Cinética e regulação enzímicas (a velocidade das reacções enzímicas in vivo e in vitro)

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1 Conceitos de substrato de via metabólica, coenzima, grupo prostético e cofactor. Cinética e regulação enzímicas (a velocidade das reacções enzímicas in vivo e in vitro) rui.fontes@mail.telepac.pt Laboratório de Bioquímica da Faculdade de Medicina do Porto 1 s conceitos de substrato da via metabólica e coenzima só têm sentido se analisamos uma via metabólica no seu contexto celular. Na glicólise o substrato da via metabólica é a que se consome gerando piruvato ou lactato... s outros reagentes intervenientes (NAD, por exemplo) são também substratos das enzimas... mas na células a concentração do somatório NADH NAD é de alguns µm e a via glicolítica só pode ter lugar se o NADH for re-oxidado a NAD. NADH e o NAD (assim como o NH e o N e a coenzima A) costumam designarse como coenzimas: olhadas no contexto da célula não se consomem no metabolismo 2 mantendo (tal como as enzimas) uma concentração estacionária. s conceitos de apoenzima, grupo prostético e holoenzima podem ser definidos fora do contexto de uma via metabólica. grupo prostético é um resíduo não aminoacídico ligado de forma estável (frequentemente covalente) à apoenzima. Exemplos: (1) FAD nas desidrogénases dependentes do FAD (2) A biotina em determinadas carboxílases (como a carboxílase do piruvato) conceito de cofactor é o menos preciso. Cofactor é uma substância (orgânica ou não) que não se encontra ligada de forma covalente à enzima, é essencial ao processo catalítico mas...não é reagente nem produto da reacção. X Mg 2 X-P Exemplo: as reacções em que intervém o exigem a presença de Mg 2 (que podemos designar de cofactor) No entanto, muitos autores usam a palavra cofactor para designar 3 compostos que definimos como grupo prostético ou como coenzima. As concentrações dos intermediários do metabolismo variam de indivíduo para indivíduo e com o estado metabólico mas mantêm-se em torno de determinados valores. As concentrações dos intermediários do metabolismo dizem-se estacionárias. Exemplo: A concentração de (e a maioria dos outros compostos existentes nos seres vivos) considerando as várias reacções em que intervém como reagente ou produto não está em equilíbrio químico....mas a velocidade do conjunto de reacções que formam é (quase) sempre igual à velocidade do conjunto de reacções em que este se gasta... existe nas células uma concentração estacionária de. s mecanismos que permitem manter o, os intermediários do metabolismo, a do plasma, etc em concentrações estacionárias são muito complexos e denominam-se 4de mecanismos homeostáticos.

2 A regulação do metabolismo de modo a adaptar-se a diferentes condições (actividade ou descanço, jejum ou estado absortivo, diferentes tipos de dieta, etc.) é uma condição de sobrevivência. nutrientes C 2 ureia 2 trabalho mecânico contracção muscular transporte activo Ca Na Estado absortivo= Glicemia Estado de jejum = Glicemia A adaptação a diferentes condições só é possível porque a actividade das 5 enzimas se modifica quando se alteram essas condições. As enzimas são sensores do ambiente onde se encontram variando a sua actividade em função de variações nesse ambiente A 1000 As enzimas que catalisam reacções fisiologicamente reversíveis catalisam a conversão líquida no sentido directo ou inverso de acordo com a lei da acção das massas mas não são determinantes no sentido nem na velocidade de fluxo (J) da via metabólica... S 10,01 P B 0,01 As enzimas marca passo de uma via metabólica catalisam reacções fisiologicamente irreversíveis e a sua actividade determina a velocidade de fluxo nessa via metabólica. Estas enzimas (1) têm baixa actividade, (2) tem um papel determinante na regulação do metabolismo e (3) são controladas por efectores que só às vezes coincidem com os substratos e produtos... Glicólise 6 Aumentar a actividade de uma enzima que catalisa uma reacção de desequilíbrio (M2 M3) pode significar um aumento transitório na concentração do intermediário M3 mas, a enzima a jusante que catalisa a conversão reversível M3 M4 rapidamente repõe a concentração de M3 num valor próximo do original. J 1 = (10) = ( ) = 10 É na barragem que se controla o caudal (fluxo) de um rio mudanças no valor do fluxo (J) na barragem provocam mudanças de fluxo idênticas a montante e a jusante da barragem. J 2 = (20) = ( ) = 20 7 Diferentes tipos de mecanismos podem participar na regulação das enzimas marca-passo das vias metabólicas: 1- De instalação lenta (horas ou dias): a quantidade de enzima como a resultante das velocidades da sua síntese e da sua degradação Modificação alostérica (, Ca 2 ) 2- De instalação rápida (segundos ou milisegundos): 3- De instalação rápida mas, geralmente, com papel menos importante (pelo menos no metabolismo normal) 2.2- Modificação covalente (fosforilação e defosforilação, clivagem hidrolítica ) 2.3- Ciclos de substratos ( fúteis ) 2.4- Acesso ao substrato por regulação do transporte transmembranar (GLUT4, CPT ) 3.1- Concentração de substratos 3.2- Inibição isostérica (competitiva) e inibição pelo produto 3.3- ph 3.4- Temperatura M M M-P M 8

3 1- Mesmo quando o que varia é apenas a concentração da enzima E sem que tenha variado a actividade de cada uma das suas moléculas se a velocidade da reacção que E catalisa aumentou dizemos que a actividade enzímica da enzima E aumentou (e vice-versa). É um mecanismo de instalação lenta. RNAm v1 Síntese proteica v2 RNAm 2.1- Quando uma fibra muscular se contrai aumenta a velocidade de hidrólise do e aumenta a concentração de (e ; 2 ). liga-se à fosforílase muscular induzindo uma conformação mais activa o é um activador alostérico da fosforílase muscular. Fosforílase muscular na conformação tensa (inactiva) sítio alostérico Fosforílase muscular na conformação relaxada (activa) Glicose-1-P v1 > v2 v2 > v1 Se a velocidade de síntese de uma determinada enzima (v1) é maior que a velocidade com que se degrada (hidrolisa) na célula (v2) a concentração e a actividade dessa 9 enzima aumenta. Na condição inversa a concentração e a actividade diminuem. centro activo 10 C 2 Na cínase-1 da frutose-6-p ( Frutose-1,6-bisfosfato) o é, simultaneamente, substrato e inibidor alostérico. Para concentrações fisiológicas de, o (e o ) é um activador alostérico. A complexidade dos processos de regulação de enzimas induzida por hormonas e neurotransmissores tem levado a que a palavra alostérico não se use neste contexto mesmo quando o termo seria adequado. Insulina ligada ao seu receptor (3) (e o ) compete com o pelo mesmo sítio alostérico impedindo a sua acção inibidora. receptor da insulina pode ser visto como uma enzima alostérica com o seu centro alostérico activador virado para o lado extra-celular (onde se liga a insulina) e o centro activo no lado citoplasmático. (1) Um dos substratos da cínase da frutose-6-p é o. (2) Contudo, existe na enzima um sítio alostérico onde o se liga inibindo-a. Para concentrações fisiológicas de essa acção inibidora é muito 11 marcada. Efeitos da insulina A ligação da insulina induz uma alteração conformacional no receptor que se torna capaz de catalisar a fosforilação de resíduos tirosina de proteínas designadas de Substratos do Receptor da Insulina (IRS). 12

4 A ligação entre os modificadores (activadores ou inibidores) alostéricos e os sítios alostéricos das enzimas é reversível e é de tipo não covalente. Activador alostérico 2.2- A modificação da actividade de uma enzima pode envolver a sua modificação covalente (hidrólise irreversível ou fosforilação reversível) por acção catalítica de enzimas (normalmente outras enzimas). Certas enzimas são activadas por hidrólise irreversível. São exemplos a activação dos zimogénios na digestão dos nutrientes. Inibidor alostérico e o mesmo acontece nas ligações dos substratos e dos inibidores isostéricos competitivos ao sítio activo das enzimas. Exemplo 1: tripsinogénio é segregado pelo pâncreas. Convertese em tripsina (protéase digestiva) por acção da enteropeptídase (uma ectopeptídase presente no pólo apical dos enterócitos). Tripsinogénio Enteropeptídase Exemplo 2: pepsinogénio é segregado pelas células principais do estômago. Converte-se em pepsina (protéase digestiva) por acção hidrolítica do ph ácido do estômago e da próprio pepsina que já se formou. Inibidor isostérico competitvo 13 Tripsina (activa) polipeptídeo inactivo 14 Muitas enzimas são reguladas por mecanismos de fosforilação/desfosforilação catalisadas por enzimas (cínases e fosfátases). Forma desfosforilada (activa) A fosfátase da piruvato catalisa a desfosforilação da piruvato que no estado desfosforilado fica activa. Forma fosforilada (inactiva) A cínase da piruvato catalisa a fosforilação da piruvato que no estado fosforilado fica inactiva. A actividade da piruvato depende da percentagem da enzima total que está na forma activa (desfosforilada). valor desta percentagem depende das actividades relativas da (1) cínase 15 da piruvato e da (2) fosfátase da piruvato. 2.2, 2.1 e 1- A controlo da actividade das enzimas pode envolver mais de um mecanismo sendo o conjunto dos mecanismos de análise complexa. Ca 2 entra nas fibras musculares quando estas são estimulas pelo nervo motor e um dos efeitos é a estimulação alostérica da fosfátase da piruvato Ca 2 A insulina aumenta no sangue quando a glicemia aumenta e um dos seus efeitos é reprimir o gene codificador da cínase da piruvato Ca 2 e a insulina estimulam a oxidação do piruvato. 16

5 2.1 e 2.2- A fosforílase do glicogénio (quer hepática quer muscular) também é regulada por mecanismos de fosforilação (activadores) e desfosforilação (inibidores) induzidos pela acção de hormonas. A glicagina (no caso do fígado) e as catecolaminas (nos casos do músculo e fígado) podem desencadear uma cadeia de reacções que levam à fosforilação e consequente activação da fosforílase do glicogénio e, consequentemente, da fosforólise do glicogénio (formação de -1-P). A insulina activa uma fosfátase que reverte o processo; a fosfátase 1 de proteínas desfosforila a fosforílase do glicogénio inactivando-a. PKA= cínase de proteínas dependente do cíclico 17 Fosfátase 1 de proteínas 2.3- A existência de ciclos de substrato (antigamente chamados de fúteis ) permite amplificar o efeito de um sinal. (cuja concentração aumenta aquando do exercício) activa a glicólise muscular porque estimula a cínase da frutose-6-p mas também porque inibe a frutose-1,6-bisfosfátase. aumento de fluxo na glicólise é muito mais marcado que o que seria de prever do efeito do apenas numa das enzimas. J=1 J=89 J=1 C 2 v = 9 v = 10 C 2 v = 1 v = 90 J= Também há ciclos de substrato no fígado (principal órgão da gliconeogénese). Aqui, o sentido do fluxo pode inverter-se. Após uma refeição que contenha glicídeos, a concentração intracelular de frutose-2,6-bisfosfato é alta e fica estimulada a cínase 1 da frutose-6-p (e a glicólise). No jejum, a concentração intracelular de frutose-2,6-bisfosfato é baixa e fica estimulada a frutose-1,6-bisfosfátase (e a gliconeogénese). Glicose-6-P Glicose-6-P J=10 J= - 10 v = 20 Frutose-2,6- v = 10 v = 20 bisfosfato Frutose- 2,6- bisfosfato v = A acessibilidade aos substratos. Nas fibras musculares a entrada de (e a sua subsequente metabolização) é limitada pelo número de transportadores (GLUT4) presentes na membrana sarcoplasmática. Contracção muscular ou insulina Quer o exercício físico quer a insulina estimulam a entrada de para as fibras musculares porque nestas condições, de forma rápida, vesículas intracelulares contendo GLUT4 fundem-se com a membrana sarcoplasmática. J=10 Fosfoenol-piruvato J= Fosfoenol-piruvato Nos adipócitos o mesmo efeito é induzido pela insulina. A insulina e o exercício físico estimulam a remoção da do plasma para as células. 20

6 2.1, 2.2 e 2.4- A entrada de acil-coa (ácidos gordos activados ) para a mitocôndria (local onde ocorre a sua oxidação) depende da actividade da carnitina-acil transférase I que é inibida (inibição alostérica) pelo malonil-coa. Quando a concentração citoplasmática de malonil-coa desce a entrada de acil-coa para a mitocôndria acelera. É dentro da mitocôndria que se dá a oxidação dos ácidos gordos (oxidação em beta). s factores que estimulam a K levam à fosforilação da carboxílase da acetil- CoA. A fosforilação inactiva a carboxílase de acetil-coa o que baixa a concentração de malonil-coa. A descida do malonil-coa desinibe a carnitinapalmitoil transférase I... acelerando-se a entrada de acil-coa para a mitocôndria. oxidação em β 21 oxidação em β Estudamos até agora os mecanismos 1, 2.1, 2.2, 2.3 e 2.4. Falta referir os 3.1, 3.2, 3.3 e De instalação lenta: a quantidade de enzima como a resultante das velocidades da sua síntese e da sua degradação. 2- De instalação rápida: 3- De instalação rápida mas, geralmente, com papel menos importante (pelo menos no metabolismo normal) 2.1- Controlo alostérico (, Ca 2 ) 2.2- Modificação covalente (fosforilação e defosforilação, clivagem hidrolítica ) 2.3- Ciclos de substratos ( fúteis ) 2.4- Acesso ao substrato por regulação do transporte transmembranar (GLUT4, CPT ) 3.1- Activação pelos substratos 3.2- Inibição isostérica (competitiva) e inibição pelo produto 3.3- ph 3.4- Temperatura Nas enzimas marca-passo, geralmente, o efeito directo da variação da concentração do substrato é pequeno (que mais não seja porque, in vivo, as concentrações dos metabolitos são estacionárias). Mas, em alguns casos foi possível estudar in vivo a variação da actividade de enzimas com a concentração do substrato. Num estudo de Brindle et al. (1989) estimulou-se electricamente o nervo ciático de ratos e mediu-se, na musculatura da perna, por NMR (1) a concentração de e (2) a incorporação de no (síntase do ). Baixa actividade contráctil Brindle et al. (1989) Biochemistry 28: Alta actividade contráctil 23 A entrada (GLUT2) e a fosforilação da no fígado (cínase da /hexocínase IV) é regulada directamente pela concentração de na veia porta e nos hepatócitos. Actividade do GLUT2 Concentrações de possíveis na veia porta Actividade do Glicocínase Concentrações de possíveis no hepatócito Quando a concentração de aumenta no sangue após as refeições entra para os hepatócitos provocando a dissociação do complexo glicocínase proteína nuclear inibidora da glicocínase. Quer o GLUT 2 quer a glicocínase são sensíveis às variações fisiológicas da concentração de 24

7 3.2- produto como inibidor das enzimas marca-passo. Na reacção catalisada pela desidrogénase da -6-P (via das pentoses- P) a reacção inversa não existe mas o NH compete com o N pelo local de ligação deste no centro activo (inibição isostérica e competitiva). N N G 18 kj; Keq/QR fosfogliconolactona NH A PKA é uma enzima que na forma inactiva tem o seu sítio activo bloqueado pela ligação a sub-unidades reguladoras que contêm um domínio pseudo-substrato (inibição isostérica e competitiva). A ligação do cíclico às sub-unidades reguladoras induz a dissociação das subunidades catalíticas que são activas. c c P fosfodiestérase NH NH A desidrogénase da -6- fosfato é activada sempre que a concentração intracelular de NH desce. Para além de regulada ao nível da transcrição (a desidrogénase da -6-P é induzida pela insulina) a descida da concentração intracelular de N5 (um dos produtos) também estimula a actividade da enzima. Subunidades reguladoras Subunidades catalíticas PKA inactiva (ligada e sub-unidades reguladoras) Domínio semelhante aos substratos Sítio activo A PKA (cínase de proteínas dependente do c) dissociada das unidades reguladoras é activa e catalisa a 26 fosforilação de enzimas 3.3- Pensa-se que a variação do ph não tem, em geral, um papel importante na regulação das enzimas intracelulares mas a) No estômago o ph do suco gástrico é ácido e as enzimas deste suco têm ph óptimo ácido. b) suco pancreático neutraliza o quimo gástrico (H HC 3- C 2 ) e as enzimas do suco pancreático e as enzimas intestinais têm ph óptimo neutro. c) Pensa-se que a diminuição da oxidação dos ácidos gordos durante a glicólise anaeróbia nas fibras musculares esqueléticas se deve à diminuição de actividade da carnitina-palmitil-transférase I cuja actividade diminui quando o ph desce. ph baixo Acidificação das fibras musculares durante glicólise anaeróbia No homem, a alteração de actividade das enzimas das células em situações de abaixamento da temperatura corporal ou de febre poderá ser importante mas não desempenha um papel relevante na regulação do metabolismo normal. As enzimas e transportadores humanos (ao contrário do que acontece com outros seres vivos) foram seleccionados de forma a manterem velocidades de fluxo adequadas à vida (nas vias anabólicas e catabólicas) numa estreita gama de temperaturas. Francisco Lázaro ( ) s órgãos para transplante são transportados a baixas temperaturas de forma a lentificar os processos catabólicos nomeadamente a hidrólise de proteínas (enzimas, transportadores, actina-miosina, etc) 28