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1 NÁLISE FRMCOPÊIC ENSIOS DE POTÊNCI MÉTODOS INSTRUMENTIS Profa. Ms. Priscila Torres Métodos Quantitativos Instrumentais - São mais sensíveis; - Requerem quantidades menores de amostras; - São mais seletivos que os métodos clássicos (análise volumétrica). Métodos Espectrométricos - São caracterizados pela interação entre a matéria e a energia eletromagnética. Energia Radiante: dividida em várias regiões e relaciona-se com os mecanismos de transições atômicas ou moleculares pertinentes a cada região. Região do espectro Λ (comprimento de onda) Modificações Interação energia / matéria Raios gama,1,1 nm Reações nucleares Raios x,1 2 nm Transições de elétrons de camada K e L Ultravioleta afastado 2 2 nm Transições de elétrons de camada intermediária Ultravioleta 2 4 nm Transições de elétrons valência Visível 4 75 nm (externos) Infravermelho próximo MÉTODOS ESPECTROMÉTRICOS,75 2,5 µm Vibrações moleculares Infravermelho 2,5 25 µm Rotações moleculares e vibrações fracas Microondas 1 mm 3 cm Rotações moleculares

2 ESPECTROSCOPI DE BSORÇÃO NO UV-VISÍVEL -Conceito: técnica analítica quali-quantitativa que tem como fundamento a interação da radiação eletromagnética com diferentes espécies químicas: moléculas, íons, átomos isolados. - bsorção: processo específico relacionado com a estrutura da espécie absorvente. - nálise farmacopeica: Ultravioleta: (λ nm) Visível: (λ nm) LEI DE LMBERT-BEER Correlaciona a intensidade de energia absorvida com a concentração da solução. Io I o > It b c= concentração da espécie química absorvente (solução em análise) b= espessura atravessada pelo feixe luminoso I o = intensidade de luz incidente It = intensidade de luz transmitida ελ = cte característica para cada solução. Log I = ελ. c. It It It quantidade de luz que é absorvida por uma solução depende da concentração da substância absorvente e da espessura da solução através da qual a luz passa. = ελ. c. It ESPECTROSCOPI DE BSORÇÃO NO UV-VIS Objetivo: avaliação da qualidade de medicamentos, alimentos, cosméticos, insumos, análises clínicas e toxicológicas: IDENTIFICÇÃO E QUNTIFICÇÃO. Características: facilidade de manuseio e operação, boa sensibilidade, boa exatidão, ampla aplicabilidade, porém pouca seletividade. Lei de Lambert Beer plica-se às subst. cujo ambiente se mantém cte enquanto se modifica sua concentração e cuja medição é feita com faixa luminosa estreita. bsorbância (λ fixo) λ = ελ c l bsortividade (constante para um λ fixo) Concentração da solução que absorve a luz Distância percorrida pela luz através da amostra

3 Desvios da Lei de Lambert-Beer Presença de mais de uma substância absorvente; Mudança de natureza do solvente ou soluções muito concentradas; Incidência de luz com mais de um comprimento de onda em virtude de uma larga faixa de luz. Espectroscopia no UV-Vis - Para quantificar substâncias que não absorvem a luz a nenhum comprimento de onda da região do UV ou compostos coloridos, as leituras devem ser efetuadas na região do visível (Vis) - λ nm. - Ou realizar reação da substância com reagente específico, de modo a desenvolver cor cuja intensidade é diretamente proporcional à concentração. Ps. Espectrofotômetros de boa qualidade apresentam menor desvio porque fornecem faixas de luz estreitas e um mínimo de luz dispersa. Região do visível Cor Comprimento de onda(nm) Violeta zul Verde marelo Laranja vermelho lgumas Definições: - Deslocamento batocrômico: deslocamento da absorção para comprimento de onda maior devido efeitos de substituição do solvente (deslocamento para o vermelho). Espectros de absorção de diferentes substâncias (1: bacterioclorofila; 2: clorofila a; 3:clorofila b; 4: ficoeritrobilina; 5: beta-caroteno). substância 1, por exemplo, absorve pouco na região do visível, logo deve ser praticamente incolor para os nossos olhos. -Deslocamento hipsocrômico: deslocamento da absorção para comprimento de onda menor devido efeitos de substituição do solvente (deslocamento para o azul). - Efeito hipercrômico: é o aumento da intensidade de absorção. - Efeito hipocrômico: é uma diminuição da intensidade de absorção.

4 ESPECTROFOTÔMETROS - Instrumento usado para medir absorbância da solução em um ou mais comprimentos de onda. - Quando se mede a absorção para fins de quantificação, o comprimento de onda escolhido, é aquele em que se observa absorção máxima. - curva de absorção espectral é a representação gráfica da absorbância em relação ao comprimento de onda. plicações da fotometria (Exemplo prático) Dosagem de Proteína principal finalidade de uma medida espectrofotométrica, nas regiões do ultravioleta e visível, é avaliar quantidades. ssim, é extremamente importante efetuar uma rigorosa calibração visando obter resultados exatos. Para obter-se uma curva de calibração alguns aspectos devem ser considerados como: 1. escolha de uma solução padrão ( Ex:proteina-lbumina) 2. O estabelecimento de um branco adequado 3. seleção da área espectral. Fonte luminosa: -Região do UV: lâmpada de descarga de hidrogênio ou de deutério (19 37 nm). -Região do Visível: lâmpada de filamento de tungstênio (35 75 nm) Monocromador: seleciona comprimento de onda da fonte luminosa. Detector: desenvolve corrente elétrica. mplificador: amplia o sinal. Galvanômetro: mede a intensidade de luz. Cubeta: local onde é transferida a amostra ou solução. Pode ser de vidro, quartzo ou sílica transparente, com faces perfeitamente paralelas, espessura de 1cm (padrão). Preparo de uma curva padrão (ou calibração) O preparo da curva de calibração é de grande importância e deve ser bem entendido. Todo analista deve ser capaz de preparar suas próprias curvas de calibração e interpretar os resultados obtidos. Para se obter o valor da concentração de substâncias cuja concentração se desconhece, é necessário estabelecer uma relação entre a absorbância desta solução em diferentes concentrações com as suas concentrações. Isto se chama curva de calibração (curva padrão).

5 Curva de Calibração - Preparar a série de padrões de concentração conhecida, cobrindo-se a faixa de leitura. Temos que preparar as diluições do padrão 1 mg/ml tendo como volume final 1, ml. Espectro de absorção do permanganato de potássio amostra (1) tem 66 mg/l de concentração, (,98 de absorbância). s demais (2),(3),(4) e (5) foram diluídas para (,8), (,6), (,4) e (,2) da concentração da primeira amostra, respectivamente. lbumina 1 mg/ml Recorremos a regra geral da diluição: C i V i = C f V f onde: C i = concentração inicial (1 mg/ml) V i = volume a ser retirado do padrão (?) C f = concentração final (2mg/ml) V f = volume final (1, ml) C i V i = C f V f Exemplo: Tubo 1 ( 2, mg/ml ) 1 mg/ml V i (?) = 2 mg/ml 1, mg/ml V i =,2 ml lbumina 2 mg/ml V i =,2 ml do padrão +,8 ml de água 1, ml (2 mg/ml) 1. Preparar uma série de padrões exatos, cobrindo a faixa de trabalho usada ou indicada. Usar o padrão recomendado para o método a ser calibrado. 2. Dosar todos os padrões de acordo com a técnica recomendada. Efetuar as leituras colorimétricas, usando o branco apropriado para acertar o zero-, além do comprimento de onda recomendado pela literatura ou obtido pela curva de absorção espectral previamente realizada. 3. Obter os valores de bsorbância. 4. Plotar os resultados em papel milimetrado, relacionando bsorbância (ordenada) com as concentrações dos padrões (abcissa). Examinar bem os pontos e decidir se eles serão cobertos por uma linha reta. Se os pontos aparentemente seguirem uma linha reta, traçar uma curva de modo que mais se aproxime de todos os pontos obtidos. curva não deve ser traçada de ponto a ponto, mas interpolando através dos pontos. 5. Examinar a curva traçada, avaliando se ela tem sensibilidade correta Na prática, como será a performance de vocês? Tubo Conc. (mg/ml) Curva padrão de lbumina lbumina 1 mg/ml Água Biureto 1 2, 4, 2 4, 4, 3 6, 4, 4 8, 4, 5 1, 4, BR , 4, -----

6 Preenchendo a tabela para obter a curva... Tubo Conc. (mg/ml) lbumina 1 mg/ml Água Biureto 1 2, 4,,2,8 2 4, 4,,4,6 3 6, 4,,6,4 4 8, 4,,8,2 5 1, 4, 1, --- BR , 4, Dosagem de proteínas totais de uma amostra 1, ml da amostra 4, ml do reagente de biureto Esperar 1 minutos mostra Ler contra o Branco Conc.? Determinar a concentração de proteínas totais na amostra recorrendo à curva padrão Deixar os tubos em repouso por 1 minutos. Ler as absorbâncias de todos os tubos contra o Branco no λ adequado. Traçar o gráfico e analisar mg/ml C Uma boa curva padrão curva padrão ideal deve ter ângulo aproximado de 45 Exemplo pela extrapolação gráfica e pelo cálculo da equação da reta: mg/ml C Curva de calibração da albumina.5 Leitura da amostra C [ ]? 8 1 mg/ml Equação da reta: y = bx + a Y =,579x +,1,438 =,579x +,1 X = 7,56 mg/ml Equação da reta: y = bx + a 7,56 mg/ml

7 O uso de Fator de Calibração (FC) É um artifício usado rotineiramente e seu cálculo é feito como: concentração padrão FC = absorbância padrão Exercício: Calcular a concentração em g/1ml, mg/1ml e µg/ml de uma solução de Carbimazol sabendo que (1cm, 1%) = 557 a 291nm e cuja absorbância da amostra foi de,557. Finalmente, para calcular a concentração da amostra: [amostra] = bsorbância da amostra FC DETERMINÇÃO D CONCENTRÇÃO TRVÉS D BSORTIVIDDE bsortividade ( 1cm, 1%) - dado farmacopeico = (1cm, 1%). b. c Onde: : absorbância da amostra (1cm, 1%): absorbância da solução a 1% (1g/1mL) b: caminho óptico (geralmente 1cm) c: concentração do analito na solução em g/1ml

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