3M TM Petrifilm TM Placa para Contagem de Leveduras e Bolores. Guia de. Interpretação

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2 3M TM TM Placa para Contagem de Leveduras e Bolores Este guia apresenta resultados das placas 3M para Contagem de Leveduras e Bolores. Para mais informações, contate o representante de produtos microbiológicos da 3M do Brasil Ltda. A Placa 3M para Contagem de Leveduras e Bolores (YM) é um meio de cultura pronto para uso que contém um agente geleificante solúvel em água fria, nutrientes e um corante indicador para dar contraste e facilitar a contagem. 1 Contagem Total = 20 Contagem de Leveduras = 16 Contagem de Bolores = 4 Esta Placa 3M YM contém colônias de leveduras e bolores.

3 2 3 Contagem de Leveduras e Bolores = 0 A figura 2 mostra uma Placa 3M YM sem leveduras e bolores. Contagem Total Estimada ~500 Contagem Estimada de Leveduras ~480 Contagem de Bolores = 21 Quando o número de colônias é maior que 150, estime a contagem. Determine o número médio de colônias num quadrado (1cm 2 ) e multiplique-o por 30 para obter a contagem total por placa. A área inoculada é de aproximadamente 30 cm 2. A cor das colônias pode variar de pálida (como neste exemplo) a azul esverdeada. Contagem Estimada de Leveduras~INC (contagem atual > 10 4 ) A Placa 3M YM, na figura 4, contém colônias de leveduras incontáveis (INC). As colônias pequenas e azuis na borda da placa (realçadas na caixa) estão presentes na placa toda, embora menos visíveis. 4 Contagem Estimada de Bolores ~64 As colônias de bolores, na figura 5, estão começando a se aglomerar e sobrepor umas as outras na placa. Conte cada margem da colônia ou foco. A placa pode ser dividida em seções para facilitar a contagem. Neste exemplo, aproximadamente 1/4 da placa foi contada, e o número de colônias contado foi multiplicado por 4 para obter a contagem estimada na placa. A seção mostrada tem 16 bolores. 5

4 As placas nas figuras 6a e 6b são da mesma amostra. A figura 6a é uma diluição 1:10 e apresenta colônias pequenas, pálidas e numerosas, tornando difícil a contagem. A figura 6b é uma diluição 1:100 e mostra como a diluição do produto, para obter uma contagem menor que 150 colônias, facilita a contagem. Como na maioria dos meios, num ambiente altamente competitivo (como a figura 6a), o crescimento de colônias típicas será inibido. Para amostras altamente contaminadas, como esta, diluições maiores são recomendadas para obter uma contagem mais precisa e maior crescimento de colônias típicas (como na figura 6b). Contagem de Bolores ~INC Reação de Fosfatase 6a Contagem de Bolores = 64 6b 7 8 Contagem de Leveduras e Bolores = 0 Contagem de Leveduras e Bolores = 0 As Placas 3M YM utilizam o corante indicador da fosfatase. Por essa razão, alguns produtos alimentícios que contêm fosfatase podem causar uma reação de cor azul na Placa 3M YM. Dois tipos de reações de cor são encontradas: uma coloração de fundo azul uniforme ou pontos azuis intensos. A figura 7 mostra uma coloração de fundo azul uniforme e a figura 8 mostra um ponto azul intenso, muitas vezes encontrado em condimentos e produtos granulados. A figura 8 também mostra partículas de alimentos que produzem fosfatase. Para reduzir a reação da fosfatase, siga uma ou mais das técnicas a seguir: 1. Dilua a amostra: Diluições maiores da amostra irão minimizar a coloração azul de fundo ou reduzir o número de pontos azuis intensos. 2. Preparo da amostra: Misture a amostra e deixe sedimentar por 3 a 5 minutos antes de plaquear. Pipete a amostra da porção central do recipiente ou use saco para homogeneização com filtro a fim de evitar o plaqueamento de partículas. 3. Observe e anote: Observe as placas dentro de horas de incubação e anote qualquer mudança de cor a fim de auxiliar na interpretação final.

5 3M TM TM Instruções de Uso Placa para Contagem de Leveduras e Bolores Para informações detalhadas sobre PRECAUÇÕES, REJEIÇÃO DE GARANTIAS/RECURSO LIMITADO, RESTRIÇÕES DE RESPONSABILIDADE DA 3M, ARMAZENAMENTO E DESCARTE E INSTRUÇÕES DE USO VEJA A BULA DO PRODUTO. Armazenamento 1 Refrigere os pacotes fechados a < 8ºC. Use antes da data de vencimento impressa na embalagem. Antes do uso, deixe os pacotes atingirem a temperatura ambiente para abri-los. Preparo da Amostra Para selar os pacotes abertos, 2 3 dobre a extremidade e sele com fita adesiva. Para prevenir contra a exposição à umidade, não refrigere os pacotes abertos. Mantenha os pacotes re-selados num lugar fresco e seco por até um mês. Evite expor as placas a uma temperatura > 25ºC e/ou umidade relativa > 50%. Prepare a diluição da amostra. Pese Adicione a quantidade adequada de um dos ou pipete a amostra num recipiente diluentes estéreis a seguir: tampão fosfato de estéril, como saco para homogeneização ou frasco de diluição. Butterfield, água peptonada 0,1%, diluente salina peptonada (método ISO ), solução salina (0,85 0,90%), caldo letheen sem bissulfato ou água destilada. Misture ou homogeneize a amostra utilizando métodos de rotina. Não é necessário ajustar o ph da amostra, contudo, amostras com ph ajustado podem ser usadas. Não use tampões contendo citrato, bissulfato ou tiossulfato; eles podem inibir o crescimento. Se o tampão citrato for indicado no procedimento padrão, substitua-o por um dos tampões listados acima, pré-aquecido a 40-45ºC.

6 Inoculação Coloque a Placa 3M em uma superfície plana. Levante o filme superior. Com a 3M Pipeta Eletrônica ou equivalente, posicionada perpendicularmente a Placa 3M, coloque 1ml da amostra no centro do filme inferior. Desça o filme superior sobre a amostra Coloque o difusor do Leveduras e Bolores no centro da placa. Distribua a amostra pressionando delicadamente o centro do difusor. Não gire nem arraste o difusor. Retire o difusor. Espere 1 minuto, no mínimo, para o gel solidificar. Incubação Interpretação <70 F Métodos Listados: Estados Unidos * Contagem de Leveduras e Bolores em Alimentos: Método Oficial AOAC Incube as Placas com a face transparente para cima, em pilhas de até 20 placas a 20-25ºC por 3 e 5 dias. (Devido ao fato de que alguns bolores podem crescer rapidamente, pode ser interessante ler e contar as placas em 3 dias, pois pequenas colônias podem ser ocultadas pelos bolores maiores, crescidos em 5 dias. Se isto acontecer, a contagem com 3 dias pode ser usada; contudo, deve ser reportada como uma contagem estimada). As Placas 3M podem ser contadas em um contador de colônias comum ou outro sistema de amplificação. Canadá * Amostragem Ambiental: Placas para Contagem de Leveduras e Bolores Método MFLP-41A * Produtos Alimentícios e Ingredientes: Placas para Contagem de Leveduras e Bolores Método MFHPB-32

7 Diferenciação Macroscópica Se for necessário diferenciar colônias de leveduras e bolores nas Placas 3M Leveduras e Bolores, procure uma ou mais das seguintes características típicas, mencionadas abaixo. Contagem de Leveduras = 43 A figura 9 mostra colônias típicas de leveduras. Características típicas de leveduras incluem: A colônia é pequena A colônia tem borda definida A cor da colônia pode variar de pálida a azul-esverdeada A colônia pode aparecer elevada A cor da colônia é uniforme sem foco no centro (centro mais escuro) Diferenciação Microscópica 9 10 Contagem de Bolores = 29 A figura 10 mostra colônias típicas de bolores. Características típicas de bolores incluem: A colônia cresce espalhada A colônia tem borda difusa A cor da colônia pode variar, pois os bolores produzem uma variedade de pigmentos (marrom, bege, laranja, azul-esverdeado) A colônia aparece plana A colônia usualmente tem um foco no centro (usualmente mais escuro, mas também pode ser de cor diferente) Leveduras e bolores estão relacionados e nem sempre podem ser distinguidos um do outro sem exame microscópico. Figura 11 Figura 12 Figura 13 Figura 14 Figura 15 Para isolar as colônias para posterior identificação, levante o filme superior e remova a colônia do gel usando uma alça ou dispositivo similar. Transfira a colônia para uma lâmina de microscópio com uma gota de água estéril e cubra com uma lamínula. Observe o microscópio de imersão (óleo). As leveduras são tipicamente ovais e podem mostrar brotamento. Os bolores aparecem tipicamente como filamentos (micélio) retos ou ramificados. Os bolores mostrados acima estão em diferentes estágios de germinação.

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