UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSE Faculdade de Farmácia Departamento de Tecnologia Farmacêutica

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1 1 UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSE Faculdade de Farmácia Departamento de Tecnologia Farmacêutica ROTEIRO DE AULAS PRÁTICAS Enzimologia e Tecnologia das Fermentações Tecnologia Enzimática e das Fermentações Profª Drª Yanina Madalena de Arruda Calvette Profª Drª Sorele Batista Fiaux Niterói - RJ 2010

2 Sumário Normas para redação do relatório de aulas práticas das disciplinas MTC04004 e MTC Curva Padrão... 4 Procedimento Prático... 5 Questionário... Erro! Indicador não definido. Curva de Crescimento... 7 Procedimento Prático Curva de Crescimento... 9 Construção da Curva de Crescimento Questionário para discussão dos dados no relatório Questionário para estudos... Erro! Indicador não definido. Exercícios de Fixação... Erro! Indicador não definido. 2

3 3 NORMAS PARA REDAÇÃO DO RELATÓRIO DE AULAS PRÁTICAS DAS DISCIPLINAS MTC04004 E MTC00018 A forma para se redigir o relatório deve ser respeitada, uma vez que a avaliação do mesmo é feita de acordo com esta orientação. Assim todo relatório devera conter os seguintes itens: CAPA Devera ter: Nome da UFF. Depto de Tecnologia Farmacêutica Relatório de aulas práticas de Enzimologia e Tecnologia das Fermentações Ou Relatório de Tecnologia Enzimática e das Fermentações Título da aula Nome e turma prática do aluno Data (d/m/a) OBJETIVOS Intenção a ser alcançada com a complementação do grupo de aulas e experimentos realizados INTRODUÇÃO e REVISÃO DE LITERATURA Comentário da aula, incluindo comparativamente os fundamentos da metodologia empregada. Aspectos teóricos e informativos do assunto da aula prática encontrados na literatura. Deve conter informações complementares às da Apostila de Aulas Práticas. Preferencialmente até duas páginas. MATERIAL E MÉTODOS (PROCEDIMENTOS) Descrever os procedimentos executados em aula, inclusive as modificações propostas pelo professor. Identificar o experimento descrito. RESULTADOS Colocar em tabelas os resultados obtidos, gráficos, etc., mostrando o Grupo e a Turma onde os resultados foram obtidos. As tabelas e resultados listados devem referenciar os gráficos construídos a partir dos dados. DISCUSSÃO e CONCLUSÃO Comentar os resultados comparando-os com os da literatura. Comentar quais as conclusões da aula pratica. Ser claro e objetivo nas conclusões. Algumas poucas linhas são suficientes. Esclarecer se os objetivos propostos foram atingidos ou não. Usar as seguintes perguntas para completar este item: BIBLIOGRAFIA CONSULTADA Citar livros, revistas e sites da internet usados para compor o relatório.

4 4 CURVA PADRÃO A razão de ser de um laboratório é produzir resultados confiáveis. O pesquisador ou o analista, no seu dia a dia, preocupa-se em obter resultados que afastem qualquer dúvida razoável com respeito a sua exatidão e que possuam uma precisão adequada para a finalidade a que se destinam. Isto se aplica a qualquer análise, inclusive a da concentração de células. A concentração celular pode ser determinada através de vários e diferentes métodos, escolhidos de acordo com o caso em questão. Um dos métodos mais utilizados para a medida da concentração de células de bactérias e leveduras é o método da turbidimetria associada ao peso seco. A turbidimetria é um método simples de seguir o crescimento e, com os instrumentos finos agora existentes, é provavelmente o processo mais preciso. Esse método é baseado na dispersão da luz ao passar por uma amostra. As células em suspensão absorvem e dispersão a luz que passa através delas, fazendo com que uma cultura pareça turva à observação visual. De fato, a quantidade e luz absorvida e dispersada é proporcional à massa de células no trajeto luminoso; uma célula grande interfere com a luz mais que uma célula pequena. Para as medidas turbidimétricas da massa celular podem ser usados aparelhos sensíveis como um espectrofotômetro ou um fotocolorímetro. A cultura a ser avaliada, porém, deve ter uma densidade capaz de registrar alguma turvação no instrumento, e pode não ser possível a medida de culturas intensamente coradas ou que contêm outros materiais em suspensão, além das células. É preciso mencionar, também, que tanto as células vivas quanto as células mortas contribuem para a turvação. Filtro prisma ou Amostra células contendo Fotocélula mede a luz Registro (unidades) O método da turbidimetria é um método indireto de medida do crescimento celular. A determinação da turbidez (densidade ótica) por si só não é suficiente para que se conheça a concentração da suspensão em análise. É necessário conhecer a relação existente entre a turbidez e a concentração celular. Isso pode ser obtido através de uma curva padrão ou curva de calibração, construída utilizando como parâmetro um método direto de medida de concentração de células. Em geral, associa-se a turbidez ao peso seco de células. Essa curva segue a lei de Lambert-Beer. Alguns analistas julgam que elaborar uma curva de calibração (ou curva padrão) é uma das etapas mais simples de uma análise. No entanto, a exatidão dos resultados repousa na confiabilidade da curva elaborada. Preparação e diluição das soluções padrão e das amostras são geralmente as maiores causas de erros. Durante a calibração podem aparecer: erros sistemáticos (determinados); erros aleatórios (indeterminados); erros devidos ao uso de uma matriz para o padrão diferente da matriz das amostras (erros determinados ou indeterminados). Um ponto freqüentemente discutido é o numero de pontos necessários em uma curva de calibração. Esta dúvida foi resolvida por um par de estatísticos dedicados a problemas analíticos que demonstraram ser desnecessário um número maior que 6 pontos1. Isto porque a faixa de confiabilidade ou invólucro de segurança ao nível de 95% de confiança de uma curva de calibração não diminui de maneira vantajosa para o analista quando este toma mais que seis pontos. No entanto, o alargamento do invólucro de confiança aumenta acentuadamente quando menos de seis pontos são usados para a curva de calibração. 1 Caulcutt, R.; Boddy, R. Statistics for analytical chemists, 1 a edição, Londres: Chapman and Hall; 1983, 253 p.

5 5 PROCEDIMENTO PRÁTICO Objetivos Construir a curva de densidade ótica x peso seco para padronizar um método de dosagem da concentração celular em uma amostra. Executar técnicas de turbidimetria usando fotômetro. Microrganismo Levedura Saccharomyces cerevisiae. Meio de Cultivo Componente (g/l) Açúcar cristal 10,0 Sulfato de amônio 5,0 Fosfato diácido de potássio 1,5 Extrato de lêvedo 5,0 Sulfato de magnésio 7.H 2 O 0,5 Água destilada q.s.p 1000mL ph 6,0 Obtenção da Suspensão de Células Cultivo crescido de 18 a 20 horas em 100mL de meio de cultivo sob agitação a 30 C em estufa microbiológica ou Shaker oscilatório com banho-maria com temperatura controlada. Procedimento Preparo da suspensão-mãe: centrifugar a suspensão (10min à 3.000rpm); lavar as células duas vezes por suspensão em água destilada seguida de centrifugação; ressuspender as células com água destilada, transferir para um balão volumétrico de 100mL e avolumar. Obtenção da concentração celular da suspensão-mãe (método do peso seco): retirar 10mL da suspensão-mãe (em duplicata), transferir para pesa-filtros previamente secos e tarados e secar em estufa a 80 C por 24h. Após 24h, esfriar os pesa-filtros em dessecador e, depois, pesá-los. Obter o peso seco celular por diferença e expressá-los em g/l ou mg/ml. Diluição: transferir alíquotas da suspensão-mãe para balões volumétricos e avolumar com água destilada. Leitura: fazer a leitura em duplicata da densidade óptica de cada diluição utilizando espectrofotômetro a 540nm. Tratamento de Dados 1. Calcular o peso seco da suspensão-mãe de acordo com a equação abaixo e fazer a média aritmética dos pesos secos encontrados para as duas alíquotas da suspensão-mãe (duplicatas): 2. Calcular o peso seco de cada amostra diluída, de acordo com a equação abaixo: 3. Construir uma tabela com os dados de cada diluição obtidos na prática de acordo com o exemplo abaixo:

6 UK 6 Diluição Densidade Óptica A B Média Fator de Diluição Peso Seco (g/l) Construção da Curva Padrão Construir um gráfico os valores do peso seco no eixo X e das densidades ópticas médias no eixo Y, obtendo uma curva DO X PS. Levar em consideração o ponto (0,0). Se o gráfico for feito usando o Microsoft Excel, pedir para adicionar linha de tendência do tipo regressão linear e selecionar as opções definir interseção = 0, exibir equação no gráfico e exibir valor de R-quadrado no gráfico. Caso contrário, calcular manualmente o coeficiente angular da reta (a): a = Δy / Δx, lembrando de definir a interseção na origem. A equação será do tipo: y = a.x onde x = PS, y = DO e a = coeficiente angular da reta; ou seja, a equação será: DO = a.ps logo, PS = DO/a (essa informação será usada na determinação da curva de crescimento). O PS é dado como concentração celular em g/l. PARA PENSAR: Compare os métodos de determinação da concentração celular pelo peso seco e pela leitura da densidade ótica e discuta as aplicações em nível industrial. Considere o tempo de análise e o tipo de microrganismo utilizado, por exemplo. PS (g/l)

7 7 CURVA DE CRESCIMENTO Quando os microrganismos são inoculados em meio adequado e incubados sob condições apropriadas, ocorre um aumento do número de células, em um tempo relativamente curto. Com algumas espécies, a população máxima é atingida dentro de 24 horas, mas outras exigem tempos muito mais longos de incubação para alcançarem o crescimento máximo. O termo crescimento, tal como é comumente aplicado aos microrganismos, refere-se, usualmente, às alterações que ocorrem na cultura e não às alterações de um organismo isolado. Mais freqüentemente, o crescimento denota o aumento do número de microrganismos além do que estava presente no inóculo original. A determinação do crescimento requer, portanto, a medida quantitativa da população celular no momento da inoculação e em intervalos regulares durante a incubação. O tempo necessário para que a massa celular duplique é conhecido como tempo de geração (tg), que não é o mesmo para todos os microrganismos. Da mesma maneira, o tempo de geração varia, para um microrganismo em particular, dependendo das condições ambientais. O tempo de geração, e conseqüentemente o crescimento, depende fortemente dos nutrientes existentes no meio e das condições físicas de incubação. Quando se inocula um meio de cultura com um dado numero de células e se determina a população intermitentemente durante o período de incubação, obtém-se uma curva chamada Curva de Crescimento. Nesta curva observa-se que há um período inicial no qual parece não ocorrer crescimento, seguido por um rápido aumento da população que se nivela posteriormente e declina quanto ao numero de células viáveis. As fases como estão sendo descritas, ocorrem em um cultivo descontínuo ou em batelada. Essas fases são: Fase Lag fase em que a população permanece temporariamente inalterada, em relação ao crescimento. Mas isso não significa que as células estão em repouso; ao contrário, durante essa etapa as células aumentam de tamanho, são fisiologicamente muito ativas e estão sintetizando novas enzimas para se adaptarem ao novo meio e conseguirem utilizar os nutrientes. Ao fim dessa fase, as células se dividem; mas como nem toda célula completa essa etapa simultaneamente, ocorre um aumento gradual da população (aceleração) até o término da fase lag. Fase Exponencial fase em que as células se dividem firmemente e num ritmo constante, onde o numero de células relacionado com o tempo resulta numa curva exponencial. Nas condições dadas, o ritmo de crescimento é máximo nessa fase. Modificando-se as condições o ritmo de crescimento pode se alterar para mais ou para menos. Fase Estacionária fase em que o crescimento tende a diminuir até chegar ao seu fim. Essa tendência se deve à exaustão de nutrientes e, às vezes, ao acúmulo de produtos tóxicos proveniente do metabolismo celular. A população permanece constante durante algum tempo, talvez como resultado da completa cessação do crescimento ou do resultado do equilíbrio entre o ritmo de reprodução e o de morte.

8 8 Fase de Declínio ou de Morte fase em que aumenta o numero de morte das células, em relação ao crescimento. Isso ocorre devido à depleção dos nutrientes essenciais e ao acúmulo de substâncias inibidoras. O crescimento microbiano pode ser mensurado comparando-se a concentração celular de amostras retiradas do cultivo a intervalos regulares. A concentração celular pode ser determinada por diferentes técnicas baseadas num dos seguintes tipos de medidas: Contagem celular contagem direta ao microscópio, por plaqueamento ou em contador eletrônico de partículas. Determinação da massa celular diretamente por pesagem ou indiretamente por turbidimetria ou aferição de constituintes celulares. Avaliação da atividade celular indiretamente pela reação entre o grau de atividade bioquímica e o tamanho da população.

9 9 PROCEDIMENTO PRÁTICO CURVA DE CRESCIMENTO Objetivos Observar o perfil de crescimento de um microrganismo. Executar técnicas de turbidimetria usando fotomêtro. Desenvolver e interpretar uma curva de crescimento Microrganismo A Levedura Saccharomyces cerevisiae Meio de Cultivo Componente (g/l) Açúcar cristal 10,0 Sulfato de amônio 5,0 Fosfato diácido de potássio 1,5 Extrato de lêvedo 5,0 Sulfato de magnésio 7.H 2 O 0,5 Água destilada q.s.p 1000mL ph 6,0 Inóculo Cultivo crescido por 18 a 20 horas em 100mL de meio de cultivo sob agitação a 32 C. Equipamento Balão de fundo chato de 2000mL contendo 1000mL de meio de cultivo estéril, adaptado a um filtro e um compressor de ar, e com tubo de exaustão (saída de ar) e tubo de coleta (retirada de amostras). Procedimento 1. Amostragem: retirar assepticamente aproximadamente 5mL de amostra (em duplicata) pelo tubo de coleta através da obstrução do tubo de exaustão em intervalos regulares de tempo. 2. Centrifugação: marcar o volume de amostra no tubo e centrifugar (10min à 3.000rpm); lavar as células duas vezes por suspensão em água destilada seguida de centrifugação; ressuspender as células com água destilada para o mesmo volume (marcação feita anteriormente). 3. Leitura: fazer a leitura da densidade óptica no Espectrofotômetro utilizando comprimento de onda apropiado para avaliação da absorção de luz pelas células de levedura. 4. Diluição: caso necessário, diluir a amostra em água destilada.

10 10 Tratamento dos Dados Construir uma tabela com os dados de cada amostragem obtidos na prática de acordo com o exemplo abaixo: Hora Coleta (h) Ponto Tempo Cultivo (h) Densidade Óptica A B Média Diluição usada Concentr. X (g/l) Logarítimo de X (ln X) 12: ,22 0,24 0,23 0 0, :00 2 0,5 0,39 0,39 0,39 2x 0,092-2,386 13:30 3 1,0 0,54 0,53 0,535 3x 0,180-1, OBS: os valores usados nesta tabela são apenas ilustrativos, não correspondem a uma situação real. O tempo de cultivo deve ser calculado a partir da hora inicial (inoculação) e da hora de coleta, sendo que os minutos devem ser expressos em frações de horas (5 min = 0,083 h e 10 min = 0,167 h). Se a amostra estiver muita concentrada, se estiver fora da linearidade da curva (ver na curva padrão), a mesma deve ser diluída até que possa ser medida (até estar dentro da linearidade) Lei de Lambert-Beer. Para o cálculo da concentração celular (X) utilizar a equação da reta da curva padrão e a densidade ótica (DO), da seguinte forma: para a curva padrão, tem-se que y = a.x + b, onde: y = densidade óptica (D.O.) x = peso seco (P.S.) dado como concentração celular em g/l a = coeficiente angular da reta b=0, pois a reta passa pela origem Logo, (D.O.) = a.(p.s.) Para saber a concentração celular de cada amostra lida, deve-se aplicar a equação acima descrita aos dados obtidos experimentalmente, onde a D.O. será o lido na prática e o coeficiente angular será o valor obtido na equação da reta da curva padrão. Não esquecer de considerar a diluição, quando for o caso, multiplicar o P.S. obtido na equação acima pela diluição realizada: P.S. da amostra = P.S. calculado x diluição. CONSTRUÇÃO DA CURVA DE CRESCIMENTO Plotar em um gráfico com os valores de concentração celular (X) no eixo y e os tempos de cultivo no eixo x, obtendo uma curva X vs t. Na fase exponencial da curva de crescimento, a equação da reta pode ser descrita como: X = X o.e μt Linearizando essa equação, temos: ln x = ln x o + μ.t (essa regra só é válida na fase exponencial) Plotar uma segunda curva com os valores dos tempos de cultivo no eixo x e os valores do ln X no eixo y ; obtendo uma reta na fase exponencial, da qual o coeficiente angular corresponde à taxa específica de crescimento. Para calcular a velocidade específica de crescimento (μ), usar a equação do coeficiente angular: α = Δy / Δx ; onde α= μ, Δy= Δln X e Δx= Δt ; ou seja: μ = Δln X / Δt. Para saber o tempo de geração, basta usar o valor de μ encontrado na equação correspondente: tg = ln 2 / μ. Construção da Curva de Crescimento Usando o Microsoft ExcelPlotar o gráfico de X vs T (Concentração Celular vs Tempo de Cultivo). Identificar visualmente os pontos que estão na fase exponencial e plotar um outro gráfico apenas com esses pontos. Neste segundo gráfico, pedir para adicionar linha de tendência do tipo regressão exponencial e selecionar as opções, exibir equação no gráfico e exibir valor de R-quadrado no gráfico

11 A equação será do tipo: y = b. e a.x, onde y=x, b=x o, x=t e a=μ; ou seja, a equação será: X = X o. e μt. 11 Orientações para confecção do relatório referente às práticas de Curva Padrão e Curva de Crescimento O relatório deve ser feito em grupo, apresentado impresso na data acordada e deve conter os itens descritos no manual de relatório de aulas práticas QUESTIONÁRIO PARA DISCUSSÃO DOS DADOS NO RELATÓRIO 1. Qual a finalidade de construir uma Curva Padrão de uma espécie microbiana? 2. Justifique a construção das Curvas Padrão e Crescimento em uma indústria que emprega processo fermentativo para obtenção do seu produto final. 3. Explique porque é necessário construir uma Curva Padrão para cada microrganismo e justifique a necessidade de construir diferentes Curvas Padrões para o mesmo microrganismo. 4. A medida da turbidez em qualquer concentração será sempre um dado confiável? Explique. 5. Calcule a concentração celular do inóculo empregado no experimento executado objetivando a coleta de dados usados para construir a Curva de Crescimento? 6. A curva de crescimento resultante do trabalho corresponde a uma curva de crescimento típica, com todas as suas fases? Justifique a sua resposta.