Trabalho nº 4. Estudo da Estabilidade da α-quimotripsina a ph Alcalino por Absorção no UV

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1 Trabalho nº 4 Estudo da Estabilidade da α-quimotripsina a ph Alcalino por Absorção no UV Laboratórios de Engenharia Biológica I

2 Objectivo Medir a estabilidade térmica da α-quimotripsina a ph alcalino usando espectrofotometria de absorção no UV. Introdução A estrutura terciária de uma proteína é essencial para a manutenção da sua actividade biológica. As alterações estruturais a este nível, designadamente a desnaturação ou desenrolamento das proteínas, são frequentemente responsáveis pela perda de actividade. As proteínas são facilmente desnaturadas na presença de factores experimentais adversos como aumentos de temperatura, varições de ph e presença de agentes desnaturantes, como por ex. detergentes, ureia (8M) ou cloreto de guanidilo (6M). Nestas condições, ocorre o enfraquecimento das forças intramoleculares responsáveis pela manutenção da estrutura tridimensional e as moléculas de proteína colapsam para uma forma totalmente desenrolada (desnaturada) [1]. Existem várias técnicas para seguir o desenrolamento das proteínas, entre as quais a espectrofotometria (absorvância), espectroscopia de fluorescência e dicroismo circular, RMN e estudos hidrodinâmicos e de viscosidade. Entre estas, a espectrofotometria de absorção é uma técnica corrente de laboratório que não exige quaisquer requisitos especiais, quer em termos de equipamento, quer em termos de conhecimentos técnicos [2]. A alteração na absorção no UV por ionização dos resíduos de tirosina (Tyr) pode ser usada para seguir o desenrolamento das proteínas. Quando as Tyr se encontram escondidas no interior de uma proteína não são afectadas pelas variações de ph. Após o desenrolamento (desnaturação) da proteína, estes resíduos ficam expostos ao solvente e a ionização do grupo tirosil é detectável. Contudo, uma vez que a ionização do grupo fenol da tirosina só é mensurável para ph >9.0, esta metodologia é aplicável apenas numa gama de phs alcalinos [2]. Nesta gama de ph, a técnica corrente de espectroscopia de absorção diferencial no UV é dificilmente aplicada para seguir o desenrolamento da proteína. Esta técnica baseia-se numa diminuição da absorvância entre nm, por exposição ao solvente 2

3 de resíduos aromáticos no interior da proteína. A formação do tirosinato (ph>9.0) conduz a um aumento da absorvância entre 280 e 310 nm. Este aumento de absorvância sobrepõe-se ao deslocamento do máximo de absorvância para a região do vermelho resultante da exposição ao solvente, o que impede o uso da espectroscopia de absorção diferencial no UV a estes valores de ph. Neste trabalho, usa-se a detecção da ionização das Tyr para seguir a desnaturação da α-quimotripsina. A metodologia experimental é bastante simples e fácil de executar, e baseia-se na medição da absorvância a dois comprimentos de onda (250 e 278 nm). A aplicação desta metodologia exige, contudo, que o número e tipo de aminoácidos aromáticos presentes na proteína seja conhecido. Porém, este não é um factor restritivo ou limitativo da sua aplicabilidade, uma vez que, actualmente, as técnicas de biologia molecular permitem obter esta informação facilmente. Protocolo Experimental (Nota: Cada grupo de laboratório efectua o estudo de estabilidade apenas a um valor de ph (9.8, 10.2, 10.6 ou 11.0). Todos os resultados serão partilhados e tratados por todos os grupos). - Marque 36 eppendorfs com temperaturas entre 25 e 60ºC (para amostragem) indicando também o ph a que o estudo foi efectuado. - Coloque 48 ml de tampão carbonato-bicarbonato, 50mM, ph 9.8, 10.2, 10.6 ou 11.0, consoante o grupo, no reactor termostatizado a 25ºC. Espere 5 minutos para termostatizar a solução. - Pese 18,8 mg de α-quimotripsina num eppendorf. Solubilize (por ressuspensão com a pipeta de 1000 µl) a α-quimotripsina em 1mL do tampão em estudo, pipete e adicione ao reactor. Descarte a ponta. Com uma nova ponta, lave o 3

4 eppendorf com 1mL do mesmo tampão e adicione ao reactor. (18,8 mg de α- quimotripsina num volume final de 50 ml). - Coloque uma barra magnética e o termómetro dentro do reactor. Meça a temperatura no interior do reactor (que deve ser próxima de 25ºC) e tire uma amostra de 1 ml para o eppendorf respectivo. Coloque o eppendorf num recipiente com gelo (previamente preparado). - Com o termómetro mergulhado no reactor, siga o aumento de temperatura retirando amostras de 1 ml de 1 em 1ºC até atingir os 60ºC. Coloque as amostras no gelo. - Retire as amostras para um suporte de eppendorfs e deixe-as à temperatura ambiente durante alguns minutos, antes de efectuar as medições. - Utilizando uma célula de quartzo, leia a absorção a 250 e 278 nm das várias amostras, contra um branco do mesmo tampão. Registe os valores das medições no caderno de laboratório. - No final, registe também os valores das medições numa folha Excel, no computador do laboratório. Tratamento dos Resultados Construa uma tabela com os valores de temperatura, Abs a 250 e 278nm, α proteína /α. A partir dos valores de α proteína /α calcule, para cada temperatura, a constante de equilíbrio da desnaturação da α-quimotripsina (K D/N ), a fracção de α-quimotripsina desnaturada [f D = (α proteína /α) α proteína /α) N / ( α proteína /α) D (α proteína /α) N ] e a variação de energia livre associada ao processo de desnaturação ( G 0 = - RT 1n K D/N ). 4

5 Represente a razão α proteína /α em função da temperatura. Represente a fracção de α-quimotripsina desnaturada (f D ) em função da temperatura. Represente a variação de energia livre em função da temperatura, na zona em que essa variação é linear. Calcule a temperatura de transição, T m (temperature at the midpoint), e a variação de entalpia ( H m 0 ) e de entropia ( S m 0 ) para a temperatura de transição. Discuta o significado da temperatura de transição. Com base nos resultados obtidos pelos outros grupos, discuta o efeito do ph na estabilidade térmica da α-quimotripsina. Referências [1] Creighton, T.E. (ed) (1989) Protein structure, a pratical approach, IRL Press, Oxford. [2] Melo, E.P., Aires-Barros, M.R., Costa, S.M.B. e Cabral, J.M.S. (1997) Thermal unfolding of proteins at high ph range studied by UV absorbance, J. Biochem. Biophys. Methods, 34,