Conceitos de cinética enzimática e modelos clássicos de inibição enzimática

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1 Conceitos de cinética enzimática e modelos clássicos de inibição enzimática Índice 1 Conceitos básicos de cinética química Natureza química das enzimas e modelos de interação com os seus substratos O que é a cinética enzímica? Como fazer um estudo cinético de uma enzima? Que resultados podem ser obtidos no estudo cinético de uma enzima? Noção de atividade enzímica ou atividade catalítica de uma enzima Noção de v 0 ou velocidade inicial Influência da quantidade de enzima na velocidade de conversão v Influência da temperatura na atividade enzímica Influência do ph Influência da concentração dos substratos na atividade enzímica e saturabilidade Influência da concentração do substrato em enzimas com cinética de tipo michaeliano ou hiperbólico Significado da constante de Michaelis-Menten Influência da concentração de substrato em enzimas com cinética de tipo cooperativo ou sigmoide A atividade enzímica molar Modificadores da atividade enzímica: inibidores e ativadores Inibidores competitivos a As estatinas competem eficazmente com o hidrometilglutaril-coa (HMG-CoA) na sua ligação à redútase de HMG-CoA e são medicamentos usados para fazer descer a concentração de colesterol plasmático Inibidores não competitivos Inibição mista Inibidores que reagem com a enzima de forma covalente e irreversível a O orlistato é um inativador das lípases digestivas Efeitos alostéricos Efeitos induzidos por modificação covalente de enzimas catalisada por outras enzimas Para que pode servir o estudo cinético de uma enzima? Bibliografia Bibliografia geral Referências específicas Conceitos básicos de cinética química. Quando se diz que uma determinada reação tem tendência termodinâmica para ocorrer num determinado sentido não se quer dizer com isso que ela ocorra de facto a uma velocidade apreciável num intervalo de tempo determinado. A velocidade a que ocorre uma determinada reação depende de vários fatores como a natureza dos reagentes e a sua concentração, a temperatura, e nalguns casos da presença de radiações e de catalisadores. As reações químicas elementares de 1ª ordem obedecem à lei de velocidade expressa pela Equação 1: Equação 1 =k [A] Se numa reação A B, a velocidade de reação é proporcional à concentração do reagente A e k é a constante de proporcionalidade a reação diz-se de 1ª ordem em relação a A; porque relaciona a concentração de um reagente com a velocidade da sua conversão em produtos diz-se que k é uma constante cinética. Pode acontecer que uma determinada reação (A + B P +...) seja elementar e de 1ª ordem em relação a cada um de dois reagentes A e B, sendo globalmente de 2ª ordem: Página 1 de 26

2 Equação 2 = k [A] [B] Os valores de k e k 1 (constantes cinéticas) são independentes da concentração dos reagentes mas variam com a natureza destes e com a temperatura, aumentando quando esta aumenta. Atentemos no esquema que se apresenta a seguir: A + B k 1 k 2 P + Q Fig. 1: Esquema de uma reação admitindo que é elementar de 2ª ordem quer no sentido direto quer no sentido inverso. Se a transformação de A + B em P + Q é uma reação química elementar o valor da velocidade de reação que podemos observar experimentalmente na ausência de P e Q é igual a k 1 [A] [B]. Se a reação inversa também é uma reação química elementar então, na ausência de A e de B, a velocidade que se pode observar experimentalmente nesta reação é igual a k 2 [P] [Q]. Qualquer que seja a concentração de A, B, P e Q a velocidade de formação de P (= velocidade de formação de Q = velocidade de consumo de A ou de consumo de B) que podemos observar experimentalmente, sem recurso a compostos marcados (radioactivamente, por exemplo) é dada pela Equação 3: Equação 3 v aparente = k 1 [A] [B] - k 2 [P] [Q] De notar que, a nível molecular, a velocidade a que ocorrem as reações elementares não é influenciada pela presença de produtos e este facto pode ser comprovado experimentalmente usando compostos marcados radioactivamente. A Equação 3 permite-nos relacionar a K eq com as constantes k 1 e k 2. O sistema está em equilíbrio quando as propriedades macroscópicas do sistema se mantêm constantes no tempo, ou seja, quando v aparente = 0. Donde: Equação 4 = [P] ( ) [Q] ( ) [A] ( ) [B] ( ) = k 1 k 2 Deve notar-se que conhecer o valor da K eq não nos diz nada acerca do valor absoluto das constantes k 1 e k 2. Se, por exemplo, na reação em análise o valor de K eq for 1 a única informação que este valor indica é que k 1 = k 2. Assim, se não nos estivermos a referir à conversão líquida de reagentes em produtos, podemos dizer, sem contradição, que uma reação se está a processar muito rapidamente (ou muito lentamente) e que se encontra no estado de equilíbrio. A maioria das reações químicas e todas as reações em que intervêm catalisadores são reações complexas e podem tentar interpretar-se como uma sequência de reações elementares em que ocorre a formação de estados de transição e compostos intermediários que não chegam a atingir no meio reativo uma concentração apreciável por métodos correntes de análise. Na presença de um catalisador a velocidade das reações aumenta. Do ponto de vista de alguém que está interessado no mecanismo das reações químicas, o catalisador é um novo reagente que foi adicionado no meio reativo e que tem a característica especial de ser regenerado no final do ciclo reativo em que intervém. A sua concentração total não varia durante o processo reativo. Admitamos que a reação de transformação de A em P+Q é, na ausência de catalisador, uma reação elementar de primeira ordem e que v (sem catalisador) = k 1 [A]. A k 1 P + Q Fig. 2: Esquema em que se admite que é elementar de 1ª ordem relativamente ao reagente A Página 2 de 26

3 Admitamos que, na presença de catalisador, o mecanismo reativo é diferente. Cada vez que uma molécula de A se encontra com uma molécula de catalisador C elas reagem para gerar um complexo ativado A C e que este complexo se pode dissociar em C + P + Q. Nas reações elementares, as constantes de velocidade que lhes estão associadas dependem da natureza dos reagentes e, portanto, as constantes de velocidade associadas ao processo de formação de A C e ao processo de dissociação deste complexo em P + Q + C podem ser muito maiores que o valor de k 1. No entanto a presença do catalisador não altera a K eq da reação. A Equação 5 exprime a K eq (K eq 1) para a reação esquematizada na Fig. 2. Equação 5 1= [P] ( )[Q] ( ) [ ] ( ) Admitindo que o catalisador C é um reagente temos também de admitir que é um produto (ver Fig. 3). Neste caso é a Equação 6 que exprime o valor da K eq (K eq 2) para a reação que é catalisada. A + C P + Q + C Fig. 3: Esquema em que se admite que a conversão de A em P + Q é catalisada pelo catalisador C. Equação 6 2= [P] ( )[Q] ( ) [C] [ ] ( ) [C] É, imediato reconhecer que K eq 1 = K eq 2 = K eq. Os catalisadores modificam a velocidade das reações mas não modificam o valor da constante de equilíbrio nem o sentido líquido em que a reação, macroscopicamente, vai ocorrer e que pode ser previsto pela relação K eq /Q R. Se a constante de equilíbrio não for demasiado alta impedindo-nos de observar a reação inversa (síntese de A a partir de P+Q) podemos constatar que esta reação também é catalisada pelo mesmo catalisador C. 2 Natureza química das enzimas e modelos de interação com os seus substratos. As enzimas são os catalisadores que existem nos seres vivos. A palavra enzima (do Grego: en, na + zima, levedura) foi inventada em 1878 por Fredrich Wilhelm Kühne e traduz a ideia de que são substâncias que existem dentro das células (as leveduras são seres vivos). A natureza proteica das enzimas só foi definitivamente aceite nos anos 30 deste século, na sequência dos trabalhos de James Summer (que purificou e cristalizou a urease do feijão) e de John Northrop e Moses Kunitz (que demonstraram correlação direta entre a atividade catalítica de preparações purificadas de enzimas digestivas e o seu conteúdo proteico). Curiosamente, estudos da década de 80 de Thomas Cech num protozoário (Tetrahymena thermophila) e de Sidney Altman em E. coli demonstraram atividade catalítica em certas moléculas de RNA. Daqui surgiu o termo ribozimas : catalisadores biológicos de natureza não proteica, mas sim ácidos ribonucleicos. Tal como acontece com todos os catalisadores quando se diz que uma enzima E catalisa a transformação A P está-se implicitamente a dizer que também catalisa a transformação inversa; a reação vai progredir macroscopicamente no sentido A P ou no sentido P A dependendo da relação K eq /Q R. Numa reação enzímica chamam-se aos reagentes substratos da enzima. Relativamente aos catalisadores não enzímicos, as enzimas são em geral mais potentes, atuam em condições pouco agressivas (ph próximo da neutralidade, temperatura ambiente, etc.), têm uma enorme especificidade, quer em relação aos substratos, quer em relação aos produtos da reação que catalisam e as suas atividades podem, frequentemente, ser reguladas por substâncias diferentes dos substratos e dos produtos. Sendo a sua natureza proteica significa que sofrem desnaturação (a sua estrutura secundária, terciária ou quaternária modifica-se dramaticamente ou deixa mesmo de existir) quando são misturadas com ácidos fortes ou Página 3 de 26

4 quando são aquecidas. Nalguns casos, a desnaturação também pode ser provocada pela adição de solventes orgânicos. Uma vez desnaturada, a atividade de uma enzima desaparece irreversivelmente. Sendo as enzimas moléculas proteicas o seu tamanho é, normalmente, muito maior que o das moléculas dos substratos. Este facto, assim como a enorme especificidade das enzimas relativamente aos substratos com que podem interagir, levaram à introdução do conceito de sítio ativo (ou sítio catalítico ), um local específico modelado de tal forma que permite a interação específica com o substrato ou substratos e onde ocorre a reação química. Mesmo quando o substrato é uma outra proteína e não se pode dizer que a enzima seja maior que o substrato, o local da proteína alvo onde a transformação ocorre é limitado e vai depender da interação do centro ativo da enzima com uma região específica da proteína alvo. Fig. 4 Modelos de chave-fechadura e de encaixe induzido para a interação enzima-substrato. O primeiro modelo (chave-fechadura) surgiu para explicar a alta especificidade das enzimas em relação aos substratos nomeadamente a sua interação com apenas um dos enantiómero. O segundo modelo (encaixe induzido) surgiu da necessidade de explicar certos casos de inibição competitiva (ver Capítulo 6.1). Em algumas enzimas estudos de difração de raios X apoiam o segundo modelo (por exemplo, no caso da transcarbamílase do aspartato). Em 1894, Emil Fisher descobriu que as enzimas da via glicolítica podem distinguir enantiómeros (formas D de L) e esse facto levou-o a propor uma analogia com a chave e a fechadura como modelo de interação entre as enzimas e os seus substratos. Este modelo admite a existência de locais preformados na enzima onde os substratos se podem ligar e reagir. Koshland, em 1959, propôs um modelo diferente a que podemos chamar de encaixe induzido ; quando os substratos interagem com a enzima provocam nestas modificações conformacionais que ocorrem não só no sítio catalítico mas também se podem repercutir em toda a estrutura da proteína (ver Fig. 4). 3 O que é a cinética enzímica? A cinética enzímica é um ramo da Bioquímica que estuda as enzimas em ação; a sua atividade catalítica. No entanto, pode também ser encarada como um ramo da cinética química que estuda as propriedades catalíticas das enzimas. O estudo cinético de uma enzima visa primariamente caracterizar, ou seja descrever, a atividade dessa enzima. In vitro estuda-se a atividade da enzima procurando saber que tipo de reações pode catalisar, com que substratos pode interatuar e como se modifica essa atividade (qualitativa e/ou quantitativamente) quando se fazem variar as condições em que é ensaiada. O valor de ph, a temperatura, o tempo de incubação, as concentrações dos substratos, de cofactores ou de outras substâncias (inibidores ou ativadores) são exemplos de condições de ensaio que podem ser modificadas com o objetivo de observar como varia a atividade da enzima, ou seja, como varia a velocidade da conversão ou conversões que esta catalisa. Página 4 de 26

5 4 Como fazer um estudo cinético de uma enzima? O estudo cinético de uma enzima é feito in vitro. Para esses estudos podem ser usados, como fontes de enzima, preparações que a contenham em estado mais ou menos purificado; quanto mais purificada estiver a preparação enzímica mais fácil será o seu estudo cinético. De acordo com os objetivos definidos não devem estar presentes na preparação, outras enzimas que interfiram no estudo que estamos a fazer. Durante o complexo processo de purificação podem ocorrer alterações nas características cinéticas da enzima de tal forma que as características observadas podem não ser as mesmas da enzima no seu estado nativo; além disso, as condições que usamos in vitro para estudar a enzima são diferentes daquelas que a enzima tem no seu meio natural, a célula. Se o objetivo dos estudos visa compreender o papel da enzima na célula os resultados experimentais devem ser interpretados com especial prudência. Estes estudos podem servir de guia para planear e interpretar experiências realizadas em condições menos artificiais. Quando uma atividade enzímica é estudada escolhe-se um meio de ensaio apropriado para o seu estudo; o objetivo pode ser estudar como varia a atividade catalítica da enzima quando modificamos as características desse meio, mas numa fase precoce do estudo é necessário buscar condições que permitam, no mínimo, reconhecer a existência dessa atividade. Se a enzima catalisa a transformação reversível A + B P + Q e a constante de equilíbrio é muito superior à unidade, as dificuldades do estudo podem ser minimizadas se escolhermos estudar a transformação de A + B em P + Q e não o inverso. Assim, se for esse o caso, adicionaríamos no meio de ensaio os compostos A e B. Um tampão de ph com um ph determinado, assim como outras substâncias como, por exemplo, cofactores essenciais à atividade da enzima estão, em geral, também presentes no meio de ensaio. O meio de ensaio está a uma temperatura determinada e a reação pode ser iniciada adicionando ao meio a preparação que contém a enzima. Para determinar a velocidade de conversão de A+B em P+Q é indispensável termos uma maneira de seguir (de modo contínuo ou descontínuo) como cresce a concentração de P ou de Q (ou desce a concentração de A ou de B) em função do tempo. 5 Que resultados podem ser obtidos no estudo cinético de uma enzima? 5.1 Noção de atividade enzímica ou atividade catalítica de uma enzima. A atividade enzímica é uma propriedade medida pelo aumento de velocidade de conversão de uma reação química que uma enzima produz num sistema de ensaio especificado. Admitamos que a reação A + B P + Q é catalisada por uma determinada enzima. Num meio de ensaio onde foram introduzidos os compostos A e B, a velocidade de conversão dos reagentes em produtos (v 1 ) poderá não ser nula na ausência de enzima. Se a reação é catalisada pela enzima a velocidade de conversão na presença desta pode ser v 2. A quantidade (v 2 - v 1 ) é uma medida da atividade catalítica presente na preparação enzímica adicionada ao meio de ensaio. É frequente que a velocidade de conversão na ausência de enzima (o valor de v 1 ) seja tão pequeno comparado com v 2 que, sem grande erro, se possa considerar v 2 como correspondendo ao valor da atividade catalítica da enzima. É importante referir que e a atividade enzímica (a velocidade de conversão na presença da enzima) é uma quantidade extensiva e que, portanto, as suas dimensões são quantidade de substância/tempo (n/t). Se a adição de 1 μl de uma dada preparação (soro sanguíneo, por exemplo) que contém uma enzima a um meio de ensaio com 999 μl fizer com que a velocidade de conversão seja de 1 μmol de produto formado/min a atividade da enzima presente na preparação (1 μl de soro, no exemplo) usada era de 1 μmol/min. Obviamente que, no caso em análise, a velocidade da reação no tubo onde decorreu o ensaio também se pode expressar como a velocidade da variação de concentração do produto; seria 1 μmol ml -1 min -1. Embora as expressões velocidade de reação (variação de uma concentração por unidade de tempo) e velocidade de conversão (variação da quantidade de substância por unidade de tempo) sejam, frequentemente, usadas como sinónimos existe uma diferença entre elas e só a segunda, corresponde, estritamente, à definição de atividade enzímica. Dado que a quantidade de substância que se forma Página 5 de 26

6 num dado volume de meio de ensaio pode ser calculada a partir desse volume e da variação de concentração, a conversão de velocidades de reação em velocidades de conversão é uma operação aritmética trivial. A atividade enzímica de um dado volume de preparação enzímica é expresso como uma velocidade de conversão e pode ser expresso em UI (Unidade Internacional). 1 UI é a quantidade de enzima que, num meio de ensaio adequado, leva a que a reação ocorra à velocidade de 1 μmol de produto formado por minuto (ou 1 μmol de substrato consumido por minuto). No exemplo acima a quantidade de enzima adicionada ao meio de ensaio foi de 1 μmol min -1 ou 1 UI. Estritamente, a quantidade de enzima deveria referir-se à massa ou ao número de moles de enzima mas, por razões que resultam do facto de, só excecionalmente, se conhecerem estes valores e porque a atividade é proporcional à quantidade de enzima (ver Capítulo 5.3), é muito mais usual exprimir a quantidade de enzima usando unidades de atividade. Se a velocidade de conversão induzida pela adição de 1 ml de uma preparação enzímica a um meio de ensaio adequado, é de 1μmol/min, é frequente escrever-se que a quantidade de enzima presente nesse ml de preparação era de 1 UI; ou seja, que a atividade da enzima era 1 μmol/min. 5.2 Noção de v 0 ou velocidade inicial. Quando se faz uma experiência visando desenhar um gráfico quantidade de P formado versus tempo e se espera tempo suficiente, obtemos quase sistematicamente um gráfico com um aspeto semelhante ao da Fig. 5. Num dado momento t a atividade catalítica é dada pelo declive da curva nesse tempo t. À medida que o tempo de ensaio aumenta diminui a velocidade. Isto pode ser causado pela diminuição de concentração de reagentes (que se vão consumindo), pelo aumento de concentração de produtos (que podem tornar significativa a velocidade da reação inversa ou, ligando-se à enzima, provocar inibição) ou/e simplesmente porque a enzima é instável nas condições de ensaio e sofre desnaturação. A esmagadora maioria dos estudos de cinética baseiam-se na estimativa da velocidade para tempo zero (velocidade inicial ou v 0 ); nesse momento as características do meio de ensaio, nomeadamente a concentração dos substratos, são aquelas que foram escolhidas para o realizar. Quando dizemos que medimos a atividade catalítica de uma enzima e que essa atividade era, por exemplo, de 1 μmol/min estamos a referir-nos ao v 0. Se escolhêssemos arbitrariamente um outro tempo de ensaio, o valor da atividade que apontássemos, já não refletia as condições que foram escolhidas para o determinar. No entanto, na prática, também poderá ser sensato escolher um tempo de reação em que a velocidade não tenha diminuído demasiado (por exemplo, menos de 10% da velocidade inicial) e considerar que a razão quantidade de produto formado/tempo de ensaio é uma boa estimativa do v 0 (ver Fig. 5). Fig. 5 Quantidade de produto formado versus tempo. A atividade enzímica é uma quantidade extensiva (n/t) e em cada momento t corresponde ao declive de uma curva como a desta figura. A velocidade de conversão A P diminui com o tempo de ensaio. v 0 é o valor do declive no tempo zero e o valor da atividade catalítica para as condições de ensaio nesse tempo zero. No caso em análise o resultado da operação de dividir a quantidade (µmol) de produto formado ao fim de 5 minutos por 5 min poderia ser uma boa estimativa de v 0 : a atividade da enzima na preparação enzímica que foi adicionada neste meio de ensaio seria 1UI (5 μmol/ 5 min = 1 μmol/min). Página 6 de 26

7 5.3 Influência da quantidade de enzima na velocidade de conversão v 0. Mantendo invariantes todas as outras condições de ensaio, a velocidade de conversão v 0 é diretamente proporcional à quantidade de enzima adicionada no meio de ensaio. De facto, isto só se verifica se a concentração molar de sítios catalíticos da enzima for muito mais baixa que a concentração molar dos substratos mas, pelo menos nas condições habitualmente usadas nos ensaios in vitro, esta condição é amplamente satisfeita. Assim, é de prever que o gráfico v 0 versus quantidade de enzima seja uma linha reta de declive positivo que passa pela origem (ver Fig. 6). Como já referido, este facto permite entender que se use a atividade enzímica como uma medida da quantidade de enzima e também permite definir quantidades derivadas da atividade enzímica. Uma das unidades derivadas mais frequentemente usada designa-se por atividade específica e corresponde à atividade por massa de proteína. Se, por exemplo, adicionarmos a um meio de ensaio adequado, 1 μl de um homogeneizado hepático e a velocidade de conversão for 1 μmol min -1 podemos dizer que esta era a atividade da enzima em questão no μl de homogeneizado adicionado. Se, simultaneamente, soubermos que a quantidade de proteína nesse 1 μl de homogeneizado era de 10 μg podemos concluir que a atividade específica da enzima nesse homogeneizado hepático era de 0,1 μmol min -1 μg de proteína. Este valor poderia servir para comparar o resultado obtido com um outro em que se usou a mesma técnica, mas um outro fígado como fonte de enzima. É de notar que a atividade medida nos ensaios em questão dependem de múltiplas escolhas (como a temperatura, o ph, a concentração de substrato, etc.) e que só repetindo essas condições é que se podem legitimante comparar os resultados obtidos com os dois fígados distintos. Se, o que não é muito frequente, conhecermos o número de moles de enzima adicionada no meio de ensaio podemos calcular a atividade exprimindo-a em moles de substrato convertido por segundo e por mole de enzima. Neste caso, a atividade seria expressa em s -1. A isto se chama atividade enzímica molar e o conceito será desenvolvido no Capítulo Fig. 6 Atividade enzímica versus quantidade de enzima. Os três gráficos desta figura representam o resultado de uma mesma experiência. Em cada um de 4 tubos de ensaio contendo um meio especificado foram adicionadas 4 diluições de uma mesma preparação enzímica; 1E, 2E, 3E e 4E representam as distintas quantidades de enzima adicionadas. No gráfico da esquerda estão representados os traçados obtidos (quantidade de produto formado versus tempo) para cada um dos tubos e as retas que estimam v 0 (a tracejado). O gráfico acima à direita representa v 0 versus quantidade de enzima. Os pontos do gráfico abaixo à direita representam a atividade específica obtida em cada um dos quatro ensaios (UI/mg proteína). A Equação 11 (ver à frente) mostra claramente que, quando as de condições de ensaio são fixadas e a única que varia é a concentração de enzima, v 0 é proporcional a [Et], a concentração total de enzima no meio de ensaio. Página 7 de 26

8 5.4 Influência da temperatura na atividade enzímica. Em todas as reações químicas, incluindo as catalisadas por enzimas, a velocidade das reações aumenta com a temperatura, mas a velocidade com que uma proteína sofre desnaturação (e uma enzima se inativa) também aumenta com a temperatura. O número de enzimas capazes de resistir a temperaturas da ordem dos 100 C durante alguns segundos é extremamente restrito. A temperaturas elevadas, a velocidade de desnaturação da enzima é muito alta podendo acontecer que a atividade enzímica se anule pouco tempo após o início do ensaio (ver Fig. 7). Por isso é prudente escolher temperaturas de ensaio que minimizem a velocidade de desnaturação da enzima. Fig. 7: Quantidade de produto formado versus tempo a várias temperaturas. O uso de temperaturas elevadas pode dificultar ou mesmo impedir uma boa estimativa de v 0 ; assim é habitual usar temperaturas de ensaio em que a enzima é estável. Esta figura mostra como pode variar a quantidade de produto ao longo do tempo para ensaios de uma mesma enzima a várias temperaturas. Se usássemos um tempo de incubação suficientemente curto poderíamos concluir que a enzima era mais ativa a 60 C; nesse tempo muito curto a velocidade da reação enzímica foi alta e ainda não houve tempo suficiente para que a desnaturação se processasse em extensão apreciável. Temperaturas mais baixas facilitam a estimativa de v 0 pois a atividade varia menos ao longo do tempo de ensaio. 5.5 Influência do ph. O ph a que uma reação enzímica é estudada é normalmente imposto pelo experimentador adicionando no meio de ensaio uma quantidade adequada de um determinado tampão de ph. Um determinado tampão só funciona adequadamente numa faixa limitada de valores de ph e se o objetivo é estudar uma reação enzímica numa ampla gama de valores de ph temos de escolher tampões diferentes. Assim, um determinado resultado experimental atividade versus ph pode refletir apenas a influência do tampão na atividade catalítica. Excluída esta possibilidade, os gráficos experimentais atividade versus ph podem traduzir que a ligação de protões em resíduos aminoacídicos críticos para a atividade da enzima (ou nos substratos) tem consequências no valor da atividade que é medido. Para determinadas condições de ensaio existe um ph ótimo, o ph a que se obtém maior atividade (ver Fig. 8). Se pretendermos estudar uma isoenzima A e, na mesma preparação enzimática, estiver presente uma isoenzima B poderá ser difícil distinguir qual das duas isoenzimas está a catalisar a reação. No entanto se os phs ótimos das duas isoenzimas forem diferentes pode-se favorecer uma delas em detrimento da outra escolhendo um ph que otimize a atividade da isoenzima que se quer estudar e prejudique a da outra (ver Fig. 8). Página 8 de 26

9 Fig. 8: Atividade (unidades arbitrárias) de duas isoenzimas em função do ph do meio de ensaio. Se a isoenzima A tem como ph ótimo, 7 e a isoenzima B, 10 pode-se favorecer a atividade da isoenzima B escolhendo ph 10 para fazer ensaio. Nestas condições o contributo da enzima A para a atividade global seria muito baixa e seria sensato pensar que se estava a estudar a atividade da isoenzima B. 5.6 Influência da concentração dos substratos na atividade enzímica e saturabilidade. O efeito da concentração dos substratos na velocidade das reações enzímicas foi sempre um tema com especial interesse quando se estuda a atividade das enzimas. Quando se estuda a influência da concentração de um substrato na atividade duma enzima começa por fixar-se a concentração dos outros substratos (se os houver) e das demais condições de ensaio e estuda-se como varia a atividade versus concentração de um dos substratos. Em 1902 Adrian Brown estudando a reação de hidrólise da sacarose (a sua lise em glicose e frutose) e usando como catalisador sacarase observou que para concentrações altas do substrato sacarose, a ordem da reação era zero em relação à sacarose; ou seja, nessas concentrações a velocidade da reação não variava quando variava a concentração de substrato. Brown propôs um mecanismo que explicaria o fenómeno: Equação 7 E + sacarose E sacarose E + glicose + frutose A enzima formaria com o substrato um complexo intermediário (mais tarde chamado complexo de Michaelis); este complexo E sacarose daria origem aos produtos regenerando-se a enzima livre E e a velocidade de reação seria proporcional à concentração deste complexo. Se a concentração de sacarose for suficientemente elevada pode acontecer que, praticamente, todas as moléculas de enzima presentes no meio estejam ligadas à sacarose e que não seja possível, pela adição de mais sacarose, aumentar a concentração do complexo E sacarose. Estas condições dizem-se de saturação ; a enzima está saturada de substrato e a velocidade de reação não aumenta quando se aumenta a concentração deste. Nalgumas enzimas o gráfico atividade versus concentração do substrato tem um aspeto semelhante à enzima h, enquanto noutras o aspeto deste gráfico se assemelha ao da enzima s (ver Fig. 9). No primeiro caso (h) o gráfico em questão é uma hipérbole retangular que passa pela origem enquanto no segundo é um sigmoide (s). De qualquer forma ambos os tipos de gráfico espelham uma característica dos resultados que se obtêm quando se estudam enzimas: aumentado a concentração de substrato atingir-se-ão concentrações que mostram que as enzimas são saturáveis. Como será analisado no Capítulo 5.7, ao v 0 medido em condições de saturação chamase V max. Página 9 de 26

10 Fig. 9: Os gráficos atividade versus concentração podem ter aspetos diferentes mas a saturabilidade é uma característica das enzimas. 5.7 Influência da concentração do substrato em enzimas com cinética de tipo michaeliano ou hiperbólico. Para muitas enzimas o gráfico v 0 versus concentração de um dos substratos, mantendo constantes todas as outras condições do meio, é um ramo de uma hipérbole retangular que cruza os eixos horizontal e vertical no ponto 0,0 (ver Fig. 9). Um tratamento matemático possível que explica este tipo de gráficos em reações enzímicas com apenas um substrato (ou mais de um, mas em que a concentração dos outros é fixa) foi proposto por Leonor Michaelis e Maude Menten em Estes autores admitiram vários pressupostos: 1) Um mecanismo representado pelo esquema seguinte: E + S k 1 k 3 E S k 2 E + P + Fig. 10: Esquema do mecanismo proposto por Michaelis e Menten. A velocidade de formação do complexo E S seria de 1ª ordem em relação a S (o substrato), e em relação a E (a enzima livre; não ligada a S); ou seja, a reação seria globalmente de 2ª ordem e a constante cinética associada ao processo seria k 1. Quer a velocidade de formação dos produtos, quer a de dissociação do complexo E S em S + E seriam proporcionais à concentração deste complexo: ambos os processos seriam de 1ª ordem em relação a E S e as constantes cinéticas seriam, respetivamente, k 3 e k 2. 2) A velocidade de formação dos produtos a partir do complexo E S era muito lenta relativamente às velocidades de dissociação e formação do complexo em E + S (k 2 >>k 3 e k 1 [E][S]>>k 3 [E S]) donde se poderia admitir que a reação de formação e dissociação do complexo E S se encontrava num estado muito próximo do equilíbrio químico. 3) O equilíbrio respeitante ao processo de formação do complexo E S se atingia tão rapidamente que, na escala de tempo da conversão macroscópica de S em P, se poderia considerar instantâneo e se mantinha durante todo o tempo em que ocorria a transformação S P+... Além disso, a concentração de sítios catalíticos na enzima, [Et], era muito baixa relativamente à concentração de [S] de maneira que, para que esse estado de equilíbrio fosse atingido, muito poucas moléculas de S tinham que reagir com E. Ou seja, enquanto era necessário considerar que, durante a reação, parte das moléculas da enzima estavam na forma do complexo E S e outras na forma livre (E), no caso de S a concentração total não era significativamente afetada pela ligação à enzima: [S] era a concentração de substrato no meio de ensaio e o valor que se poderia subtrair pelo facto de algumas moléculas estarem ligadas no complexo E S era irrelevante. Para a reação de dissociação do complexo E S definiram a constante de equilíbrio K s (s de substrato) que tem dimensões de concentração. Página 10 de 26

11 Equação 8 K s = [S][E] [E S] = k 2 k Com base nestes pressupostos definiram v 0 como a velocidade da reação (expressa, neste caso, como a velocidade de variação da concentração do substrato ou dos produtos); essa velocidade será expressa pela Equação 9: Equação 9 v 0 = k 3 [E S] k 3 é a constante de velocidade para a reação elementar de 1ª ordem E S E + P +... A concentração total de enzima ([Et]) é igual à soma das concentrações de enzima livre ([E]) e da enzima complexada ([E S]): Equação 10 [Et] = [E] + [E S] As Equações 8, 9 e 10 constituem um sistema que pode ser desenvolvido de forma a obter v 0 em função de [Et], K s e [S]: Equação 11 = k [Et][S] s [S] Um gráfico v 0 versus [S] é um ramo de uma hipérbole retangular com um aspeto que se adequa à descrição da variação da velocidade das reações catalisadas pela maioria das enzimas; ver Fig. 11. Fig. 11: Variação da atividade de uma enzima com cinética de tipo hiperbólica com a concentração de substrato. Quando [S]>>K s uma das parcelas do denominador da Equação 11 é irrelevante comparativamente à outra e a Equação em análise simplifica para v 0 =k 3 [Et]. Nestas circunstâncias praticamente toda as moléculas de enzima estão complexadas com substrato, [Et] [E S] e, mantendo todas as outras condições do ensaio, não seria possível aumentar a velocidade aumentando a concentração de substrato. É imediato reconhecer que estas são as condições que definimos como de saturação no Capítulo 5.6. Ou seja, o valor de v 0 medido nestas condições designa-se por velocidade máxima, a sigla correspondente é V max, sendo V max = k 3 [Et] (ver Fig. 11). É de notar que o valor de V max obtido em determinadas condições de temperatura e ph pode ser diferente daquele que é obtido noutras condições de temperatura e ph. V max apenas significa v 0 para concentrações saturantes de substrato, nas condições de ensaio que foram usadas. Assim podemos escrever a equação de Michaelis-Menten como se segue: Página 11 de 26

12 Equação 12 = [S] K s [S] Quer nesta equação, quer na Equação 11, a razão representa a percentagem de saturação da enzima. K s [S] Quando [S]>>K s o seu valor é próximo de 1 e, como já referido, a enzima está saturada. [S] Quando [S]<<K s, o valor da razão é pequeno e a Equação 12 simplifica para K s [S] v 0 = V max [S]/K s. Para valores de concentração de substrato muito mais baixas que o valor de K s, praticamente toda a enzima está na forma não complexada ([Et] [E]) e a velocidade é (quase) diretamente proporcional à concentração de substrato. [S] Quando [S]=K s, o valor da razão é ½ e a enzima está hemisaturada, ou seja, [E]=[E S] e a enzima K s [S] está igualmente distribuída entre as formas complexada e não complexada. Nestas condições v 0 = V max /2. Ver Fig. 12. [S] Fig. 12: Distribuição das formas enzímicas complexada e não complexada com o substrato para três concentrações de substrato. Para valores de concentração de substrato muito superiores a K s (ou a K m ) a soma no denominador da Equação 12 pode simplificar para [S]; a enzima está saturada, v 0 V max e a hipérbole, para estas concentrações de substrato, tende para uma reta de declive nulo. Para valores de concentração de substrato muito inferiores a K s a soma no denominador da Equação 12 pode simplificar para K s ; v 0 é proporcional a [S] (e a constante de proporcionalidade = V max /K s ) e a hipérbole, para estas concentrações de substrato, tende para uma reta de declive = V max /K s. Quando a concentração de substrato é igual a K s a enzima está hemisaturada e na Equação 12 o denominador pode simplificar para 2 [S]; v 0 = V max /2. K s é a concentração de substrato para a qual v 0 é igual a metade de V max. Na Equação 13 K s será substituído por K m e todas estas afirmações continuam a fazer sentido. 5.8 Significado da constante de Michaelis-Menten Um dos pressupostos de Michaelis e de Menten, concretamente a imposição de k 3 <<k 2 e a consequente necessidade de equilíbrio químico na formação e dissociação de E S, foi questionados por Briggs e Haldane em Estes autores admitiram a possibilidade de não haver equilíbrio químico nesse processo, mas que, na escala de tempo considerada, a concentração do complexo E S se mantinha constante (estacionária) durante o processo catalítico; ou seja que a soma das velocidades de desagregação do complexo E S (k 2 [E S] + k 3 [E S]) iguala a velocidade da sua formação (k 1 [S] [E]). Ver Fig. 10. Com base neste pressuposto, o desenvolvimento matemático leva a uma equação semelhante à proposta por Michaelis e Menten (ver Equação 13), mas em que a constante de equilíbrio K s é substituída por uma outra K m, sendo que o valor deste parâmetro é o determinado pela Equação 14. Equação 13 Equação 14 = [S] m [S] = + Página 12 de 26

13 De forma mais pragmática que K s (que é uma constante de equilíbrio), o valor de K m, a constante de Michaelis-Menten, pode ser definida como o valor da concentração de substrato quando a atividade da enzima é metade de V max (ver Fig. 13). Fig. 13 Fig.8: Atividade versus concentração de substrato em enzimas com cinética de tipo hiperbólico. O V max é o limite para que tende v 0 quando a concentração do substrato S tende para infinito. O K m é a concentração de substrato para o qual o valor de v 0 é metade do valor de V max. A Equação 13 descreve uma hipérbole retangular passando pela origem, com uma assímptota horizontal (y= V max ) e outra vertical (x=- K m ). Admitindo, como fizeram Michaelis e Menten, que k 3 <<k 2 a constante de Michaelis-Menten será a constante de dissociação do complexo E S em S + E (enzima livre) e coincide com K s. Se aceitarmos tal como Briggs e Haldane o valor do K m como definido pela Equação 14 o seu valor será tanto maior quanto maiores forem os valores das constantes cinéticas associadas à dissociação do complexo E S (em E+S no caso de k 1 ; em E+P no caso de k 3 ) e tanto menor quanto maior for o valor da constante cinética associada à formação do complexo E S (k 1 ). Quer a simplificação de Michaelis e Menten seja aceitável, quer não seja, o valor do K m é uma medida da afinidade do substrato em relação à enzima. O valor deste parâmetro tem as mesmas unidades que a concentração de substrato e será tanto maior quando menor for a afinidade da enzima para o seu substrato. Na Equação 13 o valor do K m está no denominador o que significa que, quanto menor for o seu valor, maior será a atividade da enzima. Para determinadas condições de ensaio os valores de k 1, k 2 e k 3 são constantes e, portanto, também é constante o valor de K m ; este valor não varia com a quantidade de enzima utilizada no ensaio e é, portanto, uma característica da atividade dessa enzima. 5.9 Influência da concentração de substrato em enzimas com cinética de tipo cooperativo ou sigmoide. Quando se estuda a influência da concentração de alguns substratos na atividade de algumas enzimas podem obter-se gráficos v 0 versus concentração de substrato que se assemelham mais a um sigmoide que a uma hipérbole (ver Fig. 9). Este fenómeno ocorre, por exemplo, nos casos da cínase da glicose, da cínase-1 da frutose- 6-fosfato, da cínase do piruvato, da desidrogénase do glutamato, da transférase de amidofosforibosilo e da transcarbamílase do aspartato. Para baixas concentrações de substrato a atividade cresce de forma exponencial com a concentração deste. Para altas concentrações de substrato manifesta-se o fenómeno da saturação: o facto de existir uma quantidade limitada de enzima no meio de ensaio implica que, quando a enzima está próxima da saturação, as variações da concentração de substrato provocam modificações mínimas na atividade. As cinéticas de tipo sigmoide também se chamam de tipo cooperativo ou de cooperatividade positiva. A palavra cooperatividade surgiu na sequência das teorias que foram formuladas em meados dos anos 60 do Página 13 de 26

14 século passado para explicar o traçado sigmoide nos gráficos que relacionam a quantidade de oxihemoglobina (hemoglobina O 2 ) com a pressão parcial de oxigénio (po 2 ); a chamada curva de saturação da hemoglobina. Os modelos formulados tentam explicar porque é que, para baixas concentrações de substrato (ou de O 2 no caso da hemoglobina), um aumento discreto nessas concentrações provoca aumentos desproporcionadamente maiores na forma ligada da enzima (ou da hemoglobina) e partem da constatação de que, na maioria dos casos, as enzimas com esta característica são, tal como a hemoglobina, proteínas oligoméricas (com estrutura quaternária). Talvez que o modelo mais conhecido seja o que foi proposto por Koshland em 1966 desenvolvendo, para o caso de proteínas (ou enzimas) com mais que um local de ligação para o ligando (ou o substrato), um modelo por si formulado em 1959 (o modelo de encaixe induzido; ver Capítulo 2). Na sua formulação mais simples a proposta de Koshland admite que a ligação de uma molécula de substrato num dos monómeros da enzima oligomérica induz uma modificação conformacional nesse monómero que, por sua vez, influencia a conformação dos outros monómeros de um mesmo oligómero de tal forma que estes aumentam a sua afinidade para o substrato. A ligação de uma molécula de ligando (o oxigénio ou um substrato) a um dos monómeros da proteína em análise influência positivamente a ligação de uma segunda molécula de ligando aos outros monómeros e algo de semelhante se poderia dizer da ligação desta segunda molécula de ligando. Ou seja, a ligação de moléculas de ligando aos monómeros de uma enzima oligomérica coopera na ligação de mais moléculas de ligando nos locais de ligação situados nos outros monómeros do oligómero. O modelo de Koshland permite escrever equações muito complexas que podem descrever adequadamente as curvas sigmoides nos gráficos atividade versus concentração de substrato de todas as enzimas oligoméricas com mais de um local de ligação para o substrato. No entanto, deixam sem explicação alguns casos de enzimas monoméricas que apresentam cinéticas de tipo sigmoide, como por exemplo a glicocínase. Foram propostas teorias que explicam estas situações; em muitas delas se admite a existência de mais de uma forma conformacional para a enzima. É de notar que nem todas as enzimas oligoméricas têm cinéticas de tipo cooperativo; por exemplo os dados experimentais obtidos com a desidrogénase láctica (uma enzima tetramérica) ajustam-se a uma cinética de tipo michaeliano. As equações resultantes do tratamento matemático do modelo de Koshland (e de um outro formulado por Monot, Wyman e Changeux) são demasiado complexas para serem usadas na prática da Bioquímica. Uma forma mais simples e muito mais comum é usar (para a descrição paramétrica das sigmoides), de forma pragmática, uma equação proposta por Hill em 1913 para descrever a curva de saturação da hemoglobina. Adaptando essa equação (equação de Hill) para o caso das enzimas temos a Equação 15. Equação 15 = [S] ( ) [S] Nesta equação [S] é a concentração de substrato, S 50 é a concentração de substrato para a qual a enzima está hemisaturada e em que a velocidade é metade de V max. (Nas cinéticas de tipo sigmoide a sigla S 50 é mais adequada que K m.) h é o coeficiente de Hill e é uma medida do grau de cooperatividade (ou sigmoidicidade): quando h=1 a Equação 15 simplifica e é igual à equação de Michaelis-Menten (ausência de cooperatividade; ver Equação 13), quando h>1 dizemos que a cooperatividade é positiva e o gráfico v 0 versus [S] é um sigmoide (ver Fig. 14). Por razões que serão discutidas à frente é frequente chamar às enzimas que exibem uma cinética de tipo cooperativo enzimas alostéricas. No entanto estas duas expressões não são sinónimas: existem muitas enzimas sensíveis a efetores alostéricos e que podem por isso chamar-se também de alostéricas que não apresentam cinéticas de tipo cooperativo. Página 14 de 26

15 Vmax 10 h=4 V o h=2 h=1 Vmax/ S 50 [Substrato] Fig. 14 Fig.9: Gráficos v 0 versus [S] usando a Equação 15 para diferentes valores de h; S 50 =5 e V max = 10 para todos os casos. S50 é a concentração de substrato para v 0 = V max / A atividade enzímica molar Já foi referido no Capítulo 5.3 que, em algumas situações, a atividade de uma enzima se pode exprimir em unidades de tempo -1 : a atividade enzímica molar. Quando se trabalha com enzimas purificadas, se se sabe a massa de proteína presente na preparação enzímica e a massa molar da enzima, é trivial calcular os moles de enzima presentes na preparação. A constante cinética que relaciona a velocidade de formação de produtos a partir do complexo intermediário E S foi, até aqui designada por k 3 (ver Equação 9, Equação 11 e Fig. 10). No entanto, também é frequente usar a sigla k cat (e a expressão constante catalítica) para a designar. Tendo isto em conta e o que se escreveu nos Capítulos 5.7 e 5.8 é imediato concluir que a Equação de Michaelis-Menten pode ser escrita como se segue (ver Equação 16). Equação 16 = cat [Et] [S] K m [S] Nesta equação v 0 representa uma velocidade de reação (variação de concentração do substrato ou do produto por umidade de tempo) mas, se multiplicarmos ambos os termos pelo volume de ensaio, obtemos a atividade enzímica (que pode expressa pelo mesmo símbolo v 0 ) em função da quantidade de enzima e de uma razão [S] que representa a percentagem de saturação (ver Equação 17). (É de notar que uma equação K m [S] semelhante pode ser escrita para o caso das enzimas com cinéticas de tipo sigmoide; neste caso a razão que [S] representa a percentagem de saturação seria e, na maioria dos casos, Et representa o número de moles ( ) [S] de sítios catalíticos no meio de ensaio.) Equação 17 =k cat Et [S] K m [S] Se exprimirmos Et em molaridade, o proa expressão Et representa o número de moles de enzima K m [S] que está a converter substrato em produto, ou seja, o número de moles do complexo E S presente no meio de ensaio. Na Equação 17, k cat é o inverso do tempo necessário para que uma molécula de enzima ligada ao substrato complete um ciclo catalítico. Se o valor de k cat for, por exemplo, 1 s -1 significa que o tempo que uma molécula de enzima ligada ao substrato demora a completar um ciclo catalítico é 1 segundo. Este valor também se designa por [S] Página 15 de 26

16 turnover number e é uma forma adequada de exprimir a atividade catalítica de uma enzima quando se conhecem os dados pertinentes para a sua dedução. Se estivermos a fazer o ensaio em condições de saturação, o k cat é o valor que resulta da divisão da velocidade de conversão (em mol s -1, por exemplo) pelo número de moles de enzima no meio de ensaio (expresso em mol). 6 Modificadores da atividade enzímica: inibidores e ativadores. Quando comparamos um par de ensaios enzímicos feitos nas mesmas condições (inclusive a concentração de substrato), exceto a presença e a ausência de uma substância M, pode acontecer que as atividades sejam significativamente diferentes. Nestes casos pode ser útil usar o conceito de grau de modificação (inibição ou ativação) induzido por M (inibidor ou ativador). O grau de inibição pode ser definido como a variação de atividade provocada pelo inibidor relativamente ao ensaio em que ele estava ausente: = (v 0 - v 0 inibidor ) /v 0. No caso de ativação o grau de ativação seria: = (v 0 ativador - v 0 ) /v 0. Ver Fig. 15. Actividade enzímica } Δ v o +inibidor Δ v o{ +activador 0 Fig. 15 Pela adição de determinadas substâncias ao meio de ensaio podemos eventualmente aumentar ou diminuir a atividade catalítica da enzima. Quando em determinadas condições de ensaio uma substância pode aumentar a atividade enzímica diz-se um ativador; se diminui a atividade catalítica diz-se um inibidor. O grau de ativação ou de inibição pode ser expresso como uma percentagem e neste caso o seu valor será 100 Δv 0 /(v 0 na ausência de modificador). 6.1 Inibidores competitivos Quando se estuda o efeito da concentração de substrato na atividade podemos, multiplicando o número de tubos, fazê-lo também na presença de várias concentrações de uma substância I: um inibidor da atividade da enzima. Algumas vezes observa-se que o inibidor não altera o V max, mas que é o valor de K m que cresce linearmente com o valor de I. O grau de inibição é marcado para baixas concentrações de substrato, mas diminui quando esta concentração aumenta podendo mesmo deixar de observar-se inibição para altas concentrações de substrato. Nos casos em que a cinética é hiperbólica um mecanismo enzímico como o que é apresentado a seguir pode explicar o fenómeno: E + S + I k 1 k 3 E S k 2 E + P + k 5 k 6 E I Página 16 de 26

17 Fig. 16 Modelo esquemático de um mecanismo que se traduz em inibição competitiva do inibidor relativamente ao substrato S. O esquema acima representa um mecanismo em que E (a enzima livre), I e E I estão em equilíbrio químico durante todo o processo catalítico; existe assim uma constante de equilíbrio K i (à frente designada de constante de inibição) que relaciona as concentrações de equilíbrio destas três substâncias e que pode ser definida como a constante de dissociação do complexo E I. Equação 18 = [I][E] [E I] = k 6 k O desenvolvimento matemático deste modelo conduz à Equação 19: Equação 19 = [S] m [I] K [S] A Equação 19 mostra que o valor da constante de Michaelis para um determinado valor de [I], o valor da constante de Michaelis aparente (o que pode ser observada na presença de uma dada concentração de I) é expresso pela Equação 20. Equação 20 m = m 1 + [I] K Assim, K i, para além de se poder definir como o valor da constante de dissociação para o complexo E I (ver Equação 18), também passa a poder ser redefinida como a concentração de inibidor que dobra o valor do K m (ver Equação 20). Quanto menor for o seu valor maior será a capacidade inibidora da substância I. Vmax vo S 7 6 S+I [S] Km Km' Fig. 17 Os inibidores competitivos atuam aumentando o Km aparente. A hipérbole S representa v 0 versus [S] na ausência de inibidor e a hipérbole S+I, v 0 versus [S] na presença de uma determinada concentração do inibidor I. K m e K m representam, respetivamente, a constante de Michaelis observável na ausência e na presença do inibidor. Na presença do inibidor o valor de K m aumenta, mas o valor de V max não se modifica: o efeito inibidor anula-se para concentração infinita de substrato. Página 17 de 26