TP3 Caracterização cinética da enzima Invertase Determinação dos parâmetros cinéticos de Michaelis-Menten

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1 Instituto Superior Técnico de Lisboa Mestrado Integrado em Engenharia Biomédica Bioquímica e Biologia Molecular 1º semestre 2015/2016 TP3 Caracterização cinética da enzima Invertase Determinação dos parâmetros cinéticos de Michaelis-Menten Ana Barriga Nº Diana Serrano Nº Miguel Tenreiro Nº

2 Índice Página Resumo...3 Fundamentos Teóricos e Experimentais 4 Resultados..6 Discussão..16 Bibliografia.18 2

3 Resumo Este trabalho experimental teve como principal objetivo o estudo cinético da enzima invertase na reação de hidrólise da sacarose. Para tal, estudou-se a atividade da enzima em 6 soluções com diferentes concentrações de sacarose a 40ºC. Após o tratamento dos dados adquiridos experimentalmente, onde alguns dos valores foram desprezados devido à sua incoerência com os pressupostos teóricos, obteve-se v max 0,2549 mm min 1 e K m 68,59 mm. Durante a análise dos resultados foi, igualmente, possível comprovar que a velocidade de reação aumenta com o aumento da concentração do substrato (sacarose). 3

4 Fundamentos Teóricos e Experimentais As enzimas, classe particular de proteínas, são catalisadores biológicos cuja função é baixar a energia necessária a uma dada reação e permitir que esta ocorra a uma velocidade mais alta, dando-se em tempo útil. Muitas das reações biológicas não são favoráveis, só ocorrendo devido à intervenção de enzimas. Em qualquer enzima o substrato liga-se ao centro ativo onde a reação é catalisada. A cinética de Michaelis-Menten estabelece a forma mais geral para o funcionamento de uma enzima, isto é uma enzima com apenas um centro ativo que liga a um substrato. A equação de Michaelis-Menten dá a velocidade de reação (v) em relação à concentração de substrato disponível ([S]), v = v max [S] K m + [S] em que v max designa a velocidade máxima da reação, que corresponde à velocidade da reação quando os centros ativos de todas as enzimas estão ocupados (condição de saturação); e K m define-se como a concentração de substrato quando a velocidade de reação é metade de v max. Para além disso, quanto menor for o valor de K m maior será a afinidade que a enzima tem ao substrato. A equação de Michaelis-Menten pode, também, ser escrita de uma forma linear (Linearização de Lineweave-Burk). 1 v = K m v max 1 [S] + 1 v max Na Figura 1 está feita a representação gráfica destas duas relações. Figura 1_ Representação de Michaelis-Menton (à esquerda); Linearização de Lineweave-Burk (à direita). 4

5 No laboratório procedeu-se à caracterização da enzima invertase, enzima que hidrolisa a sacarose. A sacarose, C 12 H 22 O 11, é um dissacárido composto por uma molécula de α-d-glucose e outra de β-d-frutose ligadas entre si por uma ligação glicosídica que tanto pode ser α(1 2) ou β(1 2). Este açúcar é obtido, principalmente, da cana-de-açúcar e é um composto solúvel em água. Ao ser colocada a enzima invertase numa solução de sacarose irão ser quebradas as ligações, ficando os monómeros de frutose e glucose livres (Figura 2). Figura 2_ Hidrólise da sacarose por ação da invertase. Do ponto de vista espectrofotométrico não se consegue seguir a reação de hidrólise, dado que a mistura é incolor. Sabe-se que a sacarose não é um açúcar redutor, mas os seus monómeros constituintes são. Para tal pode ser usado o ácido 3,5-dinitrosalicílico (DNS), composto aromático que reage com açúcares redutores e absorve a luz a 540 nm. O DNS confere cor à solução e, deste modo, é possível seguir a reação. Foram usadas seis soluções de sacarose com concentrações de 5 g/l, 10 g/l, 15 g/l, 25 g/l, 50 g/l e 100 g/l. De cada solução foi extraído um volume de 25 ml, procedeu-se à sua termoestatização a 40ºC com agitador magnético e adicionou-se 500 μl de enzima invertase à solução. Após a adição da enzima foram pipetados de minuto a minuto, até serem completados 7 minutos, 500 μl da solução que foi termoestatizada e colocou-se em tubos de ensaio que já continham 500 μl de solução de DNS. No total foram usados 8 tubos, sendo que o primeiro, tubo B ( branco ), corresponde a minuto 0, o segundo ao 1º minuto, o terceiro ao 2º minuto, e assim sucessivamente. O tubo B contem a solução de sacarose sem invertase, mas contrariamente aos restantes foi adicionada solução tampão de acetato ao DNS. Todas as soluções foram agitadas no vórtice, aquecidas em banho de água a 100 ºC e posteriormente arrefecidas em gelo. Findo esse processo adicionou-se 5 ml de água destilada e leu-se a absorvância de cada solução no espectrofotómetro a 540 nm, usando a solução no tubo B para calibrar o aparelho a zero. 5

6 Resultados No espectrofotómetro foram obtidas as absorvâncias de cada uma das soluções preparadas, calibrando o aparelho a zero com a solução padrão do tubo B ( branco ). Com as absorvâncias foi possível obter a concentração de produto obtida, [P], a qual corresponde à concentração total de glucose e frutose formadas, sendo esta igual ao dobro da concentração de glucose por estes açucares serem isómeros. Essas concentrações foram obtidas através da equação da reta de calibração do frasco de reagente DNS (y = 0,6377x), a qual corresponde à aplicação da Lei de Lambert-Beer (A = ε I [M]). No entanto, pretende-se usar a concentração de sacarose hidrolisada para, posteriormente, obter os parâmetros da invertase. Sabe-se que por cada mol de sacarose se forma uma mole de glucose e uma mole de frutose. Portanto para saber a concentração de sacarose hidrolisada dado [P], basta fazer [P] 2. De seguida representou-se as concentrações de sacarose hidrolisada em função do tempo e o declive da reta que melhor de ajusta ao conjunto de pontos corresponde à velocidade da reação de hidrólise. Os resultados obtidos estão nas Tabelas 1 a 10 e Gráficos 1 a 10 para cada uma das 6 soluções de sacarose utilizadas. Tabela 1_Absorvância, Concentração de glucose [P] e concentração de sacarose hidrolisada para a solução de 5 g/l ao longo do tempo. 0 0,010 0,016 4,352E ,014 0,022 6,093E ,013 0,020 5,658E ,029 0,045 1,262E ,039 0,061 1,697E ,055 0,086 2,394E ,064 0,100 2,785E ,077 0,121 3,351E-01 Tabela 2_Absorvância, Concentração de glucose [P] e concentração de sacarose hidrolisada para a solução de 10 g/l ao longo do tempo. 0 0,037 0,058 1,61E ,079 0,124 3,44E ,128 0,201 5,57E ,178 0,279 7,75E-01 6

7 Tabela 3_Absorvância, Concentração de glucose [P] e concentração de sacarose hidrolisada para a solução de 15 g/l ao longo do tempo (Ensaio 1). 0 0,000 0,000 0,00 1 0,017 0,027 7,40E ,037 0,058 1,61E ,087 0,136 3,79E ,106 0,166 4,61E ,129 0,202 5,61E ,152 0,238 6,62E ,176 0,276 7,66E-01 Tabela 4_Absorvância, Concentração de glucose [P] e concentração de sacarose hidrolisada para a solução de 15 g/l ao longo do tempo (Ensaio 2). 0 0,002 0,003 8,70E ,017 0,027 7,40E ,034 0,053 1,48E ,057 0,089 2,48E ,075 0,118 3,26E ,111 0,174 4,83E ,135 0,212 5,88E-01 Tabela 5_Absorvância, Concentração de glucose [P] e concentração de sacarose hidrolisada para a solução de 25 g/l ao longo do tempo (Ensaio 1). 0 0,002 0,003 8,70E ,024 0,038 1,04E ,050 0,078 2,18E ,079 0,124 3,44E ,110 0,172 4,79E ,177 0,278 7,70E ,204 0,320 8,88E-01 7

8 Tabela 6_Absorvância, Concentração de glucose [P] e concentração de sacarose hidrolisada para a solução de 25 g/l ao longo do tempo (Ensaio 2). 0 0,002 0,003 8,70E ,029 0,045 1,26E ,060 0,094 2,61E ,101 0,158 4,40E ,145 0,227 6,31E ,181 0,284 7,88E ,211 0,331 9,18E ,233 0,365 1,01E+00 Tabela 7_Absorvância, Concentração de glucose [P] e concentração de sacarose hidrolisada para a solução de 50 g/l ao longo do tempo (Ensaio 1). 0 0,005 0,008 2,18E ,031 0,049 1,35E ,057 0,089 2,48E ,083 0,130 3,61E ,116 0,182 5,05E ,147 0,231 6,40E ,169 0,265 7,36E ,185 0,290 8,05E-01 Tabela 8_Absorvância, Concentração de glucose [P] e concentração de sacarose hidrolisada para a solução de 50 g/l ao longo do tempo (Ensaio 2). 0 0,006 0,009 2,61E ,045 0,071 1,96E ,093 0,146 4,05E ,136 0,213 5,92E ,161 0,252 7,01E ,225 0,353 9,79E ,271 0,425 1,18E ,305 0,478 1,33E+00 8

9 Concentração de Sacarose hidrolisada Tabela 9_Absorvância, Concentração de glucose [P] e concentração de sacarose hidrolisada para a solução de 100 g/l ao longo do tempo (Ensaio 1). 0 0,011 0,017 4,79E ,068 0,107 2,96E ,119 0,187 5,18E ,172 0,270 7,49E ,248 0,389 1,08E ,312 0,489 1,36E ,380 0,596 1,65E ,430 0,674 1,87E+00 Tabela 10_Absorvância, Concentração de glucose [P] e concentração de sacarose hidrolisada para a solução de 100 g/l ao longo do tempo (Ensaio 2). 0 0,006 0,009 2,61E ,036 0,056 1,57E ,072 0,113 3,13E ,107 0,168 4,66E ,145 0,227 6,31E ,181 0,284 7,88E ,222 0,348 9,66E ,258 0,405 1,12E+00 Com os valores presentes nas tabelas foram obtidos os seguintes gráficos: 4,000E-01 3,500E-01 3,000E-01 y = 0,0443x + 0,0087 R² = 0,9559 2,500E-01 2,000E-01 1,500E-01 1,000E-01 5,000E-02 0,000E+00 Gráfico 1_Evolução da concentração de sacarose hidrolisada para a solução de 5 g/l. 9

10 Concentração de Sacarose hidrolizada Concentração de Sacarose hidrolizada Concentração de Sacarose hidrolizada 9,00E-01 8,00E-01 7,00E-01 6,00E-01 5,00E-01 4,00E-01 3,00E-01 2,00E-01 1,00E-01 0,00E+00 y = 0,0789x + 0,2028 R² = 0,964 Gráfico 2_Evolução da concentração de sacarose hidrolisada para a solução de 10 g/l 0,90 0,80 0,70 0,60 0,50 0,40 0,30 0,20 0,10 0,00-0,10 y = 0,1141x - 0,0163 R² = 0,9873 Gráfico 3_ Evolução da concentração de sacarose hidrolisada para a solução de 15 g/l (Ensaio 1) 7,00E-01 6,00E-01 5,00E-01 y = 0,0829x - 0,0044 R² = 0,9977 4,00E-01 3,00E-01 2,00E-01 1,00E-01 0,00E+00-1,00E-01 Gráfico 4_ Evolução da concentração de sacarose hidrolisada para a solução de 15 g/l (Ensaio 2) 10

11 Concentração de Sacarose hidrolizada Concentração de Sacarose hidrolizada Concentração de Sacarose hidrolizada 1,00E+00 8,00E-01 6,00E-01 y = 0,129x - 0,0221 R² = 0,9964 4,00E-01 2,00E-01 0,00E+00-2,00E-01 Gráfico 5_ Evolução da concentração de sacarose hidrolisada para a solução de 25 g/l (Ensaio 1) 1,20E+00 1,00E+00 8,00E-01 6,00E-01 y = 0,152x - 0,0087 R² = 0,9938 4,00E-01 2,00E-01 0,00E+00-2,00E-01 Gráfico 6_ Evolução da concentração de sacarose hidrolisada para a solução de 25 g/l (Ensaio 2) 9,00E-01 8,00E-01 7,00E-01 6,00E-01 5,00E-01 4,00E-01 3,00E-01 2,00E-01 1,00E-01 0,00E+00 y = 0,1167x + 0,0228 R² = 0,9949 Gráfico 7_ Evolução da concentração de sacarose hidrolisada para a solução de 50 g/l (Ensaio 1) 11

12 Concentração de Sacarose hidrolizada Concentração de Sacarose hidrolizada Concentração de Sacarose hidrolizada 1,60E+00 1,40E+00 1,20E+00 1,00E+00 8,00E-01 y = 0,1888x + 0,0149 R² = 0,9955 6,00E-01 4,00E-01 2,00E-01 0,00E+00 Gráfico 8_ Evolução da concentração de sacarose hidrolisada para a solução de 50 g/l (Ensaio 2) 2,00E+00 1,80E+00 1,60E+00 1,40E+00 1,20E+00 1,00E+00 8,00E-01 6,00E-01 4,00E-01 2,00E-01 0,00E+00 y = 0,2667x + 0,0131 R² = 0,9972 Gráfico 9_ Evolução da concentração de sacarose hidrolisada para a solução de 100 g/l (Ensaio 1) 1,20E+00 1,00E+00 8,00E-01 6,00E-01 y = 0,1585x + 0,004 R² = 0,9989 4,00E-01 2,00E-01 0,00E+00 Gráfico 10_ Evolução da concentração de sacarose hidrolisada para a solução de 100 g/l (Ensaio 2) 12

13 O declive da reta que melhor se ajusta ao conjunto de pontos corresponde à velocidade da reação. A Tabela 11 sumariza os resultados obtidos. Tabela 11_ Velocidade da reação de hidrólise da sacarose obtida em cada um dos ensaios para cada uma das soluções utilizadas. Concentração da sacarose (g/l) Velocidade (mm min 1 ) 5 4,43E ,89E ,14E ,29E ,29E ,52E ,17E ,89E ,67E ,59E-01 Para os casos em que se realizaram dois ensaios calculou-se o valor mais provável da velocidade de reação. Com esses valores elaborou-se a Tabela 12. Tabela 12_Valores mais prováveis para a velocidade da reação de hidrólise da sacarose para cada uma das soluções utilizadas. Concentração da sacarose (g/l) Velocidade da reação (mm min 1 ) 5 4,43E ,89E ,85E ,41E ,53E ,13E-01 Recorrendo aos valores mais prováveis das velocidades da reação para cada concentração de sacarose é possível traçar-se um gráfico do tipo de Michaelis-Menten (Gráfico 11), que relaciona a velocidade máxima de reação, v max, K m e a concentração de substrato, [S], num determinado momento, da forma: v = v max [S] K m + [S] No entanto, a forma mais conveniente de determinar os valores de v max e K m para a invertase foi recorrendo à linearização de Lineweave-Burk, a qual relaciona as grandezas referidas da seguinte forma: 1 v = K m v max 1 [S] + 1 v max A representação de Lineweave-Burk para invertase está presente no Gráfico

14 1/Velocidade (1/mM min -1 ) Velocidade da reação (mm/min) 2,50E-01 2,00E-01 y = 0,0543ln(x) - 0,1032 R² = 0,9775 1,50E-01 1,00E-01 5,00E-02 0,00E+00 0,000 50, , , , , , ,000 Concentração da sacarose Gráfico 11_ Representação de Michaelis-Menten para a invertase. 25,00 20,00 15,00 y = 269,05x + 3,9255 R² = 0, ,00 5,00 0,00 0,000 0,010 0,020 0,030 0,040 0,050 0,060 0,070 0,080 1/Concentração da sacarose (1/mM) Gráfico 12_ Representação de Lineweave-Burk para a invertase. Por análise da equação da reta obtida na representação de Lineweave-Burk obteve-se facilmente o valor de v max, dado que o valor de 1 v max corresponde à ordenada na origem da reta. Então, 1 = 3,9255 v v max = 1 0,2549 mm min 1 max 3,

15 Sabe-se, igualmente, que o declive a reta é dado por K m vmax. Dado que já foi calculado v max, vem: K m v max = 269,05 K m = 269,05 0, ,59 mm 15

16 Discussão Após avaliação dos resultados obtidos neste trabalho experimental retiraram-se várias conclusões quanto ao valor de velocidade máxima da reação e da constante K m, parâmetros estes que fornecem informação acerca da relação enzima-substrato. Verificou-se que, tendencialmente, dá-se o aumento da velocidade da reação quando se aumentava a concentração de substrato. Ainda assim, em alguns dos casos para os quais foram realizados dois ensaios para a mesma concentração de sacarose, verificaram-se algumas incoerências, na medida em que a velocidade da reação diminuiu face a um aumento de substrato (ver Tabela 11, por exemplo a velocidade de reação obtida no primeiro ensaio da solução de sacarose a 50 g/l é inferior às velocidades de reação para os dois ensaios com solução de 25 g/l). Estes resultados dever-se-ão a erros experimentais possivelmente cometidos durante a preparação das soluções que iriam ser colocadas no espectrofotómetro. No entanto, ao ser considerado o valor mais provável das velocidades (Tabela 12), os resultados mostram-se coerentes com a nossa hipótese. O aumento da velocidade face ao aumento da concentração de substrato deve-se ao facto de, para uma quantidade de enzima fixa, haver maior quantidade de sacarose disponível para se ligar à invertase, que ao ligar-se ao centro ativo da enzima origina glucose e frutose (produtos da hidrólise), levando a um aumento da velocidade máxima para esta reação. Por análise do gráfico da representação de Michaelis-Menten (Gráfico 11) verifica-se que a velocidade da reação aumenta (seguindo, aproximadamente, a curva de uma função logarítmica) com o aumento da concentração de sacarose, visto que estas grandezas se relacionam de forma proporcional. Este gráfico foi traçado apenas com os valores mais prováveis para a velocidade em função da concentração de substrato, verificando-se sempre um aumento da velocidade da reação à medida que se aumenta a concentração de substrato. Ao utilizar os valores médios desprezaram-se os valores para os quais não se obtinha uma relação de proporcionalidade direta entre a velocidade e a concentração de sacarose. Para uma temperatura de termostatização de cerca de 40 ºC e solução de invertase preparada em tampão de acetato com ph 4,5, obteve-se um valor de K m de 68,59 mm. Comparou-se o valor de K m obtido com valores teóricos que constam na base de dados BRENDA: 61,2 mm (enzima livre, ph de 5,0 e temperatura de reação 50 ºC) [2]. Esta comparação reside no facto de as condições de temperatura e ph apresentadas para estes valores serem as mais próximas das condições experimentais. Verificou-se que o valor experimental de K m se encontra relativamente próximo do valor teórico escolhido. Ainda assim, é importante salientar que as condições tabeladas para este valor não eram exatamente iguais às utilizadas na nossa atividade laboratorial, diferindo o ph em cerca de 0,5 e a temperatura de cerca de 10 ºC. São fundamentalmente estas as discrepâncias que levam às diferenças entre o valor experimental e os tabelados, ainda que o valor de K m obtido também esteja eventualmente associado a erros experimentais no laboratório e no tratamento dos dados, nomeadamente ao nível dos arredondamentos e quando se desprezaram alguns valores. 16

17 Foi através da representação de Lineweaver-Burk (Gráfico 12) que se obtiveram os valores da velocidade máxima da reação (v max 0,2549 mm min 1 ) e do K m. Esta surge como uma forma mais eficiente e precisa para o cálculo dos parâmetros cinéticos, por estabelecer uma relação linear entre estes, contrariamente à equação de Michaelis-Menten. Estes valores, como foi referido, estão sujeitos a erros experimentais, nomeadamente erros associados à determinação da reta de calibração a partir dos valores de absorvância para as várias amostras para o mesmo comprimento de onda λ = 540nm. Para algumsa amostras obtiveram-se valores de absorvância negativos (ainda que a calibração do espectrofotómetro para o branco fosse 0), pelo que os mesmos foram excluídos desta análise. Estes valores devem-se ao facto de a solução não estar bem preparada, não contendo exatamente a quantidade de DNS que era suposto. 17

18 Bibliografia [1] Fialho A., Moreira L., Leitão J. H., Mira N., Teixeira M., Sá-Correia I., Protocolos das Aulas Laboratoriais de Bioquímica e Biologia Molecular, 1ºSemestre, 2015/2016, Instituto Superior Técnico. [2] VALUE [mm] (consultado a 2 de novembro de 2015) 18