Cinética e regulação enzímicas (a velocidade das reações enzímicas in vivo e in vitro)

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1 Conceitos de substrato de via metabólica, coenzima, grupo prostético e cofator. Cinética e regulação enzímicas (a velocidade das reações enzímicas in vivo e in vitro) ruifonte@med.up.pt Departamento de Bioquímica da Faculdade de Medicina do Porto 1 Os conceitos de substrato da via metabólica e coenzima só têm sentido se analisamos uma via metabólica no seu contexto celular. Na glicólise o substrato da via metabólica é a glicose que se consome gerando piruvato ou lactato... Os outros reagentes intervenientes (NAD +, por exemplo) são também substratos das enzimas... mas na células o somatório das concentrações de NADH + NAD + édealgunsμm eavia glicolítica só pode ter lugar se o NADH for reoxidado a NAD +. O NADH e o NAD + (assim como o NH e o N + eacoenzimaa)costumam designarse como coenzimas: olhadas no contexto da célula (células isoladas ou organismos) 2 não se consomem no metabolismo mantendo (tal como as enzimas) uma concentração estacionária. Os conceitos de apoenzima, grupo prostético e holoenzima podem ser definidos fora do contexto de uma via metabólica. O grupo prostético é um resíduo não aminoacídico ligado de forma estável (frequentemente covalente) à apoenzima. Exemplos: (1) O FAD nas desidrogénases dependentes do FAD (2) A biotina em determinadas carboxílases (como a carboxílase do piruvato) O conceito de cofator é o menos preciso. Cofator é uma substância (orgânica ou não) que Mg 2+ não se encontra ligada de forma covalente à enzima, é essencial ao processo catalítico mas...não é reagente nem produto da reação. + X + X-P Exemplo: as reações em que intervém o exigem a presença de Mg 2+ (que podemos designar de cofator) No entanto, muitos autores usam a palavra cofator para designar 3 compostos que definimos como grupo prostético ou como coenzima. As concentrações dos intermediários do metabolismo variam de indivíduo para indivíduo e com o estado metabólico mas mantêm-se em torno de determinados valores. As concentrações dos intermediários do metabolismo dizem-se estacionárias. Mas a concentração da frutose-1-p não é estacionária. Exemplo: A concentração de (e a maioria dos outros compostos existentes nos seres vivos) considerando as várias reações em que intervém como reagente ou produto não está em equilíbrio químico....mas a velocidade do conjunto de reações que formam é (quase) sempre igual à velocidade do conjunto de reações em que este se gasta... existe nas células uma concentração estacionária de. Os mecanismos que permitem manter o, os intermediários do metabolismo, a glicose do plasma, etc. em concentrações estacionárias são muito complexos e denominam-se 4 de mecanismos homeostáticos.

2 A regulação do metabolismo de modo a adaptar-se a diferentes condições (atividade ou descanso, jejum ou estado absortivo, diferentes tipos de dieta, diferentes graus de atividade física ao longo da vida, etc.) é uma condição de sobrevivência. As enzimas são sensores do ambiente onde se encontram variando a sua atividade em função de variações nesse ambiente. 11 Glicólise nutrientes O 2 + Pi trabalho mecânico transporte ativo Ca + Estado absortivo= Glicemia Estado de jejum = Glicemia A 1 As enzimas que catalisam reações fisiologicamente reversíveis catalisam a conversão líquida no sentido direto ou inverso de acordo com a lei da ação das massas, mas não são determinantes no sentido nem na velocidade de fluxo (J) da via metabólica. 1,1 B CO 2 + ureia contração muscular A adaptação a diferentes condições só é possível porque a atividade das 5 enzimas se modifica quando se alteram essas condições. Na + glicose S P,1 As enzimas marca passo de uma via metabólica catalisam reações fisiologicamente irreversíveis e a sua atividade determina a velocidade de fluxo nessa via metabólica. Estas enzimas (1) têm baixa atividade, (2) tem um papel determinante na regulação do metabolismo e (3) são controladas por efetores que só às vezes coincidem com os substratos e produtos. 6 Aumentar a atividade de uma enzima que catalisa uma reação de desequilíbrio (M2 M3) pode significar um aumento transitório na concentração do intermediário M3 mas, a enzima a jusante que catalisa a conversão reversível M3 M4 rapidamente repõe a concentração de M3 num valor próximo do original. J 1 = (1) = (11 1) = 1 É na barragem que se controla o caudal (fluxo) de um rio. Mudanças no valor do fluxo (J) na barragem provocam mudanças de fluxo idênticas a montante e a jusante da barragem. J 2 = (2) = (12 1) = 2 7 Diferentes tipos de mecanismos podem participar na regulação das enzimas marca-passo das vias metabólicas: 1- De instalação lenta (horas ou dias): a quantidade de enzima como a resultante das velocidades da sua síntese e da sua degradação Modificação alostérica (AMP, Ca 2+ ) 2- De instalação rápida (segundos ou milissegundos): 3- De instalação rápida mas, geralmente, com papel menos importante (pelo menos no metabolismo normal) 2.2- Modificação covalente (fosforilação e desfosforilação, clivagem hidrolítica ) 2.3- Ciclos de substratos ( fúteis ) M M-P 2.4- Acesso ao substrato por regulação do transporte transmembranar (GLUT4, CPT1 ) M e concentração de substratos Pi M 3.1- Inibição isostérica (competitiva) e inibição pelo produto 3.2- ph Temperatura

3 1- Mesmo quando o que varia é apenas a concentração da enzima E sem que tenha variado a atividade de cada uma das suas moléculas, se a velocidade da reação que a enzima E catalisa aumentou (/diminuiu), dizemos que a atividade enzímica da enzima E aumentou (/diminuiu). É um mecanismo de instalação lenta. RNAm v1 Síntese proteica v2 RNAm 2.1- Quando uma fibra muscular se contrai aumenta a velocidade de hidrólise do e aumenta a concentração de (e AMP; 2 AMP + ). O AMP liga-se à fosforílase muscular induzindo uma conformação mais ativa o AMP é um activador alostérico da fosforílase muscular. Fosforílase muscular na conformação tensa (inativa) AMP sítio alostérico Fosforílase muscular na conformação relaxada (ativa) Glicose-1-P v1 > v2 v2 > v1 AMP Se a velocidade de síntese de uma determinada enzima (v1) é maior que a velocidade com que se degrada (hidrolisa) na célula (v2) a concentração e a atividade dessa enzima 9 aumenta. Na condição inversa a concentração e a atividade diminuem. centro ativo 1 CO 2 + Na cínase-1 da frutose-6-p (+ Frutose-6-P + Frutose-1,6-bisfosfato) o é, simultaneamente, substrato e inibidor alostérico. Para concentrações fisiológicas de, o AMP (e o ) é um activador alostérico. (1) Um dos substratos da cínase da frutose-6-p é o. (3) O AMP (e o ) compete com o pelo mesmo sítio alostérico impedindo a sua ação inibidora. (2) Contudo, existe na enzima um sítio alostérico onde o se liga inibindo-a. Para concentrações fisiológicas de essa ação inibidora é muito 11 marcada. A complexidade dos processos de regulação de enzimas induzida por hormonas e neurotransmissores tem levado a que a palavra alostérico não se use neste contexto mesmo quando o termo seria adequado. Expressões equivalentes são: domínio regulador, local de ligação da hormona/neurotransmissor ao recetor que tem atividade enzimática. Efeitos da insulina Insulina ligada ao seu recetor O recetor da insulina pode ser visto como uma enzima alostérica com o seu centro alostérico activador virado para o lado extracelular (onde se liga a insulina) e o centro ativo no lado citoplasmático. A ligação da insulina induz uma alteração conformacional no recetor que se torna capaz de catalisar a fosforilação de resíduos tirosina de proteínas designadas de Substratos do Recetor da Insulina (IRS). 12

4 A ligação entre os modificadores (ativadores ou inibidores) alostéricos e os sítios alostéricos das enzimas é reversível e é de tipo não covalente. Activador alostérico 2.2- A modificação da atividade de uma enzima pode envolver a sua modificação covalente (hidrólise irreversível ou fosforilação reversível) por ação catalítica de enzimas (normalmente outras enzimas). Certas enzimas são ativadas por hidrólise irreversível. São exemplos a ativação dos zimogénios na digestão dos nutrientes. Inibidor alostérico e o mesmo acontece nas ligações dos substratos e dos inibidores isostéricos competitivos ao sítio ativo das enzimas. Exemplo 1: O tripsinogénio é segregado pelo pâncreas. Convertese em tripsina (protéase digestiva) por ação da enteropeptídase (uma ectopeptídase presente no polo apical dos enterócitos). Tripsinogénio Enteropeptídase Exemplo 2: O pepsinogénio é segregado pelas células principais do estômago. Converte-se em pepsina (protéase digestiva) por ação hidrolítica do ph ácido do estômago e da própria pepsina que já se formou. Inibidor isostérico competitivo 13 Tripsina (ativa) + polipeptídeo inativo 14 Muitas enzimas são reguladas por mecanismos de fosforilação/desfosforilação catalisadas por enzimas (cínases e fosfátases). Forma desfosforilada (ativa) A fosfátase da desidrogénase do piruvato catalisa a desfosforilação da desidrogénase do piruvato que no estado desfosforilado fica ativa. Forma fosforilada (inativa) A cínase da desidrogénase do piruvato catalisa a fosforilação da desidrogénase do piruvato que no estado fosforilado fica inativa. A atividade da desidrogénase do piruvato depende da percentagem da enzima total que está na forma ativa (desfosforilada). O valor desta percentagem depende das atividades relativas da (1) cínase15da desidrogénase do piruvato e da (2) fosfátase da desidrogénase do piruvato. 2.2, 2.1 e 1- A controlo da atividade das enzimas pode envolver mais de um mecanismo sendo o conjunto dos mecanismos de análise complexa. O Ca 2+ entra nas fibras musculares quando estas são estimulas pelo nervo motor e um dos efeitos é a estimulação alostérica da fosfátase da desidrogénase do piruvato Ca 2+ A insulina aumenta no sangue quando a glicemia aumenta e um dos seus efeitos é reprimir o gene codificador da cínase da desidrogénase do piruvato O Ca 2+ e a insulina estimulam a oxidação do piruvato. 16

5 2.1 e 2.2- A fosforílase do glicogénio (quer hepática quer muscular) também é regulada por mecanismos de fosforilação (activadores) e desfosforilação (inibidores) induzidos pela ação de hormonas. A glicagina (no caso do fígado) e as catecolaminas (nos casos do músculo e fígado) podem desencadear uma cadeia de reações que levam à fosforilação e consequente ativação da fosforílase do glicogénio e, consequentemente, da fosforólise do glicogénio (formação de glicose-1-p). PKA= cínase de proteínas dependente do AMP cíclico A existência de ciclos de substrato (antigamente chamados de fúteis ) permite amplificar o efeito de um sinal. glicose glicose J=91; J=1; J=1-9 J=1-9 Frutose-6-P Pi Frutose-1,6-bisP CO 2 + v = 9 v = 1 J=1; J=1-9 Frutose-6-P Frutose-1,6-bisP CO 2 + O AMP ativa a glicólise muscular porque estimula a cínase da frutose-6-p. Se este aumento for de 1 vezes, o facto de esta enzima fazer parte de um ciclo de substrato 18 permite compreender que o aumento no fluxo (J) possa ser de 91 vezes. Pi v = 9 v = 1 AMP J=91; J= Também há ciclos de substrato no fígado (principal órgão da gliconeogénese). Aqui, o sentido do fluxo pode inverter-se. Após uma refeição que contenha glicídeos, a concentração intracelular de frutose-2,6-bisfosfato é alta e fica estimulada a cínase 1 da frutose-6-p (e a glicólise). No jejum, a concentração intracelular de frutose-2,6-bisfosfato é baixa e fica estimulada a frutose-1,6-bisfosfátase (e a gliconeogénese). Glicose-6-P glicose Glicose-6-P J=1 J= - 1 Frutose-6-P Frutose-6-P Pi Pi v = 2 Frutose-2,6- v = 1 v = 2 bisfosfato Frutose- 2,6- bisfosfato v = A acessibilidade aos substratos. Nas fibras musculares a entrada de glicose (e a sua subsequente metabolização) é limitada pelo número de transportadores (GLUT4) presentes na membrana sarcoplasmática. Contração muscular ou insulina Quer o exercício físico quer a insulina estimulam a entrada de glicose para as fibras musculares porque nestas condições, de forma rápida, vesículas intracelulares contendo GLUT4 fundem-se com a membrana sarcoplasmática. Frutose-1,6-bisP J=1 Fosfoenolpiruvato glicose Frutose-1,6-bisP Fosfoenolpiruvato J= Nos adipócitos o mesmo efeito é induzido pela insulina. A insulina e o exercício físico estimulam a remoção da glicose do plasma para as células. 2

6 2.1, 2.2 e 2.4- A entrada de acil-coa (ácidos gordos ativados ) para a mitocôndria (local onde ocorre a sua oxidação) depende da atividade da carnitina-acil transférase I que é inibida (inibição alostérica) pelo malonil-coa. Quando a concentração citoplasmática de malonil-coa desce a entrada de acil-coa para a mitocôndria acelera. É dentro da mitocôndria que se dá a oxidação dos ácidos gordos (oxidação em beta). Os fatores que estimulam a AMPK levam à fosforilação da carboxílase da acetil- CoA. A fosforilação inativa a carboxílase de acetil-coa o que baixa a concentração de malonil-coa. A descida do malonil-coa desinibe a carnitinapalmitil transférase I... acelerando-se a entrada de acil-coa para a mitocôndria. oxidação em β 21 oxidação em β Nas enzimas marca-passo, geralmente, o efeito direto da variação da concentração do substrato é pequeno (que mais não seja porque, in vivo, as concentrações dos metabolitos são estacionárias). Mas, em alguns casos foi possível estudar in vivo a variação da atividade de enzimas com a concentração do substrato. Num estudo de Brindle et al. (1989) estimulou-se eletricamente o nervo ciático de ratos e mediu-se, na musculatura da perna, por NMR (1) a concentração de e (2) a incorporação de Pi no (síntase do ). Baixa atividade contráctil Brindle et al. (1989) Biochemistry 28: Alta atividade contráctil 22 A entrada (GLUT2) e a fosforilação da glicose no fígado (cínase da glicose/hexocínase IV) é regulada diretamente pela concentração de glicose na veia porta e nos hepatócitos. Atividade do GLUT2 Concentrações de glicose possíveis na veia porta Atividade da Hexocínase IV Concentrações de glicose possíveis no hepatócito Quando a concentração de glicose aumenta no sangue após as refeições entra para os hepatócitos provocando a dissociação do complexo glicocínase proteína nuclear inibidora da glicocínase. Quer o GLUT 2 quer a hexocínase IV são sensíveis às variações fisiológicas da concentração de glicose 23 Embora, na maioria dos casos, as concentrações dos intermediários do metabolismo varie entre limites estreitos, nem sempre é assim. Com exceção das vesículas seminais, a frutose só existe se for ingerida e, no caso da galactose, a sua concentração é próxima de zero se não houver ingestão. Cínase da frutose Gliceraldeído Frutose Frutose-1-P Dihidroxiacetona-P as atividades da cínase da frutose e, em grande medida, a da cínase da galactose dependem da ingestão destes açúcares (ou dos seus precursores). Cínase da galactose Gliceraldeído-3-P UDP-Glicose Glicose-1-P 24

7 Estudamos até agora os mecanismos 1, 2.1, 2.2, 2.3 e 2.4. Falta referir os 3.1, 3.2 e De instalação lenta: a quantidade de enzima como a resultante das velocidades da sua síntese e da sua degradação. 2- De instalação rápida: 3- De instalação rápida mas, geralmente, com papel menos importante (pelo menos no metabolismo normal) 2.1- Controlo alostérico (AMP, Ca 2+ ) 2.2- Modificação covalente (fosforilação e desfosforilação, clivagem hidrolítica ) 2.3- Ciclos de substratos ( fúteis ) 2.4- Acesso ao substrato por regulação do transporte transmembranar (GLUT4, CPT1 ) e concentração de substrato 3.1- Inibição isostérica (competitiva) e inibição pelo produto 3.2- ph 3.3- Temperatura O produto como inibidor das enzimas marca-passo. Na reação catalisada pela desidrogénase da glicose-6-p (via das pentoses- P) a reação inversa não existe mas o NH compete com o N + pelo local de ligação deste no centro ativo (inibição isostérica e competitiva). N + NH N + NH ΔG 18 kj; Keq/QR 1 6-fosfogliconolactona NH é induzida pela insulina) a descida da concentração intracelular de NH 26 + A desidrogénase da glicose-6- fosfato é ativada sempre que a concentração intracelular de NH desce. Para além de regulada ao nível da transcrição (a desidrogénase da glicose-6-p (um dos produtos) também estimula a atividade da enzima. A PKA é uma enzima que na forma inativa tem o seu sítio ativo bloqueado pela ligação a subunidades reguladoras que contêm um domínio pseudosubstrato (inibição isostérica e competitiva). A ligação do AMP cíclico às subunidades reguladoras induz a dissociação das subunidades catalíticas que são ativas. Subunidades reguladoras AMPc Subunidades catalíticas PKA inativa (ligada e subunidades reguladoras) Domínio semelhante aos substratos AMPc Sítio ativo PPi fosfodiestérase AMP A PKA (cínase de proteínas dependente do AMPc) dissociada das unidades reguladoras é ativa e catalisa a 27 fosforilação de enzimas 3.2- Pensa-se que a variação do ph não tem, em geral, um papel importante na regulação das enzimas intracelulares mas a) No estômago o ph do suco gástrico é ácido e as enzimas deste suco têm ph ótimo ácido. b) O suco pancreático neutraliza o quimo ácido que vem do estômago (H + + HCO 3- CO 2 + ) e as enzimas do suco pancreático e as enzimas digestivas intestinais têm ph ótimo neutro. c) Pensa-se que a diminuição da oxidação dos ácidos gordos durante a glicólise anaeróbia nas fibras musculares esqueléticas se deve à diminuição de atividade da carnitina-palmitil-transférase I cuja atividade diminui quando o ph desce. ph baixo Acidificação das fibras musculares durante glicólise anaeróbia 28

8 3.3- No homem, a alteração de atividade das enzimas das células em situações de abaixamento da temperatura corporal ou de febre poderá ser importante mas não desempenha um papel relevante na regulação do metabolismo normal. As enzimas e transportadores humanos (ao contrário do que acontece com outros seres vivos) foram selecionados de forma a manterem velocidades de fluxo adequadas à vida (nas vias anabólicas e catabólicas) numa estreita gama de temperaturas. Francisco Lázaro ( ) Os órgãos para transplante são transportados a baixas temperaturas de forma a lentificar os processos catabólicos nomeadamente a hidrólise de proteínas (enzimas, transportadores, actina-miosina, etc.) 29 Estudar as enzimas in vitro (no tubo de ensaio) para quê? A) O estudo das enzimas é muito útil em análises clínicas A) O enzimas na investigação A1 - Doseamentos de enzimas plasmáticas (algumas enzimas só aparecem no plasma sanguíneo em determinadas patologias) A2 - Doseamentos de enzimas celulares (a deficiência de uma enzima pode ser diagnosticada ) A3 Uso de enzimas purificadas de bactérias ou fungos como instrumento no doseamento de substâncias (como a glicose sanguínea e múltiplas outras substâncias ) B1-O estudo das enzimas é uma importante área da investigação bioquímica. B2-As enzimas purificadas são instrumentos imprescindíveis em múltiplas outras áreas de 3 investigação. Quando se quer quantificar a atividade de uma enzima adicionamos num tubo de ensaio a enzima ao(s) substrato(s) e vamos observando ao longo do tempo como evolui a reação. Produto (micromoles) 2 1,5 1,5 Acumulação de produto versus tempo 1/min,5/min tempo (min),1/min O normal é que (por motivos vários) a reação se vá lentificando. Quando se atingir o equilíbrio químico ou se esgotar o substrato a velocidade será zero.... mas atividade enzímica = velocidade da reação enzímica 31 Produto (micromoles) 3 2 Acumulação de produto versus tempo 1 Atividade azul (v ou ) = 1 μmole / min Tempo (min) Admitamos que fizemos dois ensaios idênticos mas com duas amostras diferentes da mesma enzima E: amostra azul amostra vermelha Em qual das amostras a enzima E tinha maior atividade? Como podemos exprimir quantitativamente a atividade da enzima E na amostra azul? Se respondêssemos: atividade = 3 μmoles/5 min =,6 μmoles/min... estaríamos a falar da velocidade média nos 5 min de ensaio e a dizer que nas duas amostras a atividade era igual. Para a concentração de substrato em que o ensaio se iniciou a velocidade será o declive da curva produto formado versus tempo no tempo zero (v ou ) mas poderemos considerar que, pelo menos no caso do ensaio azul, uma boa estimativa 32 de v pode ser a velocidade média no primeiro minuto de ensaio (1 μmole/min).

9 Em teoria a atividade de uma enzima (num sistema de ensaio especificado e adequado) define-se como o aumento de velocidade de conversão (S P) induzido pela enzima: Atividade = = vel. na presença de enzima vel. na sua ausência ph=1 incubar substrato na presença de Fosf Alc. durante um tempo t ph=1 incubar substrato na ausência de Fosf Alc. durante um tempo t NaOH NaOH ph=12; ph onde a Fosfátase Alcalina para de funcionar ph=12 ler Absorvância no ensaio enzímico ler Absorvância no ensaio a branco A realização de ensaios a branco (sem enzima) permite prevenir a eventualidade de ocorrer reação não enzímica. Ao subtrair o branco... também se subtrai o produto que eventualmente 33 se tenha formado na ausência de enzima (ou que esteja presente como contaminante do substrato). Como variará se duplicarmos (ou triplicarmos...) a quantidade de enzima num ensaio enzímico? A atividade enzímica ( ou uma boa estimativa de ) num meio especificado e adequado é proporcional à quantidade de enzima ( desde que a concentração molar de enzima seja muito inferior à do substrato). v inicial kcat = Km + Etotal se fizermos ensaios nas mesmas condições (temperatura, ph, etc.) k cat e Km são constantes; se também usarmos a mesma concentração de substrato [S] este fator é constante v = const. inicial E total 34 Produto (micromoles) Qual a quantidade de enzima E no ensaio vermelho? Acumulação de produto versus tempo Tempo (min) UI (unidade internacional) = quantidade de enzima que catalisa a conversão de 1 μmol de substrato em produto / min Embora, pelo menos teoricamente, a quantidade de uma enzima possa ser medida em moles ou em gramas, é mais frequente medir a quantidade de enzima como uma velocidade de reação; a velocidade da reação catalisada pela enzima 35em análise (idealmente no tempo zero; ). Admitindo que 1) a enzima E catalisa a reação X Y 2) o tubo de ensaio A continha 1 ml de solução 3) no tempo zero se adicionou 1 μl de soro 4)... e se foi medindo a quantidade X ao longo do tempo Qual a atividade da enzima E no soro em análise? 1) No tubo A nos primeiros 1 min a concentração de X passou de 1 para 9 mm = diminuiu 1 mm (ou 1 μm) 2) 1 μm *,1 L = 1 μmoles de X convertido em Y 3) 1 μmol de X/ 1 min = 1 μmol / min 4) 1 UI / μl soro Notar que no tubo B se adicionou um volume diferente do mesmo soro. Porque a velocidade de reação observada em B era metade da observada em A quer dizer que em B havia metade do número de moles da enzima E. Ou seja, em B o volume de soro era,5 μl. 36

10 Quando se doseiam enzimas numa preparação que a contém (usando a atividade como medida da quantidade de enzima) pressupõe-se que a atividade ( ) é proporcional à quantidade de enzima. Pâncreas inflamado liberta amílase para o sangue Em química clínica doseiam-se com frequência enzimas no soro (por exemplo a amílase do soro em situações em que se suspeita de pancreatite aguda) exprimindo o resultado do ensaio enzimático em velocidade de reação / volume de soro sanguíneo A atividade enzímica aumenta se o número de moléculas de enzima aumentar (e vice-versa). O doseamento de uma enzima em tecidos pode servir para estudar o efeito de hormonas na síntese dessa enzima. A insulina inibe a expressão de genes que codificam enzimas envolvidas na produção de glicose como, por exemplo, o gene da glicose-6-fosfátase. Glicose-6-P Porque as condições de ensaio (concentração e natureza dos substratos, ph, natureza do tampão, temperatura, etc.) podem não ser iguais em dois laboratórios distintos os valores normais de um laboratório podem não ser iguais aos de outro laboratório. 1 mol de glicose é 1 mol de glicose em qualquer sítio do mundo mas 1 UI de amílase (ou outra enzima qualquer) em dois laboratórios 37 distintos pode significar diferentes quantidades de enzima. o número de moléculas de glicose-6-38 fosfátase aumenta pela razão oposta. Glicose-6- fosfátase no fígado Voice et al. (1992) BST 2:272S Quando há muita insulina o número de moléculas de glicose-6-fosfátase diminui porque diminui a transcrição do seu gene. Quando há pouca insulina Porquê expressar atividade em UI / massa de tecido (ou UI / mg de proteína)? Permite comparar dois ensaios enzímicos em que se usam quantidades de enzima distintas... 2 mg de fígado Homogeneizado de fígado 1 mg de fígado Quando se doseia uma enzima necessitamos de um meio de ensaio que contém obrigatoriamente o substrato (ou substratos) da enzima...mas em diferentes laboratórios podem usar-se diferentes temperaturas de ensaio. 2ºC 7ºC Aumentar a temperatura aumenta a velocidade das reações incluindo a velocidade de desnaturação das enzimas. 2 μmol/min = 2UI 2 μmol / 2min = 1UI 2 UI 2 mg de fígado 1 UI 1 mg de fígado Atividade = 1 UI / mg de fígado Atividade = 1 UI / mg de fígado 39 O exemplo da figura indica que se se pretendesse dosear a enzima em questão poderia ser 4mais cómodo escolher para temperatura de ensaio 3ºC...

11 Para dosear uma enzima, para além da temperatura, também se escolhem outras condições de ensaio como, por exemplo, o ph do meio de ensaio. Quando doseamos uma enzima costuma escolher-se para ph de ensaio um valor próximo do ph ótimo dessa enzima. Se numa amostra de tecido existirem duas enzimas que catalisem a mesma reação mas essas enzimas tiverem phs ótimos distintos posso, escolhendo o ph de ensaio, estudar uma ou outra dessas enzimas. ph 7 favorece isoenzima vermelha ph 1 favorece isoenzima azul 41 Para dosear uma enzima, para além da temperatura e do ph, também se escolhe a concentração do substrato. Eventualmente podemos fazer vários ensaios usando diferentes concentrações do substrato. Considerar apenas um substrato é uma simplificação (estritamente só as isomérases têm um substrato)...mas podem fixar-se as concentrações dos outros substratos e estudar-se como varia a atividade ( )... em função da variação da concentração de um deles. 42 A atividade de uma enzima aumenta com a concentração de substrato......mas para concentrações altas (saturantes) aumentar a concentração de substrato praticamente não afeta a atividade. = k cat A atividade é proporcional à quantidade de complexo E S no meio de ensaio (k cat é a constante de proporcionalidade) Para diferentes enzimas o aspeto do gráfico atividade versus [S]... pode ser hiperbólico ou sigmoide... mas a característica saturabilidade está sempre presente. 43 Num grande número de enzimas o gráfico versus [S] tem o aspeto de uma hipérbole que se ajusta à equação de Michaelis-Menten V = max Km + As enzimas com cinéticas de tipo hiperbólico são aquelas em que o gráfico versus [S] pode ser ajustado a uma equação do tipo V = max Km +... sendo que Vmax e Km são constantes (...se a única condição de ensaio que varia é [S]) 44

12 Numa reação enzímica existe um ciclo catalítico em que da ligação entre a enzima livre e o substrato resulta a formação do complexo E S; o complexo E S pode dissociar-se mas também vai formando produto e regenerando enzima livre. Num ensaio enzímico enquanto a concentração de substrato não baixar de forma significativa a concentração do complexo E S vai-se mantendo numa concentração estacionária. O valor da concentração estacionária de E S depende (1) da concentração de enzima, (2) da concentração de substrato e (3) da afinidade entre a enzima e o seu substrato. k cat A velocidade de formação do produto é proporcional à concentração do complexo E S (μm/min) = k cat [E S] (μmol/min) = 45 k cat [E S] vol. meio de ensaio Atividade ou v ou = k cat [E S] = k cat [Etotal]/2 = Vmax/2 Se não há substrato [E S] = V inicial = Existe uma concentração de substrato (= Km) em que metade das moléculas de enzima estão ligadas ao substrato (enzima hemisaturada) [E S] = [E] [E S] = [Etotal]/2 concentração de substrato = Km Se a concentração de substrato é elevada quase todas as moléculas de enzima estão ligadas ao substrato [E S] [Etotal] k cat [Etotal] Vmax concentração de substrato é saturante 46 Se [S] < K m é quase proporcional a [S]...e menos de metade das moléculas de enzima estão ligadas ao substrato A atividade enzímica para concentração saturante de substrato = V max... se a concentração de substrato é elevada variações moderadas na concentração do substrato não afetam a atividade para dosear enzimas é frequente usarem-se concentrações elevadas de substrato porque o gráfico produto formado versus tempo se mantém linear durante mais tempo. Se [S] = K m = V max / 2...e a enzima está hemisaturada 47 A partir da equação v V Km + max =...pode deduzir-se o valor de v para determinadas concentrações de substrato. v Km >> V Km + max = v [S]... se Km>>[S] denominador Km [S] = Km Km << [S] V v = Vmax v = [ max S] + Km +... se Km<<[S] denominador [S] Vmax S v = v = Vmax v = [ ] = Vmax 2 Km v é diretamente proporcional a [S] para baixas concentrações de S... se Km=[S] denominador =2 [S] V v = 2 max V max v não é afetado por 48[S] para altas concentrações de S

13 O Km é uma medida da afinidade da enzima para o seu substrato...quando maior o valor do Km menor a afinidade (e vice-versa). Km A enzima azul precisa de uma concentração de substrato menor para ficar hemisaturada......porque tem maior afinidade para o substrato que a enzima cinzenta. Em ambos os casos a enzima está hemisaturada mas Km (no caso da enzima azul) < Km (no caso da enzima cinzenta) Brincando: o Km mede o desamor entre a enzima e o seu substrato Km 49 O Km mede a afinidade da enzima para o seu substrato...quando maior o valor do Km menor a afinidade. A enzima azul já está hemisaturada ([E S]=[Et]/2) quando [S]= 3 mm (Km = 3 mm) tem alta afinidade para o substrato Vmax1=Vmax2 (mm) A enzima cinzenta está hemisaturada ([E S]=[Et]/2) quando [S]= 1 mm (Km = 1 mm) tem baixa afinidade para o substrato 5 Quando se estuda o efeito da concentração de substrato na atividade de algumas enzimas e se representa versus [S] o gráfico pode ser não uma hipérbole mas um sigmoide. As teorias atualmente mais aceites para interpretar este tipo de comportamento cinético surgiram na década de 6 e visavam interpretar um fenómeno semelhante: a forma sigmoide do gráfico de saturação da hemoglobina. Essas teorias revelaram-se adequadas para interpretar as cinéticas de tipo sigmoide em enzimas com mais de um local de ligação ao substrato por molécula de enzima (enzimas poliméricas). v V = S max h 5 + h h ; h = coeficiente de Hill 51 Quando o gráfico velocidade de reação (ou velocidade de transporte transmembranar) versus concentração de reagente (ou substância transportada) é uma reta indica-nos que o processo reativo (ou de transporte) é não enzímico (ou não mediado). Velocidade de reação ou transporte transmembranar Processo não catalisado; saturabilidade ausente Concentrações de glicose possíveis no hepatócito A comparação entre o valor do Km (ou S 5 ) e a concentração estacionária (in vivo) do substrato numa enzima (ou num transportador) diz-nos se a enzima (ou o transportador) 52 é ou não sensível a variações fisiológicas na concentração de substrato. Processos reativos (ou de transporte) catalisados por enzimas (ou transportadores); saturabilidade presente

14 A atividade das enzimas pode ser diminuída ou aumentada pela adição ao sistema de ensaio de modificadores da atividade enzímica (inibidores e activadores). Adicionando a um meio de ensaio uma substância M (inibidor ou activador) e mantendo constantes todas as outras condições de ensaio podemos obter diminuição (inibição) ou aumento (ativação) da atividade enzímica. na ausência de inibidor = 1 UI Δ = 3 UI Grau de inibição = 3% Actividade enzímica Grau de inibição ou grau de ativação = v inicial } Δ v o +inibidor Δ v o{ Δvinicial na ausência de M +activador 53 Um estudo mais aprofundado do efeito de um inibidor na atividade duma enzima pode revelar que ele aumenta o K m do substrato sem modificar V max. Quando se estuda a atividade enzímica para vários valores de [S] podemos, multiplicando o número de tubos de ensaios, fazer esse estudo: na ausência e na presença de um inibidor I. Algumas vezes observa-se que: 1- Na presença do inibidor o valor de V max não se modifica; para concentrações de substrato elevadas o inibidor I não tem efeito. 2-O valor do K m observado é maior na presença de I que na sua ausência; o grau de inibição é mais marcado para concentrações de substrato baixas. Nestes casos falamos de inibição competitiva Para [S] = 4 grau inibição = 14 % Para [S] = saturante grau inibição = % Para [S] = 4 grau inibição =5% 54 Para explicar o comportamento deste sistema (I aumento do K m mas I não afeta V max ) poderemos admitir que o inibidor I e o substrato S se ligam no centro ativo da enzima competindo entre si. As possibilidades do modelo apresentado corresponderem à realidade são reforçadas se as estruturas moleculares do substrato e do inibidor forem semelhantes. Nestes casos há inibição isostérica competitiva Quando um inibidor isostérico competitivo está presente, para obter hemisaturação da enzima com substrato, preciso de ter maior concentração do substrato; a presença do inibidor aumenta o Km. A fosfátase alcalina catalisa a hidrólise do para-nitrofenilfosfato: para-nitrofenilfosfato + para-nitrofenol + Pi O vanadato é um inibidor competitivo 55 da fosfátase alcalina. Na ausência de inibidor esta concentração de substrato permitia hemisaturação. O Km era 9. Mas na presença do inibidor para esta concentração de substrato só 1/6 das moléculas de enzima estão ligadas ao substrato. Na presença do inibidor competitivo preciso de aumentar a concentração de substrato para 32 para obter hemisaturação com o substrato. Na presença do inibidor 56 o Km (que era 9) aumentou para 32.

15 O vanadato é um inibidor competitivo da fosfátase alcalina = eleva o Km do para-nitrofenilfosfato mas não tem efeito no Vmax. Se a concentração de substrato for suficientemente alta compete eficazmente como o inibidor. Vmax Vmax/2 Km (sem vanadato) =1,1 mm Km (com vanadato) =7,6 mm Seargeant & Stinson (1979) Biochem J. 181: 247. sem vanadato vanadato 2,5 μm Quando adicionado a meios de ensaio que contenham para-nitrofenilfosfato e fosfátase alcalina, o vanadato (HVO 4 2- ), inibe a atividade da enzima quando a concentração de para-nitrofenilfosfato não é saturante 57 = a inibição é de tipo competitivo. Dizer que a inibição é de tipo competitivo significa afirmar que, na presença do inibidor, o Km do substrato aumenta não sendo o Vmax afetado e não significa obrigatoriamente que o inibidor seja um análogo do substrato e se ligue no centro ativo. A proteína inibidora da hexocínase IV é um inibidor competitivo relativamente à glicose. Admite-se que a proteína inibidora se liga a um centro alostérico da enzima e que a conformação ligada tenha baixa afinidade para a glicose Conformação de alta afinidade = Km da glicose Inibidor alostérico Conformação de baixa afinidade = Km da glicose Vandercammen e Shaftingen (1991) Competitive inhibition of liver glucokinase by its regulatory protein, EJB, 2: 545. kcat1 kcat1 = kcat2 Vmax invariante kcat2 58 Quando se estuda o efeito de um inibidor para diferentes concentrações de substrato podemos, eventualmente, observar que a inibição não é de tipo competitivo. Algumas vezes observa-se que: 1- O V max é menor na presença de I que na sua ausência. 2- Na presença de I o K m não se modifica; a concentração de substrato para a qual se observa um valor de atividade que é metade de V max (ou de V max ) é igual na presença e na ausência de I. Um modelo possível para explicar a inibição de tipo não competitivo é admitir a existência na enzima de um local de ligação diferente do centro ativo (um sítio alostérico) cuja ligação ao inibidor impedisse a formação do produto. Km1 Km1= Km2 Km2 kcat1 kcat2 = 3-O grau de inibição é independente da concentração de substrato. No exemplo o grau de inibição = 4% para todas as concentrações de substrato Nestes casos diz-se que a inibição é não competitiva. 59 De acordo com o modelo (garantindo Km invariante) a afinidade entre a enzima e o substrato é igual nos casos da forma ligada e desligada do inibidor. De acordo com este modelo tudo se passaria como se as moléculas de enzima ligadas ao inibidor estivessem excluídas do processo catalítico, isto é, como se houvesse menos moléculas de enzima no meio de ensaio. 6

16 Um ligando diferente do substrato que se liga ao centro ativo é um inibidor isostérico (se se liga no centro ativo só pode inibir). Se a ligação entre um inibidor isostérico e o centro ativo for reversível (se poder se deslocado pelo substrato) esse inibidor comporta-se funcionalmente como inibidor competitivo... mas se a ligação do inibidor ao sítio ativo for irreversível (não podendo ser deslocado por altas concentrações de substrato) as moléculas de enzima ligadas ao inibidor ficam excluídas do processo catalítico. A lípase pancreática catalisa a hidrólise de triacilgliceróis no intestino. No tratamento da obesidade pode usar-se um fármaco (orlistat; xenical) que é um inativador (= inibidor irreversível) da lípase pancreática. Neste caso o inibidor comporta-se funcionalmente como não competitivo e é, frequentemente, O orlistat reage com uma serina (formando uma ligação covalente e irreversível) situada no centro ativo da enzima usado o termo inativador bloqueando a sua atividade. No estudo in vitro de enzimas reguladas por fosforilação/desfosforilação podem usar-se inibidores das cínases e das fosfátases envolvidas. O doseamento da atividade da desidrogénase do piruvato pode ser feito em homogeneizados. Se o homogeneizado é preparado na presença de inibidores quer da cínase (dicloroacetato) quer da fosfátase (fluoreto)...quando se faz o ensaio mede-se a atividade efetiva ( atual ). Se o homogeneizado é preparado na presença do inibidor da cínase (dicloroacetato) mas na ausência de fluoreto...quando se faz o ensaio mede-se a atividade total. Na ausência de inibidor (fluoreto), a fosfátase do tecido transforma toda a desidrogénase do piruvato na sua forma ativa. Pi P 63 Bibliografia utilizada: 1. Rakus, D., Maciaszczyk, E., Wawrzycka, D., Ulaszewski, S., Eschrich, K. & Dzugaj, A. (25) The origin of the high sensitivity of muscle fructose 1,6-bisphosphatase towards AMP, FEBS Lett. 579, Sugden, M. C. & Holness, M. J. (26) Mechanisms underlying regulation of the expression and activities of the mammalian pyruvate dehydrogenase kinases, Arch Physiol Biochem. 112, Veiga-da-Cunha, M., Courtois, S., Michel, A., Gosselain, E. & Van Schaftingen, E. (1996) Amino acid conservation in animal glucokinases. Identification of residues implicated in the interaction with the regulatory protein, J Biol Chem. 271, Jeukendrup, A. E. (22) Regulation of fat metabolism in skeletal muscle, Ann N Y Acad Sci. 967, Sterk, J. P., Stanley, W. C., Hoppel, C. L. & Kerner, J. (23) A radiochemical pyruvate dehydrogenase assay: activity in heart, Anal Biochem. 313, Voet, D. & Voet, J. G. (24) Biochemistry, 3rd edn, John Wiley and Sons, Inc., USA. 7. Nelson, D. L. & Cox, M. M. (25) Lenhinger principles of biochemistry, 4ª edn, New York. 8. Thorens, B. (1996) Glucose transporters in the regulation of intestinal, renal, and 64 liver glucose fluxes, Am J Physiol. 27, G