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1 2 MAPA/SDA/CGAL Aprovação: Revisão: 1.0 Propósito Página: 1 de 5 Maria de Fátima Martins Pinhel Maria de Fátima Zanini Vieira Maitê Megeto Costa Responsável pela unidade Responsável substituta Analista Indicar o procedimento a ser executado para determinação de componentes secundários por cromatografia gasosa. 2.0 Escopo Aplica-se a todos os colaboradores da unidade autorizados a operar o cromatógrafo gasoso e treinados neste MET. 3.0 Descrição e definições Cromatógrafo gasoso (CG): instrumento analítico que permite analisar diversos compostos em uma amostra que podem ser vaporizados sem decomposição. Vial: vidraria especial destinada ao acondicionamento de amostras para análise no CG. 4.0 Procedimentos 4.1 Material Aparelho de destilação (pode ser destilador eletrônico); Densímetro digital; Sistema de purificação de água; Cromatógrafo gasoso equipado com autoinjetor split-splitless e detector de ionização de chama; Coluna capilar de fase estácionária polar DB-Wax (30m x 0,25mm x 0,25µm); Gases especiais (99,999% de pureza): nitrogênio, hidrogênio e ar sintético; Micropipetas de 10µL, 100µL e 200µL; Vials; Balões e pipetas volumétricas; Padrões utilizados (grau de pureza > 99%): etanol, acetaldeído, acetato de etila, metanol, 2-butanol, propanol, iso-butanol, butanol, isoamílico, lactato de etila e furfural. Nota: novos padrões podem ser incluídos neste MET. 4.2 Condições cromatográficas As condições de operação do CG foram determinadas baseadas nas resoluções dos picos cromatográficos referentes aos analitos em estudo, e levando em consideração o menor tempo de análise. Primeiramente, os padrões devem ser injetados separadamente para saber o tempo de retenção de cada um e se os mesmos não se encontram contaminados Condicionamento da coluna cromatográfica Temperatura injetor: 250 C; Temperatura detector: 250 C; Temperatura da coluna: 220 C; Fluxo coluna: 0, ml/min; Pressão coluna: 126 kpa;

2 Página: 2 de 5 Velocidade linear: 29,9098 cm/s; Fluxo total: 67 ml/min; Método salvo como cond220.met; Tempo de condicionamento: mínimo de 2h. Se o CG estiver sem uso por mais de uma semana, deixar a coluna condicionando aproximadamente 24h. Após esse período, trocar o método como se fosse analisar uma amostra, injetar uma solução etanólica e verificar se a cauda do etanol está bem próxima da linha de base. Se sim, a coluna está condicionada para o método, se não deixar a coluna condicionando por mais tempo Separação cromatográfica Temperatura injetor: 180 C; Temperatura detector: 190 C; Programação de temperatura da coluna: RAMPA ( C) TEMPERATURA ( C) TEMPO (min) , , ,9 Tempo total: 15 min; Fluxo coluna: 1,40139 ml/min; Pressão coluna: 95 kpa; Velocidade linear: 31,8618 cm/s; Fluxo total: 18 ml/min; Split: 1: Curva de calibração A quantificação dos componentes secundários é realizada mediante padronização externa e contempla assim a construção de uma curva de calibração. Neste método poderão ser quantificados, por exemplo, os seguintes componentes: acetaldeído, acetato de etila, metanol, 2-butanol, propanol, iso-butanol, butanol, isoamílico, lactato de etila e furfural Preparo da curva de calibração Após o condicionamento da coluna cromatográfica (item 4.2.1), preparar uma curva de calibração contendo todos os componentes a serem quantificados em 5 níveis, de modo a contemplar, preferencialmente, uma faixa de 50% a 150% da concentração esperada do analito na amostra. Considerar o ponto central (100%) o limite máximo permitido nos padrões de identidade e qualidade exigidos pelo MAPA; Para a curva de calibração deverá ser preparada uma solução etanólica em água purificada, cerca de 1L, próximo ao grau alcoólico da amostra a ser analisada. Ex: etanol 40 GL; Colocar uma quantidade dessa solução etanólica, cerca de 30mL, nos 5 balões volumétricos de 100mL; Cada ponto da curva de calibração deverá conter a concentração de cada padrão analítico. O cálculo para concentração (mg/100ml ou g/l) de cada analito é: volume (ml) x densidade do reagente (mg/ml ou g/ml) x pureza do reagente (sem ser em porcentagem);

3 Página: 3 de 5 O volume adequado de cada padrão deverá ser adicionado a cada balão seguindo uma ordem de concentração crescente, de forma a contemplar todos os pontos da curva e todos os padrões; Após a adição de cada padrão, o balão deve ser agitado, tomando-se o cuidado de evitar perdas; Quando a curva contemplar o padrão acetaldeído, deve ser adicionado por último, devido a sua alta volatilidade, sendo que balões e pipetas devem estar na mesma temperatura do padrão e as soluções devem ser preparadas em banho de gelo; Ao final da adição de todos os padrões de interesse, o volume dos balões deverá ser completado com a solução etanólica indicada, agitado corretamente, transferido aos vials e injetado no CG Injeção no CG Para inserir uma curva de calibração no CG é necessária a análise dos pontos nas mesmas condições do método (item separação cromatográfica), e para cada curva à ser analisada um novo método deverá ser criado; Após a injeção de todos os pontos da curva, o cálculo da equação da reta referente a cada padrão será gerado pelo software do equipamento. O critério de aceitação para cada padrão é r² 0,99. Caso a curva de calibração não atenda este critério, outra curva deverá ser preparada. 4.4 Preparo das amostras para análise Grau alcoólico real Todas as amostras devem ser destiladas e quantificadas com grau alcoólico real (% volume) a 20 C, seguindo o Caderno 05 ou Caderno 06 do Método Oficial de Análise de Bebidas Destiladas do Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento Análise no CG Transferir a amostra destilada a um vial e injetar no CG na mesma curva de calibração aprovada; Identificar os picos dos componentes pelos respectivos tempos de retenção. Imprimir o cromatograma e utilizar as concentrações analisadas para os devidos cálculos; Para bebidas destiladas, a concentração no cromatograma está em mg/100ml e para transformá-la em mg/100ml de álcool anidro, deve ser realizado o seguinte cálculo: concentração (mg/100ml) x 100 / grau alcoólico encontrado = mg/100ml álcool anidro; Para bebidas fermentadas alcoólicas a concentração já está em g/l, não necessitando de outros cálculos para expressar os resultados; Transcrever os resultados para a ficha de análise da bebida correspondente (FORM BEB/034 ou FORM/BEB/035) e anexar o cromatograma; Como garantia de resultado deste MET pode-se, dependendo da disponibilidade: a) Preparar um ponto da curva e analisá-lo junto às amostras; b) Escolher uma das amostras da rotina e analisá-la em duplicata; c) Analisar uma amostra controle (exemplo: material de referência), em paralelo às análises de rotina;

4 Página: 4 de 5 d) As reanálises de amostras reprovadas devem ser executadas, preferencialmente, em triplicata e por outro analista. 5.0 Bibliografia Caderno 05 - Método Oficial de Análise de Bebidas Destiladas do Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento. Caderno 06 - Método Oficial de Análise de Bebidas Fermentadas Alcoólicas do Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento. 6.0 Anexos Não aplicável. 7.0 Documentos complementares FORM BEB/034 Ficha de Análise de destilados / destilo-retificados / alcoólicos por mistura; FORM BEB/035 Ficha de Análise de Fermentados Alcoólicos. 8.0 Histórico de alterações ITEM RESUMO DAS ALTERAÇÕES 4.1 Alteração do 7º subitem: Micropipetas de 10µL, 100µL e 200µL. Exclusão da seguinte frase no 2º subitem: e armazená-la em geladeira. Alteração do 4º subitem: Cada ponto da curva de calibração deverá conter a concentração de cada padrão analítico. O cálculo para concentração (mg/100ml ou g/l) de cada analito é: volume (ml) x densidade do reagente (mg/ml ou g/ml) x pureza do reagente (sem ser em porcentagem). Exclusão do 6º subitem: A microsseringa deverá ser lavada continuamente (de 3 à 5 vezes) com a solução etanólica, e ambientada com o padrão entre a utilização dos diferentes padrões, afim de evitar a contaminação dos mesmos Se for utilizada micropipeta, recomenda-se usar uma ponteira para cada padrão e esta deverá ser descartada após o uso. Alteração do 8º subitem: Quando a curva contemplar o padrão acetaldeído, este deve ser adicionado por último, devido a sua alta volatilidade, sendo que balões e pipetas devem estar na mesma temperatura do padrão e as soluções devem ser preparadas em banho de gelo. Alteração do 9º subitem: Ao final da adição de todos os padrões de interesse, o volume dos balões deverá ser completado com a solução etanólica indicada, agitado corretamente, transferido aos vials e injetado no CG Alteração de todo o item Inclusão no item: ou Caderno 06. Alteração do 3º subitem: Para bebidas destiladas, a concentração no cromatograma está em mg/100ml e para transformá-la em mg/100ml de álcool anidro, deve ser realizado o seguinte cálculo: concentração (mg/100ml) x 100 / grau alcoólico encontrado = mg/100ml álcool anidro; Para bebidas fermentadas alcoólicas a concentração já está em g/l, não necessitando de outros cálculos para expressar os resultados.

5 Página: 5 de 5 ITEM RESUMO DAS ALTERAÇÕES Inclusão do subitem: Caderno 06 - Método Oficial de Análise de Bebidas Fermentadas Alcoólicas do Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento. Exclusão dos subitens: IT CTEC/026 Verificação de desempenho/validação intralaboratorial, cálculo de incerteza e controle de qualidade; FORM CTEC/041 Resultados da validação / Verificação de desempenho. 9.0 Análise crítica Evidência de análise crítica

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