificado com L00X 4. Adicionar 4,9 ml de água destilada gelada e homogeneizar suavemente 5. Manter no gelo Procedimento B Ensaio da atividade enzimática. Realizar os ensaios de atividade enzimática sobre p-nitrofenil-α-glicosídeo (NP α Glc) em 6 diferentes valores de ph 2. Preparar em banho de gelo, para todos os tampões diferentes, um conjunto de tubos para os ensaios de atividade de acordo com a Tabela 3. Misturar cuidadosamente 4. Adicionar o lisado (devidamente diluído) de Saccharomyces cerevisiae 5. Agitar manualmente com cuidado 6. Transferir todos os tubos do gelo ao mesmo tempo para um banho a 30 o C 7. Incubar os tubos pelos intervalos de tempos indicados na Tabela 8. Ao retirar cada tubo do banho, interromper a reação enzimática pela adição de 2 ml de tampão carbonato-bicarbonato 9. Agitar manualmente e deixar os tubos em temperatura ambiente 0. Colocar 00 µl de cada tubo em três pocinhos da sua microplaca de 96 poços, não se esqueça de anotar a posição de cada tubo. Uma vez que a placa esteja preparada, ler as absorbâncias a 420 nm no leitor de microplacas 2. Completar as Tabelas 2, 3 e 4 3. Determinar graficamente o ph ótimo da α-glicosidase 7

8 tubos 8 mm NPαGlc ph = Tabela Tampão ph lisado diluído tempo (min) 0, 0, 0, , 0, 0, , 0, 0, , 0, 0,2 20 Tabela 2 ph = 4,0 ph = 5,0 Tubos réplica Média Tubos réplica Média Tabela 3 ph = 6,0 ph = 8,0 Tubos réplica Média Tubos réplica Média Tabela 4 Tubos réplica ph = 9,0 Média 8

9 Tratamento de dados e análise dos resultados para o relatório Prática Lise de células de levedura Prática 2 Dosagem de proteína Prática 3 Determinação da atividade enzimática Prática 4 Caracterização da enzima ph ótimo O relatório deverá conter as seguintes informações:. A concentração de proteínas no lisado (mg/ml) e a quantidade total de proteínas obtidas (mg). Para obter esta informação será necessário calcular: a) Plotar a curva padrão da concentração de proteína pela Abs 595nm b) Calcular a equação da reta para o gráfico plotado c) A concentração de proteínas (mg/ml) no L00x d) A concentração de proteínas (mg/ml) no lisado inicial 2. A concentração da atividade enzimática (mu/ml) e no lisado em ph 7,0. Para obter esta informação será necessário calcular: a) Converter a Abs420nm em concentração de NPαGlc (mm) b) Plotar um gráfico com a concentração de NPαGlc (mm) pelo tempo para cada concentração de lisado c) Calcular a equação da reta para o gráfico plotado d) Utilizar a equação da reta para calcular a atividade enzimática (mu) de cada concentração de lisado e) Calcular a concentração da atividade enzimática (mu/ml) do lisado original, não se esqueça de corrigir pela diluição f) Calcular a atividade específica do lisado (mu/mg) 3. O gráfico com a concentração a atividade enzimática (mu/ml) em diversos ph. Para obter esta informação será necessário calcular: a) Converter a Abs420nm em concentração de NPαGlc para cada ph b) Plotar o gráfico do aumento da concentração de NPαGlc ao longo do tempo para cada ph c) Calcular a equação da reta para o gráfico plotado d) Utilizar a equação da reta para calcular a atividade enzimática em cada ph e) Calcular a atividade enzimática relativa em cada ph. A atividade enzimática relativa é a porcentagem da atividade enzimática em cada ph em relação à maior atividade enzimática observada (incluir as medidas da P3 em ph 7,0 na análise) f) Plotar um gráfico com a atividade enzimática relativa pelo ph do tampão Além disso, o relatório deverá conter as respostas das seguintes perguntas: a) Qual a razão de se manter o lisado em gelo? b) Por que foi adicionado 00 mm PMSF ao tampão de lise? c) Qual é a razão de se usar um branco ao utilizar o espectrofotômetro? d) Por que se utiliza NPαGlc para medir a atividade enzimática da α-glicosidase? e) Qual é a razão de se utilizar um branco do substrato e um branco da enzima? f) Em qual ph a atividade da enzima deve ser máxima? Como o ph de um tampão pode influenciar na atividade enzimática? 9

10 Prática 5 Purificação de proteínas cromatografia de troca iônica Objetivos Isolar a α-glicosidase utilizando resina de troca iônica. Procedimento A Hidratação da DEAE-Sephadex (executado pelas técnicas) Pesar 0,5 g de DEAE-Sephadex em um béquer. Adicionar 00 ml de tampão fosfato 0 mm ph 6,8 2. Misturar bem utilizando um bastão de vidro 3. Decantar de um dia para o outro Procedimento B Montagem da coluna de troca iônica (executado pelas técnicas) Montagem da coluna. Utilizar o barril de uma seringa (20 ml) como suporte da resina 2. Prender a seringa em um suporte 3. Colocar um pouco de lã de vidro no seu interior 4. Compactar a lã de vidro na base utilizando um bastão de vidro 5. Lavar a coluna com água destilada para retirar fragmentos de lã de vidro 6. Adaptar uma mangueira de aproximadamente 6 cm na saída da pipeta 7. Fechar a mangueira com uma presilha Processo de empacotamento 8. Fechar a presilha 9. Homogeneizar com um bastão de vidro a suspensão contendo a resina (Procedimento A) 0. Adicionar a suspensão até a marca de,0 ml. Deixar decantar 2. Repetir essa operação até a resina sedimentada ocupar o interior da seringa até,0 ml 3. Com a resina empacotada, lavá-la com 20 ml de tampão fosfato 0 mm sem NaCl 4. Após a lavagem, fechar a presilha 5. Deixar 3 mm de tampão acima do topo da resina 6. NUNCA DEIXAR A RESINA SECAR 0

11 Procedimento C Cromatografia de troca iônica Preparação da amostra. Descongelar o lisado, transferir uma alíquota de,0 ml para um tubo tipo eppendorf e centrifugar a g por 3 s. Coletar o sobrenadante para usar nas etapas abaixo. 2. Parte de material (0,4 ml) será usada na cromatografia abaixo, enquanto que o restante (0,6 ml) deverá ser guardado (congelado) para os próximos passos. Preparação da coluna 3. Diluir 0,4 ml do sobrenadante do lisado (ver etapa anterior) adicionando 0,6 ml de tampão fosfato 0 mm sem NaCl. É muito importante que apenas o sobrenadante do lisado seja usado para evitar entupimento da coluna. 4. Verificar se a presilha está fechada. 5. Utilizar uma pipeta para transferir toda a amostra (devidamente diluída) homogeneamente para a coluna. 6. Colocar o tubo na saída da coluna e abrir a presilha. 7. Deixar a amostra escoar pela coluna até cerca de 3 mm acima do topo da resina. 8. Fechar a presilha e transferir o tubo para o gelo. Eluição das proteínas não retidas pela coluna 9. Adicionar cuidadosamente tampão fosfato sem NaCl (2 ml) 0. Colocar o tubo 2 na saída da coluna e abrir a presilha permitindo que o tampão flua pela resina. Coletar ml em cada tubo de ensaio 2. Trocar o tubo de ensaio e sempre adicionar mais ml de tampão 3. Fechar a presilha ao final da coleta do tubo 8 4. Adicionar cuidadosamente mais,0 ml de tampão. Assim, acima da resina deverá haver 2,0 ml de tampão 5. Coletar mais dois tubos, sem adicionar tampão 6. Ao final da coleta do tubo 0, o tampão deverá estar cerca de 3 mm acima do topo da resina Eluição das proteínas retidas pela coluna 7. Adicionar cuidadosamente tampão fosfato com NaCl (2,0 ml) 8. Abrir a presilha e permitir que o tampão flua pela resina 9. Coletar,0 ml em cada tubo de ensaio 20. Trocar o tubo de ensaio e sempre adicionar mais ml de tampão 2. Fechar a presilha ao final da coleta do tubo Adicionar,0 ml de tampão. Assim, acima da resina deverá haver 2,0 ml de tampão 23. Coletar mais dois tubos, sem adicionar tampão 24. Fechar a presilha ao final da coleta do tubo 20. Não deixar a coluna secar

12 Procedimento D Identificação das frações que contêm a α-glicosidase ATENÇÃO! MANTENHA OS TUBOS DE ENSAIO EM GELO. Preparar um conjunto de tubos numerados de a 20. Adicionar em cada tubo 0,2 ml de 4mM NPαGlc 2. Transferir os tubos em banho de gelo 3. Adicionar em cada um destes tubos 0,2 ml das frações coletadas durante a cromatografia 4. Transferir todos os tubos ao mesmo tempo para um banho de 30 o C 5. Incubar os tubos por 0 min 6. Ao remover os tubos, adicionar em cada um 2 ml de tampão carbonato-bicarbonato ph,0 7. Agitar manualmente e deixar os tubos em temperatura ambiente 8. Colocar 00 µl de cada tubo em três pocinhos da sua microplaca de 96 poços 9. Uma vez que a placa esteja preparada, ler as absorbâncias a 420 nm no leitor de microplacas 7. Completar a Tabela 8. Construir um gráfico Absorbância versus números dos tubos 9. Uma vez identificados os tubos que contém atividade enzimática, reunir as frações (eluídas na cromatografia) correspondentes em um tubo Falcon identificado como MATERIAL DEAE número do grupo Tabela tubos A 420 tubos A Procedimento E Determinação da atividade enzimática do lisado de S. cerevisiae ATENÇÃO! MANTENHA OS TUBOS DE ENSAIO EM GELO Todos os tubos deste ensaio podem ser montados simultaneamente, iniciando o procedimento sempre pela adição do substrato. Somente quando todos os tubos já tiverem recebido o substrato deverá ser iniciada a adição do sobrenadante do lisado previamente diluído.. Diluir o sobrenadante do lisado (utilizar a diluição escolhida na P3) 2. Adicionar em cada tubo os volumes de NPαGlc estipulados na Tabela 2 3. Adicionar em cada tubo o sobrenadante do lisado devidamente diluído 4. Transferir todos os tubos ao mesmo tempo para o banho a 30 o C 5. Incubar os tubos pelos intervalos de tempos indicados na Tabela 2 6. Ao remover cada tubo, interromper a reação enzimática adicionando 2 ml de tampão carbonatobicarbonato ph,0 7. Agitar manualmente e deixar os tubos em temperatura ambiente 8. Colocar 00 µl de cada tubo em três pocinhos da sua microplaca de 96 poços 9. Uma vez que a placa esteja preparada, ler as absorbâncias a 420 nm no leitor de microplacas 0. Completar a Tabela 3. Com os dados obtidos determinar a concentração de atividade enzimática de α-glicosidase(mu/ml) presente no sobrenadante do lisado. 2

13 tubos 4 mm NPαGlc Tabela 2 água destilada lisado diluído tempo de incubação a 30 o C (min) 0,2-0, ,2-0, ,2-0, ,2-0,2 20 Branco da enzima - 0,2 0,2 20 Branco do substrato 0,2 0,2 - - tubos réplica Branco da enzima Tabela 3 média Procedimento F Determinação da atividade enzimática no material DEAE Este procedimento pode ser feito junto com o procedimento E. Dilua o material DEAE, transferindo 0,2 ml do material DEAE e,8 ml de água destilada para um tubo identificado como DEAE-0X. Homogeneizar suavemente e manter no gelo 2. Adicionar em cada tubo de ensaio os volumes de NPαGlc e material DEAE (diluído 0x) estipulados na Tabela 4 3. Transferir todos os tubos ao mesmo tempo para um banho a 30 o C e incubar os tubos pelos intervalos de tempos indicados na Tabela 4 4. Ao remover cada tubo, interromper a reação enzimática adicionando 2 ml de tampão carbonatobicarbonato ph,0 5. Agitar manualmente e deixar os tubos em temperatura ambiente 6. Colocar 00 µl de cada tubo em três pocinhos da sua microplaca de 96 poços 7. Uma vez que a placa esteja preparada, ler as absorbâncias a 420 nm no leitor de microplacas e completar a Tabela 5 8. Calcular a atividade da α-glicosidade no Material DEAE. Tabela 4 tubos tubos réplica mm NPαGlc Material DEAE (diluído 0x) tempo de incubação a 30 o C (min) 0,2 0, ,2 0, ,2 0, ,2 0,2 20 Tabela 5 média 3

14 Procedimento G Dosagem de proteínas do material DEAE ATENÇÃO! O material DEAE usado neste procedimento não deve ser diluído. Adicionar em cada tubo os volumes de água e material DEAE estipulados na Tabela 6 2. Adicionar o reagente de Bradford 3. Homogeneizar em vórtice e aguardar 5 minutos 4. Usar o branco para calibrar (zerar) o espectrofotômetro 5. Ler as absorbâncias a 595 nm utilizando cubetas 6. Completar a Tabela 7 Tabela 6 Tubos Material DEAE Água Reagente de Bradford Branco - 0,,0 0, -,0 2 0, -,0 3 0, -,0 Tabela 7 Tubos A595 Massa de proteína (mg) 2 3 Volume de amostra Concentração de proteína (mg/ml) Procedimento H Dosagem de proteínas do material DEAE ATENÇÃO! O material DEAE usado neste procedimento não deve ser diluído Este procedimento pode ser feito junto com o procedimento G. Diluir 20x o lisado obtido após centrifugação. Transferir 0, ml do lisado para um tubo e adicionar,9 ml de água destilada 2. Adicionar em cada tubo os volumes de lisado diluído estipulados na Tabela 8 3. Homogeneizar em vórtice e aguardar 5 minutos 4. Usar o branco para calibrar (zerar) o espectrofotômetro 5. Ler as absorbâncias a 595 nm utilizando cubetas 6. Completar a Tabela 9 Tabela 8 Tubos Material DEAE Água Reagente de Bradford 0, -,0 2 0, -,0 3 0, -,0 Tabela 9 Tubos A595 Massa de proteína (mg) 2 3 Volume de amostra Concentração de proteína (mg/ml) 4

15 Tratamento de dados e análise dos resultados para o relatório 2 Prática 5 Purificação de proteínas cromatografia de troca iônica O relatório deverá conter as seguintes informações:. Um gráfico contendo a atividade enzimática medida na fração eluída pelo número do tubo coletado. Indique o momento em que a coluna foi eluída com NaCl. 2. A atividade enzimática (mu) total adiciona na coluna de cromatografia. Para obter esta informação, será necessário calcular: a) a concentração de atividade enzimática (mu/ml) de α-glicosidase no lisado 3. A atividade específica da α-glicosidase (mu/mg) do lisado. Para obter esta informação, será necessário calcular: a) a concentração de proteínas (mg/ml) de α-glicosidase no lisado 4. A atividade enzimática (mu) total recuperada após a passagem pela coluna de cromatografia. Para obter esta informação, será necessário calcular: b) a concentração de atividade enzimática (mu/ml) de α-glicosidase no material DEAE 5. A atividade específica da α-glicosidase (mu/mg) do material DEAE. Para obter esta informação, será necessário calcular: b) a concentração de proteínas (mg/ml) de α-glicosidase no material DEAE 6. O cálculo da recuperação e o enriquecimento da α-glicosidase após a cromatografia de troca iônica a) A recuperação é a proporção da atividade enzimática total adicionada à coluna de cromatografia que foi recuperada no material DEAE b) O enriquecimento é quantas vezes a atividade específica da α-glicosidase aumentou após a passagem pela coluna de cromatografia (atividade específica do material DEAE dividida pela atividade específica do lisado). 5

16 Prática 6 Purificação de proteínas SDS-PAGE Objetivos Analisar a composição de proteínas do material eluído na cromatografia de troca-iônica que contém atividade de α-glicosidase. Reagentes tampão de amostra água solução C glicerol 00 g/l SDS 5 g/l azul de bromofenol β-mercaptoetanol 3,55 ml,25 ml 2,50 ml 2,00 ml 0,20 ml 0,05 ml solução A acrilamida N N bis metilenoacrilamida água 29,2 g 0,80 g 00 ml solução de coloração Coomassie blue R metanol ácido acético água 0, g 40 ml 0 ml 50 ml solução B,5 M Tris (acertar valor de ph com HCl) ph 8,8 solução de descoloração metanol ácido acético água 40 ml 0 ml 50 ml solução C 0,5 M Tris (acertar valor de ph com HCl) ph 6,8 tampão de corrida tris 3,03 g glicina 4,4 g 00 g/l SDS,0 g água L Obs.: Não acertar o ph desta solução tampão Procedimento A preparação das amostras. Aplicar as seguinte amostras no gel de SDS-PAGE: a. lisado de Saccharomyces cerevisiae (30 µl) b. frações eluídas na cromatografia de troca-iônica e que contém alfa-glicosidase, denominado Material DEAE (maior volume possível até ml) Diálise das amostras 2. Transferir para um microtubo o volume indicado de amostra. 3. Identificar o microtubo com: a. Nome da amostra. b. Número do grupo. 4. Adicionar água, caso necessário, até completar 600 µl 5. Cobrir o microtubo com um pedaço de membrana de diálise 6. Prender a membrana de diálise com um anel de borracha 7. Transferir o microtubo para um suporte de isopor 8. Colocar o suporte dentro de um béquer contendo água 9. Manter em agitação por pelo menos 6 h 6

17 Secagem a vácuo (executado pelas técnicas) 0. Após a diálise, transferir as amostras para um concentrador a vácuo. Secar as amostras Desnaturação das proteínas presentes nas amostras 2. Transferir para cada microtubo 20 µl de tampão de amostra 3. Transferir os microtubos para um banho fervente 4. Incubar os microtubos por 5 min 5. Aplicar as amostras no gel de eletroforese com o auxílio de micropipetadores Procedimento B preparação do gel de SDS-PAGE (feito pelas técnicas) Preparação do gel de separação. Adicionar em um tubo os volumes estipulados na Tabela 2. Homogeneizar rapidamente 3. Transferir a mistura, utilizando uma pipeta Pasteur, para as placas de vidro previamente montadas 4. Aguardar a polimerização cerca de 60 min 5. Colocar o pente sobre entre as placas de vidro Preparação do gel de empilhamento 6. Após a polimerização do gel de separação, adicionar em outro tubo os volumes estipulados na Tabela 2 7. Homogeneizar rapidamente 8. Transferir a mistura, utilizando uma pipeta Pasteur, para as placas de vidro (com o pente) contendo o gel de separação polimerizado 9. Aguardar a polimerização cerca de 40 min 0. Após a polimerização do gel de empilhamento, retirar cuidadosamente o pente. Adicionar o tampão de corrida Tabela soluções volume água 4,02 ml 00 g/l SDS 00 µl solução A 3,33 ml solução B 2,5 ml TEMED 5 µl persulfato de amônio 50 µl Tabela 2 soluções volume água 3,05 ml 00 g/l SDS 50 µl solução A 0,65 ml solução C,25 ml TEMED 5 µl persulfato de amônio 25 µl 7

18 Procedimento C eletroforese, coloração e descoloração. Correr a eletroforese com 00V, durante aproximadamente 40 min 2. Desligar a fonte quando o corante marcador de frente atingir a base do gel 3. Desconectar os cabos 4. Retirar o gel 5. Colocar o gel no frasco contendo a solução de coloração 6. Corar o gel por 40 min 7. Retirar o gel do frasco de coloração 8. Colocar o gel no frasco contendo a solução de descoloração 9. Descorar o gel 0. Visualizar as bandas de proteínas Procedimento D desidratação do gel (opcional). Colocar o gel num frasco contendo água 2. Trocar tantas vezes quanto for necessário a água do frasco até a remoção completado ácido acético 3. Retirar o gel hidratado do frasco com água 4. Colocar o gel num frasco contendo solução de glicerol 50 g/l 5. Molhar com a solução de glicerol lâminas de celofane natural 6. Dispor as folhas de celofane sobre placas limpas de vidro 7. Colocar os géis sobre as lâminas de celofane devidamente hidratadas e limpas 8. Colocar outra folha de celofane previamente hidratada sobre o gel, formando assim um sanduíche. 9. Retirar delicadamente as bolhas de ar que estiverem aprisionados pelas folhas de celofane 0. Esticar as folhas e prendê-las. Deixar secar à temperatura ambiente Fórmula estruturais e massas molares 8

19 Prática 7 Caracterização da α glicosidase: Km e Vmax Objetivos Caracterizar a α-glicosidase de Saccharomyces cerevisiae através das determinações da afinidade (K m ) da enzima pelo substrato (p-nitrofenol-α-glicosídeo) e da velocidade máxima (V max ) de hidrólise do substrato. Reagentes Materiais Aparelhos água destilada lisado de levedura,0 mm p-nitrofenil-α-glicosídeo (NPαGlc) em tampão fosfato 00 mm (ph 7,0) 2,0 mm NPαGlc em tampão fosfato 00 mm (ph 7,0) 8,0 mm NPαGlc em tampão fosfato 00 mm (ph 7,0) tampão carbonato-bicarbonato 250 mm (ph,0) tampão fosfato 00 mm (ph 7,0) banho de gelo microplacas de 96 poços pipetadores pipetas ponteiras suportes para tubos de ensaio tubos de ensaio banho a 30 o C espectrofotômetro de microplacas vórtice Procedimento A Diluição do lisado de Saccharomyces cerevisiae ATENÇÃO! MANTENHA OS TUBOS DE ENSAIO EM GELO Utilize a diluição usada na Prática 3. O volume total necessário será de 5,0 ml. Transferir 0, ml do lisado de Saccharomyces cerevisiae para um tubo identificado com L0X 2. Adicionar 0,9 ml de água destilada gelada 3. Homogeneizar SUAVEMENTE 4. Transferir 0,5 ml de L0X para um novo tubo identificado com L00X 5. Adicionar 4,5 ml de água destilada gelada 6. Homogeneizar SUAVEMENTE Procedimento B Medidas de velocidade da reação de hidrólise do substrato ATENÇÃO! MANTENHA OS TUBOS DE ENSAIO EM GELO. Adicionar em cada tubo os volumes de NPαGlc estipulados na Tabela. ATENÇÃO: prestar atenção nas diferentes concentrações de substrato 2. Preparar os tubos em banho de gelo 3. Adicionar em cada tubo os volume de tampão e lisado (devidamente diluído) estipulados na Tabela. Agitar manualmente com cuidado 4. Transferir todos os tubos do gelo para o banho a 30 o C 5. Incubar todos os tubos por 40 min (OU PELO DOBRO DO MAIOR TEMPO USADO NA PRÁTICA 3) 6. Remover todos os tubos do banho 7. Adicionar 2 ml de tampão carbonato-bicarbonato 8. Agitar manualmente e deixar os tubos em temperatura ambiente 9. Colocar 00 µl de cada tubo em três pocinhos da sua microplaca de 96 poços 0. Uma vez que a placa esteja preparada, ler as absorbâncias a 420 nm no leitor de microplacas e completar as Tabelas 2 e3. Construir os gráficos necessários para a determinação do K m e V max da α-glicosidase para o substrato utilizado 9

20 tubos mm NPαGlc 2 mm NPαGlc Tabela 8 mm NPαGlc Tampão fosfato 00 mm ph 7 Lisado diluído 0, ,28 0,0 2 0, ,26 0,0 6 0, ,22 0,0 4 0, ,8 0,0 5 0, ,4 0,0 6 0, ,0 0,0 7-0,6-0,4 0,0 8-0,20-0,0 0, ,0 0,20 0, ,3 0,7 0, ,5 0,5 0,0 Tabela 2 tubos réplica média Tabela 3 tubos [S] no tubo de ensaio (mm) média Produto (nmols) Tempo de reação (min) Velocidade (nmol/min) 20

21 Prática 8 Caracterização da α glicosidase: determinação de padrão de inibição por maltose Objetivos Determinar o padrão de inibição de maltose sobre a hidrólise de p-nitrofenil-α-glicosídeo (NPαGlc) efetuada pela -glicosidase de Saccharomyces cerevisiae Reagentes Materiais Aparelhos água destilada lisado de levedura,0 mm p-nitrofenil-α-glicosídeo (NPαGlc) em tampão fosfato 00 mm (ph 7,0) 2,0 mm NPαGlc em tampão fosfato 00 mm (ph 7,0) 8,0 mm NPαGlc em tampão fosfato 00 mm (ph 7,0) 0,4 M maltose em tampão fosfato 00 mm (ph 7,0),2 M maltose em tampão fosfato 00 mm (ph 7,0),6 M maltose em tampão fosfato 00 mm (ph 7,0) tampão carbonato-bicarbonato 250 mm (ph,0) em tampão fosfato 00 mm (ph 7,0) tampão fosfato 00 mm (ph 7,0) banho de gelo microplacas de 96 poços pipetadores pipetas ponteiras suportes para tubos de ensaio tubos de ensaio banho a 30 o C espectrofotômetro de microplacas vórtice Procedimento A Medidas da velocidade de reação de hidrólise do substrato na presença de inibidor ATENÇÃO! MANTENHA OS TUBOS DE ENSAIO EM GELO. Adicionar em cada tubo os volumes de NPαGlc e maltose estipulados na Tabela. ATENÇÃO: prestar atenção nas diferentes concentrações de substrato e inibidor 2. Adicionar em cada tubo os volume de tampão e lisado (devidamente diluído) estipulados nas Tabelas (grupos pares) e 2 (grupos ímpares). 3.. Agitar manualmente com cuidado. 4. Transferir todos os tubos do gelo para o banho a 30 o C 5. Incubar todos os tubos pelo dobro do tempo usado na prática 7 6. Remover todos os tubos do banho. 7. Adicionar 2 ml de tampão carbonato-bicarbonato. 8. Agitar manualmente e deixar os tubos em temperatura ambiente 9. Colocar 00 µl de cada tubo em três pocinhos da sua microplaca de 96 poços 0. Uma vez que a placa esteja preparada, ler as absorbâncias a 420 nm no leitor de microplacas e completar as Tabelas 3 e 4. Construir os gráficos necessários para a determinação do padrão de inibição da α-glicosidase por maltose. 2

22 tubos mm NPαGlc 2 mm NPαGlc Tabela (grupos pares) 8 mm NPαGlc 0,4 M maltose,2 M maltose Tampão fosfato 00 mm ph 7 Lisado diluído A 0, ,0-0,2 0,0 B 0, ,0-0,2 0,0 2A 0, , ,0 2B 0, , ,0 3A - 0,6-0,0-0,04 0,0 3B - 0,6-0,0-0,04 0,0 4A - 0,20-0, ,0 4B - 0,20-0, ,0 5A - - 0,0 0,0-0,0 0,0 5B - - 0,0 0,0-0,0 0,0 6A - - 0,5 0,0-0,05 0,0 6B - - 0,5 0,0-0,05 0,0 tubos mm NPαGlc 2 mm NPαGlc Tabela 2 (grupos ímpares) 8 mm NPαGlc 0,4 M maltose,2 M maltose Tampão fosfato 00 mm ph 7 Lisado diluído 7A 0, ,0 0,2 0,0 7B 0, ,0 0,2 0,0 8A 0, ,0-0,0 8B 0, ,0-0,0 9A - 0, ,0 0,04 0,0 9B - 0, ,0 0,04 0,0 0A - 0, ,0-0,0 0B - 0, ,0-0,0 A - - 0,0-0,0 0,0 0,0 B - - 0,0-0,0 0,0 0,0 2A - - 0,5-0,0 0,05 0,0 2B - - 0,5-0,0 0,05 0,0 Tabela 3 tubos [S] final (mm) A B 2A 2B 3A 3B 4A 4B 5A 5B 6A 6B [I] final (mm) réplica média 22

23 Tabela 4 tubos [S] final (mm) 7A 7B 8A 8B 9A 9B 0A 0B A B 2A 2B [I] final (mm) réplica média 23

24 Tratamento de dados e análise dos resultados para o relatório 3 Prática 6 Purificação de proteínas SDS-PAGE Prática 7 Caracterização da α glicosidase: Km e Vmax Prática 8 Caracterização da α glicosidase: determinação de padrão de inibição por maltose O relatório deverá conter as seguintes informações:. O provável peso molecular da α-glicosidase. Para obter esta informação, será necessário: a) Identificar a banda correspondente à α-glicosidase no gel de SDS-PAGE. b) Calcular o provável peso molecular relativo da enzima através dos padrões utilizados na eletroforese. 2. O Km e o Vmax da α-glicosidase. Para obter esta informação, será necessário: a) Calcular a velocidade inicial (nmol/min) da reação em todos os tubos da P7 b) Construir um gráfico de Michaelis-Menten para a α-glicosidase (velocidade inicial pela concentração de substrato no tubo de ensaio). c) Construir um gráfico de Lineweaver-Burk (/V pela /[S)] d) Determinar Km e o Vmax da α-glicosidase 3. Padrão de inibição da α-glicosidase pela maltose. Para obter esta informação, será necessário: a) Calcular a velocidade inicial (nmol/min) da reação em todos os tubos da P8, inclua os dados dos demais grupos b) Construir gráficos de Lineweaver-Burk na presença de concentrações diferentes de inibidor (/V pela /[S)] c) Determine o padrão de inibição da α-glicosidase pela maltose. Além disso, o relatório deverá conter as respostas das seguintes perguntas: a) Por que é necessário dialisar as amostras antes de correr o gel? b) Qual a razão de se fazer um gel de empilhamento em cima do gel de separação? c) Qual o papel do SDS? d) Como o peso molecular calculado se compara com o peso molecular estimado por outros trabalhos? e) Elabore uma hipótese de como a maltose funciona como um inibidor da α-glicosidase. 24