Departamento de Bioquímica Instituto de Química USP EXERCÍCIOS BIOQUÍMICA EXPERIMENTAL QBQ 0316N Professores

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1 Departamento de Bioquímica Instituto de Química USP EXERCÍCIOS BIOQUÍMICA EXPERIMENTAL QBQ 0316N 2014 Professores Carlos T. Hotta Ronaldo B. Quaggio Eduardo M. Reis 1

2 1. O ácido dinitrosalicílico (DNS) pode ser usado para medir a quantidade de açúcares redutores em amostras, pois a reação deste com o grupo aldeído livre presente no carbono 1 das aldoses, ou com o grupo cetônico presente em frutoses, libera um produto que absorve luz à 540 nm. Alunos de um curso de bioquímica, montaram a seguinte curva padrão usando uma solução de glicose 5 mm (massa molar = 180 g) e obtiveram os seguintes resultados após ferver as amostras por 10 min: Glicose 5 mm Água Reagente DNS Concentração de glicose (µg/ µl) 540 nm , , , , , , , , , , ,220 O reagente da Glicose Oxidase (TGO) pode ser usado para medir especificamente a quantidade de glicose presente em uma amostra. A glicose oxidase, ao oxidar glicose, reduz um grupo NAD + para NADH. Essa reação pode ser acoplada à oxidação de um grupo como a o-dianisidina, a qual passa a absorver luz a 420nm ao ser oxidado. Foi montada uma curva padrão com uma solução de glicose 0,5 mm e, após incubar a amostra por 1 h a 37 C para ocorrer a reação foram obtidos os seguintes resultados: Glicose 0,5 mm Água Reagente TGO Concentração de glicose (µg/ µl) 420 nm , , , , , , , , , , ,980 O reagente Fenol-Sulfúrico (FS) pode ser usado para medir a quantidade de açúcares presentes em uma amostra, pois após a hidrólise pelo ácido sulfúrico e a reação do fenol com os grupos hidroxila é gerado um produto que absorve a 490 nm. Foi montada a curva padrão abaixo com uma solução de glicose 1 mm e após a reação foram obtidos os dados abaixo: 2

3 Glicose 1 mm Água Reagente FS Concentração de glicose (µg/ µl) 490 nm Diferentes variedades de cana-de-açúcar foram testadas para saber qual das variedades possui a maior quantidade de açúcares solúveis, o que é de grande interesse para a indústria açucareira. Pedaços do colmo da cana-de-açúcar foram homogenizados em água e este material foi centrifugado por 10 min a g a 4 C. O sobrenadante foi diluído é usado para determinação de açucares com os métodos do ácido dinitrosalícilico (DNS), glicose oxidase (TGO) e fenol-sulfúrico (FS). Os resultados estão expostos na tabela abaixo: Variedade Massa de tecido (g) Volume final (ml) Diluição (X) Amostra 540 nm (DNS) 420 nm (TGO) 490 nm (FS) ,001 0,003 0, ,005 0,001 1, ,003 0,002 1, ,002-0,009 0, ,010 0,001 0, ,000 0,007 1, ,001-0,008 1, ,003-0,001 1, ,002 0,001 1, ,008 0,002 1,487 a) Qual das técnicas é a melhor para se medir açúcares solúveis em cana-de-açúcar? Como você explicaria esses resultados? b) Calcule a concentração de açúcares solúveis nos diferentes homogeneizados e a quantidade de açúcar que pode ser obtida por grama de tecido vegetal. Qual das plantas é a melhor para a produção de sacarose? c) Uma indústria farmacêutica está interessada na produção de alfa-glicosidase de levedura para geração de glicose e frutose a partir de açúcar da cana (sacarose). Para tal, obteve várias linhagens de levedura e agora há a necessidade de medir a atividade de alfaglicosidase presente nas células. Quais das técnicas DNS, TGO ou FS você usaria para medir a atividade dessa enzima, usando sacarose como substrato? 3

4 2. A indústria farmacêutica preparou lisados de levedura de diferentes linhagens. Em todas as amostras usou 1 g de células e obtiveram 10 ml de lisado. Esses lisados foram utilizados para ensaios enzimáticos, empregando p-nitrofenil α-glicosídeo (pnpαglc) como substrato. Foram obtidos os resultados a seguir: linhagem diluição lisado diluído água pnpαglc 420 nm (15 min) 420 nm (30 min) 420 nm (45 min) 420 nm (60 min) A 100x ,050 0,100 0,150 0,200 B 50x ,080 0,160 0,240 0,320 C 8x ,250 0,500 0,750 1,000 D 70x ,100 0,200 0,300 0,400 E 500x ,010 0,020 0,030 0,040 F 200x ,075 0,150 0,225 0,300 As mesmas amostras foram submetidas à determinação de proteínas com o reagente de Bradford (comassie blue G), obtendo-se os dados a seguir: linhagem diluição lisado diluído água Reagente Bradford (ml) 595 nm (15 min) A 20x ,265 B 50x ,320 C 10x ,50 D 20x ,105 E 5x ,750 F 80x ,415 Confeccionou-se também uma curva padrão usando albumina de ovo: Albumina 0,2 g/l água Reagente Bradford (ml) Massa de proteína (mg) 595 nm (15 min) , , , , , , , , , , ,800 4

5 Calcule a concentração de atividade enzimática no lisado de cada uma das linhagens de levedura. Calcule também a atividade obtida por grama de células. Calcule a concentração de proteína em cada um dos lisados e a atividade específica de cada um dos materiais. Se o próprio lisado for utilizado industrialmente como fonte de enzima, qual das linhagens é melhor para produzir essa enzima em larga escala? Se for necessário purificar a enzima, qual das linhagens é a melhor fonte? Justifique as respostas. 3. A enzima COMT (catecol-o-metiltransferase) atua metilando o 4-hidroxi-estradiol, um metabólito carcinogênico derivado da metabolização do estrogênio. Esta reação química é uma importante etapa na detoxificação do 4-hidroxi-estradiol (um catecol), transformando-o em 4-metoxi-estradiol (um guaiacol) como esquematizado na reação abaixo. Guaiacol Sabendo que mulheres que desenvolvem câncer de mama (do subtipo dependente de estrogênio) frequentemente apresentam variantes desta enzima com atividade reduzida, uma industria farmacêutica resolveu desenvolver um medicamento para mulheres contendo esta enzima com o objetivo de ajudar a prevenir o surgimento ou a reincidência do câncer de mama. Para purificar grandes quantidades desta enzima, os investigadores envolvidos no desenvolvimento deste medicamento, obtiveram orgãos bovinos que sabidamente expressam a COMT. O primeiro passo que antecedeu a purificação envolveu o preparo de lisados celulares de cada orgão. Estes lisados foram submetidos aos dois ensaios descritos abaixo. Ensaio de Bradford Tabela 1 preparo do lisado orgãos Quantidade de tecido usada Volume do lisado obtido fígado 20 g 25 ml Glândulas mamárias (GM) 12 g 16 ml cérebro 17 g 23 ml Rins 6 g 9 ml O lisado original de cada órgão foi diluído 100X e usado segundo o protocolo da tabela abaixo (Tabela 2). Após 5 minutos de incubação foi lida a absorbância a 595nm e os resultados foram também registrados na Tabela 2. 5

6 tubos Tabela 2 Quantificação da concentração de proteínas L100X (µl) H 2 O (µl) reagente de Bradford (ml) A595 branco ,0 0,003 fígado ,0 0,382 GM ,0 0,686 cérebro ,0 0,838 rins ,0 0,813 Para este experimento, a curva padrão com albumina forneceu o gráfico abaixo: Curva Padrão da Albumina orbância a 595nm f(x) = 0.08x R² = [Albumina] ug Reação enzimática colorimétrica Para medir a atividade da COMT, foi utilizado um ensaio colorimétrico usando-se os dois substratos da COMT: o doador de grupos metil s-adenosil-l-metionina (SAM) e um substrato artificial contendo um grupo catecol, que passa a apresentar um pico de absorção a 320nm quando metilado. Os lisados originais de cada órgão foram diluídos 20X e usados para monitorar a atividade enzimática segundo o protocolo da tabela abaixo (Tabela 3). Após diferentes tempos de incubação a 37 C, a absorbância a 320 nm das amostras foi medida e colocada na tabela 3. tubo Lisado (ml) SAM (ml) Substrato artificial (ml) Tempo (min) Fígado (A 320nm ) Cérebro (A 320nm ) GM (A 320nm ) Rins (A 320nm ) 1 0,2 0,1 0,1 5 0,11 0,04 0,06 0,08 2 0,2 0,1 0,1 10 0,28 0,09 0,12 0,15 3 0,2 0,1 0,1 15 0,4 0,15 0,2 0,21 4 0,2 0,1 0,1 20 0,51 0,19 0,25 0,32 6

7 A curva padrão obtida para relacionar a quantidade de substrato artificial metilado da COMT (produto) com a orbância a 320 nm é apresentada no gráfico abaixo: Curva Padrão da atividade da COMT 0.7 orbância a 320nm f(x) = 0.01x R² = micromol de produto Considerando os resultados experimentais acima, calcule para cada lisado: a) a concentração de proteína (mg/ml). b) a concentração da atividade enzimática (U/mL). c) a atividade específica (U/mg de proteína). Com base nos cálculos acima, qual é o melhor órgão a ser utilizado para se obter a maior quantidade da COMT? E o melhor órgão para se obter a COMT mais pura? Justifique. 4. Quatro amostras (1 a 4) foram submetidas à eletroforese em poliacrilamida desnaturante (SDS-PAGE) na presença e na ausência de beta-mercaptoetanol, resultando nos seguinte géis: 7

8 As distâncias de migração das bandas das proteínas no gel estão colocadas nas tabelas abaixo. Gel em condições redutoras Proteínas Padrão Distância (cm) azul de bromofenol 6,8 banda A 0,7 banda B 1,6 banda C 3,9 banda D 5,0 banda E 2,9 banda F 4,2 banda G 4,8 banda H 5,3 Gel em condições não-redutoras Proteínas Padrão Distância (cm) azul de bromofenol 6,8 banda I 0,7 banda J 1,4 banda K 1,6 banda L 4,4 banda M 4,2 banda N 4,8 banda O 5,3 A curva gerada pelas proteínas padrão pode ser encontrada abaixo: logpm y = x R² = migração relativa Responda: a) Qual a função do SDS no SDS-PAGE? b) Qual a razão das diferenças entre o gel com β-mercaptoetanol e sem β- mercaptoetanol? c) Qual o peso molecular de cada uma delas? Quais continham mais de uma subunidade e qual o peso molecular de cada cadeia proteica? 8

9 5. As figuras a seguir apresentam o perfil de eluição da atividade de alfa-glicosidase em uma cromatografia de troca aniônica em coluna DEAE-celulose. Cada uma das cromatografias foi realizada utilizando um tampão com ph diferente (9,0 8,0 6,0). Com base nos resultados responda qual a provável faixa de valores do pi (ponto isoelétrico) desta alfa-glicosidase: 6. Você conseguiu purificar uma celulase através da marcha de purificação a seguir. 1º passo: cromatografia de troca aniônica em ph 10. 2º passo: cromatografia de filtração em gel em ph 6,0. Após cada passo os tubos que continham a atividade de celulase foram reunidos. Para este material foi calculada a atividade enzimática total de celulase e também a quantidade de proteína. A tabela abaixo resume estes resultados: Passo Atividade de celulase aplicada (U) Atividade de celulase recuperada (U) Proteína total aplicada (mg) Proteína total recuperada (mg) Troca iônica ,0 0,05 Filtração em gel ,05 0,02 9

10 Após cada cromatografia os tubos que continham atividade de celulase também foram reunidos e analisados por SDS-PAGE: SDS-PAGE de materiais recolhidos ao longo da marcha de purificação. M meio de cultura; T material recuperado após cromatografia de troca aniônica; F material recuperado após cromatografia de filtração em gel; P padrões de peso molecular. Para a coluna de filtração em gel de 25 ml usada na marcha de purificação foi previamente preparada uma curva de calibração utilizando proteínas de diferentes pesos moleculares. Os dados obtidos estão descritos na tabela abaixo juntamente com o resultado para cromatografia da celulase: Material Volume de eluição (ml) Proteína padrão de daltons 7,53 Proteína padrão de daltons 9,38 Proteína padrão de daltons 10,46 Proteína padrão de daltons 13,70 Proteína padrão de daltons 16,22 Atividade celulásica 9,58 a) Calcule a recuperação da atividade enzimática após cada um dos passos da purificação da celulase. b) Calcule a atividade específica da celulase após cada um dos passos da marcha de purificação. c) Qual dos passos é melhor na purificação desta enzima? Por quê? d) Calcule a massa molecular da enzima determinada por SDS-PAGE e por filtração em gel. Compare os valores e formule hipóteses para explicar os resultados. 10

11 7. O tecido embrionário de fígado contém a enzima que catalisa a reação S -> P. O tecido de fígado adulto também apresenta a atividade S -> P. Alguns dados cinéticos obtidos com extratos dos dois tecidos são apresentados abaixo. Que conclusões você pode tirar com relação à identidade das duas enzimas? [S] Velocidade inicial observada (µmoles.mg de proteína -1.min -1 ) [M] Extrato de Fígado Adulto (E1) Extrato de Fígado Embrionário (E2) 1,67 x ,05 5,00 2,50 x ,54 6,66 3,33 x ,98 8,00 5,00 x ,86 10,00 7,00 x ,78 11,67 1,00 x ,00 13,33 1,50 x ,67 15,00 1,67 x ,15 15,40 2,00 x ,00 16,00 3,00 x ,00 17,10 Durante danos consideráveis do fígado, esta enzima é liberada na corrente sanguínea. Após exercícios intensos, uma enzima de músculo, E3, que catalisa a mesma reação, é liberada na corrente sanguínea. E1 e E3 podem ser diferenciadas facilmente porque apresentam diferentes valores de Km (A Km da enzima de músculo é 2 x 10-5 M). Uma determinação com uma amostra de sangue de um paciente apresentou os resultados dados na tabela abaixo: [S](M) V (moles.ml de soro -1.min -1 ) 5,0 x ,0 x ,0 x ,5 x ,0 x ,0 x ,0 x Sabendo que o paciente chegou inconsciente no hospital, de modo que você não pode fazer a ele nenhuma pergunta, o paciente sofre de uma doença do fígado, ou simplesmente tem se exercitado violentamente? 11