Determinação dos espectros de absorção de diferentes formas de Hemoglobina

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1 Faculdade de Medicina da Universidade de Coimbra Bioquímica I 1º Ano Medicina Determinação dos espectros de absorção de diferentes formas de Hemoglobina T U R M A 6 A N O L E C T I V O /

2 Sumário/ Resumo Nesta actividade experimental pretende-se determinar de que forma a absorção da luz permite identificar e caracterizar uma substância. Para o efeito, analisou-se o espectro de absorção de vários tipos de hemoglobina (oxigenada, desoxigenada, reduzida e oxidada) determinado através dos valores obtidos por espectrofotometria.

3 Objectivos Analisar os princípios gerais da espectrofotometria de absorção Inferir a importância da espectrofotometria de absorção na caracterização e identificação de substâncias Manusear um espectrofotómetro e perceber a sua utilidade para o traçado de espectros de absorção Interpretar os espectros de absorção de diferentes formas de Hemoglobina, a diferentes comprimentos de onda

4 Introdução Espectrofotometria de Absorção Luz visível: radiação electromagnética (400 a 700 nm de comprimento de onda) Cor: resulta da interacção da luz com a matéria, sendo consequência da reflexão da radiação não absorvida Espectro de absorção de um composto: indica a sua capacidade de absorver luz em função do comprimento de onda. Espectrofotometria Quando um feixe de luz passa através de uma solução, parte da luz é absorvida, a comprimentos de onda específicos, pelos componentes da solução. Assim, a absorção total é feita em função do número de moléculas que absorvem, ou seja, da concentração da solução.

5 Espectrofotómetro Aparelho que permite medir intensidade das radiações que, não sendo absorvidas, atravessam a solução.

6 Funcionamento de um Espectrofotómetro Ocorre separação da luz, proveniente de uma lâmpada, nos vários λ Um monocromador selecciona um feixe de luz com λ específico que incidirá na amostra Aí a luz não absorvida pela amostra é captada por um detector e o sinal eléctrico ampliado pelo amplificador é enviado para o voltímetro Este lê a quantidade de luz que passou através da amostra, podendo ser-lhe ligado um registador para obter um registo permanente da absorvância ao longo do tempo

7 Hemoglobina Identificação por espectrofotometria Hemoglobina Proteína de estrutura quaternária cuja principal função é transportar O 2, além de CO 2 e H +. Possui quatro subunidades, em que cada possui um grupo heme. Este encontra-se associado a um átomo de ferro e é neste local que o O 2 se liga. Para que o átomo de oxigénio se ligue é necessário que o ferro se encontre na sua forma reduzida (Fe 2+ ). A Hb pode estar nas formas: -reduzida(fe 2+ )/oxidada(fe 3+ ) -desoxigenada/oxigenada

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9 Todas estas formas de Hemoglobina correspondem a diferentes espectros de absorção, já que de uma forma para outra ocorrem alterações ao nível da estrutura quaternária, isto é, na forma como as cadeias estão orientadas em relação umas às outras. Por exemplo, o espectro de absorção da Hemoglobina sofre uma alteração significativa quando esta se liga ao O 2 pois estabelece com ele uma ligação cooperativa. A desoxi-hemoglobina apresenta-se na forma T (tensa) devido à presença de pontes salinas entre as subunidades. A oxi-hemoglobina apresenta-se na forma R (relaxada) devido à quebra das pontes salinas. Desoxihemoglobina (T) + O 2 Oxihemoglobina (R)

10 Factores que regulam a função da hemoglobina no transporte de oxigénio Pressão parcial de O 2 e de CO 2 - Nos pulmões: onde a pressão de O 2 é alta, a ligação deste à hemoglobina é facilitada. - Nos tecidos: onde a pressão de O 2 é baixa, a libertação do mesmo ocorre mais facilmente. ph HHb + + O 2 HbO 2 + H + - Trata-se de uma reacção reversível, pelo que: um aumento da concentração de H + ocasionará um deslocamento do equilíbrio para a esquerda, no sentido de menor saturação uma diminuição da concentração hidrogeniónica ( [H + ] ; ph) ocasionará o deslocamento do equilíbrio para a direita, no sentido do aumento da saturação - O efeito do ph no equilíbrio oxigénio/hemoglobina é denominado Efeito de Bohr

11 Determinação dos espectros de absorção de diferentes formas de Hemoglobina PARTE EXPERIMENTAL

12 Material Tubos de ensaio Pipetas graduadas Macrocontrolador de Pipetas Tampão fosfato Ditionito de Sódio Água desionizada Ácido clorídrico (HCl) Tubos de espectrofotómetro (cuvetes) Espectrofotómetro Jenway 6300 Papel milimétrico

13 Procedimentos Procedimento dos grupos I e II 1. Colocar 2-3 gotas de sangue num tubo de ensaio e adicionar-lhe 1 ml de tampão fosfato. 2. Agitar o tubo e esperar que se dê a lise dos glóbulos vermelhos (aproximadamente 5 minutos). 3. Grupo I: Diluir com o mesmo tampão até obter uma leitura de absorvância de aproximadamente 0,8 unidades a 540 nm, contra um branco de tampão fosfato, anotando o volume tampão utilizado. Grupo II: Adicionar, ao tubo, alguns cristais de ditionito de sódio e agitar suavemente. A solução deve apresentar um reflexo azulado. Se necessário, juntar alguns cristais adicionais para se notar claramente o reflexo azulado. Evitar, no entanto, adicionar em excesso. Diluir com o volume de tampão fosfato utilizado para a hemoglobina. 4. Obter o espectro de absorção da solução da hemoglobina lendo a D.O. da solução aos vários comprimentos de onda (l) na gama de 500 a 600 nm, de 10 em 10 nm. Para cada l seleccionado, utilizar o tubo contendo apenas tampão fosfato para ajustar o espectrofotómetro para zero de absorvância, antes de fazer a leitura da D.O. Da amostra. 5. Em papel milimétrico fazer um gráfico da D.O. versus o comprimento de onda (l). Assinalar os picos de absorção máxima, característicos desta forma de hemoglobina.

14 Procedimentos Procedimento dos grupos III e IV 1. Obter uma gota de sangue (ex. picando um dedo com uma lanceta hematológica esterilizada). 2. Grupo III: Colocar a gota de sangue num tubo de espectrofotómetro contendo 5 ml de água desionizada. Agitar bem e esperar alguns segundos para permitir a hemólise dos glóbulos vermelhos e obter uma solução límpida de hemoglobina. Preparar outro tubo contendo apenas 5 ml de água desionizada. Grupo IV: Colocar uma gota de sangue num tubo de espectrofotómetro contendo 5 ml de HCl 0,1 N. Nesta solução diluída de HCl, os glóbulos vermelhos hemolisam e o Fe2+ passa a Fe3+, isto é, oxida, o que confere ao grupo heme da hemoglobina diferentes características de absorção de luz. 3. Obter o espectro de absorção da solução da hemoglobina lendo a D.O. da solução aos vários comprimentos de onda (l) na gama de 500 a 600 nm, de 10 em 10 nm. Para cada l seleccionado, utilizar o tubo contendo água desionizada para ajustar o espectrofotómetro para zero de absorvância, antes de fazer a leitura da D.O. da amostra. 5. Em papel milimétrico fazer um gráfico da D.O. versus o comprimento de onda (l). Assinalar os picos de absorção máxima, característicos desta forma de hemoglobina.

15 Resultados - Grupo I Comprimento de Onda (nm) Absorvância 0,7 Espectro de absorção do grupo I 500 0, , , , , , , , , , ,04 Tab. 1 Valores de absorvância obtidos pelo grupo I 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0, Espectro de absorção do grupo I

16 Resultados - Grupo II Comprimento de Onda (nm) Absorvância 0,8 Espectro de absorção do grupo II 500 0, , , , , , , , , , ,2 Tab. 2 Valores de absorvância obtidos pelo grupo II 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0, Espectro de absorção do grupo II

17 Resultados - Grupo III Comprimento de Onda (nm) Absorvância 0,5 Espectro de absorção do grupo III 500 0, , , , , , , , , , ,077 Tab. 3 Valores de absorvância obtidos pelo grupo III 0,45 0,4 0,35 0,3 0,25 0,2 0,15 0,1 0, Espectro de absorção do grupo III

18 Resultados - Grupo IV Comprimento de Onda (nm) Absorvância 1,2 Espectro de absorção do grupo IV 500 1, , , , , , , , , , ,853 Tab. 4 Valores de absorvância obtidos pelo grupo IV 1,1 1 0,9 0,8 0,7 0,6 0, Espectro de absorção do grupo IV

19 Discussão Análise do Procedimento Na medição da absorvância é necessário calibrar o espectrofotómetro, a cada comprimento de onda, de modo a obter apenas o valor da absorvância de cada conformação da Hb. Para isso, utiliza-se uma cuvete com a solução sem Hb, o tubo branco. Pelo facto de, em cada grupo, se adicionarem diferentes soluções à gota de sangue, a conformação da Hb sofre alterações na estrutura quaternária, causadas pelas diferentes interacções com o meio.

20 Discussão Análise dos Gráficos Grupo I e II Hb Oxigenada e Hb Desoxigenada - A Hb oxigenada apresenta dois picos de absorção máxima (nos comprimentos de onda 550 e 580 nm); - A Hb desoxigenada apenas um (a 560 nm) 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 Grupo I e II Espectro de absorção do grupo I Espectro de absorção do grupo II

21 Discussão Análise dos Gráficos Grupo III e IV Hb Reduzida e Hb Oxidada - A Hb reduzida apresenta os mesmos picos de absorção máxima que a Hb oxigenada, pois o ião ferro se apresenta reduzido em ambas (Fe 2+ ) - A Hb oxidada não tem picos; a comprimentos de onda maiores correspondem valores de absorvância menores. 1,2 Grupo III e IV 1 0,8 0,6 0,4 0, Espectro de absorção do grupo III Espectro de absorção do grupo IV

22 Conclusão A espectrofotometria permite identificar diferentes substâncias nas diferentes soluções. Permite ainda identificar as diferentes conformações de uma mesma molécula, dado que estas apresentam diferentes espectros de absorção. As pequenas alterações na molécula Hb, devido às diferentes interacções com o meio, conduzem a grandes diferenças no respectivo espectro de absorção. A análise do espectro de absorção de uma amostra de sangue pode constituir um dos passos para diagnosticar doenças associadas à presença de formas de hemoglobinas anormais.

23 Conclusão Berg J.M., Tymoczko J.L. and Stryer L.: Biochemistry. 5th. Ed. International Edition. W.H. Freeman and Company. New York Protocolo experimental da 4ª aula prática de Bioquímica I