4/8/2007. Análise de vitaminas

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1 Métodos ensaios biológicos em animais e humanos apenas usados quando não existem métodos alternativos ensaios microbiológicos com protozoários, bactérias e leveduras requerem passos de extracção da vitamina resultados representam o teor total da vitamina numa dada matriz, não necessariamente a sua biodisponibilidade restritos a vitaminas hidrossolúveis lentos aplicáveis a diversos materiais biológicos, não necessitando de grandes modificações requerem menor preparação de amostra que os métodos físico-químicos Métodos ensaios físico-químicos métodos espectrofotométricos, fluorimétricos, cromatográficos, enzimáticos, imunológicos e radiométricos requerem extracção das vitaminas resultados representam o teor total da vitamina numa dada matriz, não necessariamente a sua biodisponibilidade simples, precisos e rigorosos sobretudo os que usam HPLC aplicáveis à maioria das vitaminas 1

2 processos de extracção procedimentos específicos para cada vitamina usam: calor, ácidos, bases, solventes, enzimas ácido ascórbico extracção a frio com ácido metafosfórico/ácido acético vitaminas B 1 e B 2 aquecimento em ácido, seguido de tratamento enzimático niacina aquecimento em base (cereais) aquecimento em ácido (outros produtos) vitaminas A, E, D extracção com solvente orgânico, saponificação e nova extracção em solvente orgânico adição de antioxidantes vitamina A adição de um antioxidante no início do procedimento pirogalol HPLC é único método capaz de dar resultados rigorosos ex. determinação de vitamina A em leite infantil trabalhar sempre com luz artificial fraca amostra saponificada vitamina A extraída com solvente orgânico e concentrada evaporação sob N 2, com adição de hexadecano impedir degradação HPLC em coluna de sílica eluentes: heptano e isopropanol isocrático UV, 340 nm determinação de trans-retinol e cis-retinol 2

3 vitamina A trans-retinol(mg/ml) = A A T ST x W x DF V T cis-retinol(mg/ml) = A A C SC x W x DF V C A T área do pico de trans-retinol na amostra A ST área do pico de trans-retinol no padrão W T peso da amostra (mg) V volume da amostra (ml) A C área do pico de cis-retinol na amostra A SC área do pico de cis-retinol no padrão W C peso da amostra (mg) V volume da amostra (ml) vitamina E presente nos alimentos como 8 diferente compostos todos 6-hidroxicromanos,,, tocoferóis,,, tocotrienóis insaturados amostra saponificada sob refluxo, extraída com hexano e injectada num HPLC de fase normal detector de fluorescência ex = 290 nm; em = 330 nm para margarinas e cremes de barrar amostra dissolvida em hexano adiciona-se MgSO 4 para remover água extracto filtrado e analisado em HPLC amostras de óleo são dissolvidas em hexano e directamente injectadas em HPLC 3

4 vitamina E vitamina E saponificação feita na presença de pirogalol (antioxidante) e ao abrigo da luz quantificação feita por padrão externo 4

5 ácido L-ascórbico + ácido L-dehidroascórbico oxidação favorecida a ph elevado e na presença de iões Fe 3+ e Cu 2+ análise feita a baixo ph e na presença de agente quelante titulação com 2,6-dicloroindofenol ácido L-ascórbico oxidado pelo indicador no ponto final, indicador que não reage é rosado em meio ácido ácido L-dehidroascórbico determinado após conversão em ácido L-ascórbico 5

6 em soluções coradas, ponto final determinado por absorção electrónica a 545 nm DF ácido ascórbico (mg/ml) = C x V x WT C mg ácido ascórbico/ml indicador V volume de indicador usado na titulação (ml) WT peso da amostra (g) método microfluorométrico mede ácido L-ascórbico e ácido L-dehidroascórbico ácido ascórbico oxidado a ácido L-dehidroascórbico com o-fenilenediamina forma composto fluorescente ex = 356 nm, em = 440 nm ácido ascórbico (mg/ml) = A - B C - D DF x S x WT A e C fluorescência da amostra e do padrão B e D fluorescência dos brancos da amostra e do padrão S concentração do padrão (mg/ml) WT peso da amostra (g) 6

7 ex: determinação de por colorimetria com redução de iões cúpricos extracção (amostras húmidas - vegetais): picar amostra e pesar ~50 g adicionar 2 vezes peso de solução ácido metafosfórico a 5% homogeneizar em liquidificador retirar 5 20 g do extracto para balão de 100 ml completar volume com H 2 O agitar desprezar ~30 ml e adicionar 2 ml clorofórmio agitar e deixar sedimentar fase de CHCl 3 fica no fundo com fenóis, terpenos, vitaminas lipossolúveis, pigmentos e lípidos extracção (amostras secas leite em pó, sopas em pó, sumos em pó, ): pesar ~1-4 g de amostra finamente moída transferir para tubo de 70 ml com tampa de rosca adicionar 20 ml de H 2 SO N e ácido metafosfórico 5% (1:1) adicionar 2 ml CHCl 3 tapar e agitar deixar separar fases ou centrifugar CHCl 3 dissolve lípidos ácido ascórbico fica na fase aquosa 7

8 reacção: medir 5 ml da fase aquosa adicionar 1 ml de tampão acetato ph 4.6 e 5 ml de um reagente de complexação 95 ml de acetato cúprico 0.075% em álcool isoamílico + 5 ml 2,2-biquinolina 0.4% em tolueno tapar e agitar deixar separar fases ou centrifugar medir 3 ml da fase superior (álcool isoamílico) e adicionar 0.5 ml EtOH EtOH para clarificar ler absorvância a 545 nm contra branco construir curva padrão vitamina B 1 (tiamina) fosfatos de tiamina são extraídos e sofrem hidrólise enzimática segue-se purificação por cromatografia de permuta iónica tiamina oxidada a tiocromo determinado por fluorescência ex = 365 nm, em = 435 nm 8

9 vitamina B 1 tiocromo é fotosensível análise feita sob luz fraca S - Sb C 25 V0 tiamina (μg/g) = x x x Std - Std A V WT b P S e S b fluorescência da amostra e do padrão Std e Std b fluorescência dos brancos da amostra e do padrão C concentração do padrão (g/ml) A volume da alíquota (ml) 25 volume eluído na coluna (ml) V p volume que atravessa a coluna (ml) V 0 volume de diluição da amostra (ml) WT peso da amostra (g) vitamina B 2 (riboflavina) extracção, seguida de purificação determinação por fluorimetria ex = 440 nm, em = 565 nm riboflavina muito sensível a luz UV trabalhar sempre com luz pouco intensa riboflavina não dissolve bem em água cuidado a preparar padrões A - C CS DF riboflavina (mg/g) = x x B - A V WT A e C fluorescência da amostra contendo respectivamente água e hidrossulfito de sódio B fluorescência da amostra contendo padrão CS concentração do padrão (mg/ml) V volume da amostra (ml) WT peso da amostra (g) 9

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