Cinética e regulação enzímicas (a velocidade das reacções enzímicas in vivo e in vitro)
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- Giovanni Gonçalves Palmeira
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1 Cinética e regulação enzímicas (a velocidade das reacções enzímicas in vivo e in vitro) rui.fontes@mail.telepac.pt Laboratório de Bioquímica da Faculdade de Medicina do Porto 1 As concentrações dos intermediários do metabolismo variam de indivíduo para indivíduo e com o estado metabólico mas mantêm-se em torno de determinados valores. As concentrações dos intermediários do metabolismo dizem-se estacionárias. Exemplo: A concentração de ATP (e a maioria dos outros compostos existentes nos seres vivos) considerando as várias reacções em que intervém como reagente ou produto não está em equilíbrio químico....mas a velocidade do conjunto de reacções que formam ATP é (quase) sempre igual à velocidade do conjunto de reacções em que este se gasta... existe nas células uma concentração estacionária de ATP. s mecanismos que permitem manter o ATP, os intermediários do metabolismo, a glicose do plasma, etc em concentrações estacionárias são muito complexos e denominam-se 2de mecanismos homeostáticos. A regulação do metabolismo de modo a adaptar-se a diferentes condições (actividade ou descanso, jejum ou estado absortivo, diferentes tipos de dieta, etc.) é uma condição de sobrevivência. nutrientes C 2 + H 2 ureia 2 ADP + Pi ATP trabalho mecânico contracção muscular transporte activo Ca + Na + Estado absortivo= Glicemia glicose Estado de jejum = Glicemia A adaptação a diferentes condições só é possível porque a actividade das 3 enzimas se modifica quando se alteram essas condições. As enzimas são sensores do ambiente onde se encontram variando a sua actividade em função de variações nesse ambiente. 11 A As enzimas que catalisam reacções fisiologicamente reversíveis catalisam a conversão líquida no sentido directo ou inverso de acordo com a lei da acção das massas mas não são determinantes no sentido nem na velocidade de fluxo (J) da via metabólica... S 1,1 P 1 B,1 As enzimas marca passo de uma via metabólica catalisam reacções fisiologicamente irreversíveis e a sua actividade determina a velocidade de fluxo nessa via metabólica. Estas enzimas (1) têm baixa actividade, (2) tem um papel determinante na regulação do metabolismo e (3) são controladas por efectores que só às vezes coincidem com os substratos e produtos... Glicólise 4
2 Aumentar a actividade de uma enzima que catalisa uma reacção de desequilíbrio (M2 M3) pode significar um aumento transitório na concentração do intermediário M3 mas, a enzima a jusante que catalisa a conversão reversível M3 M4 rapidamente repõe a concentração de M3 num valor próximo do original. J 1 = (1) = (11 1) = 1 É na barragem que se controla o caudal (fluxo) de um rio mudanças no valor do fluxo (J) na barragem provocam mudanças de fluxo idênticas a montante e a jusante da barragem. J 2 = (2) = (12 1) = 2 5 Diferentes tipos de mecanismos podem participar na regulação das enzimas marca-passo das vias metabólicas: 1- De instalação lenta (horas ou dias): a quantidade de enzima como a resultante das velocidades da sua síntese e da sua degradação Modificação alostérica (AMP, Ca 2+ ) 2- De instalação rápida (segundos ou milisegundos): 3- De instalação rápida mas, geralmente, com papel menos importante (pelo menos no metabolismo normal) 2.2- Modificação covalente (fosforilação e defosforilação, clivagem hidrolítica ) 2.3- Ciclos de substratos ( fúteis ) H 2 M M-P 2.4- Acesso ao substrato por regulação do transporte transmembranar (GLUT4, CPT ) M e concentração de substratos Pi ATP ADP 3.1- Inibição isostérica (competitiva) e inibição pelo produto 3.2- ph Temperatura M 1- Mesmo quando o que varia é apenas a concentração da enzima E sem que tenha variado a actividade de cada uma das suas moléculas se a velocidade da reacção que E catalisa aumentou dizemos que a actividade enzímica da enzima E aumentou (e vice-versa). É um mecanismo de instalação lenta. RNAm v1 Síntese proteica H 2 v2 RNAm 2.1- Quando uma fibra muscular se contrai aumenta a velocidade de hidrólise do ATP e aumenta a concentração de ADP (e AMP; 2 ADP AMP + ATP). AMP liga-se à fosforílase muscular induzindo uma conformação mais activa o AMP é um activador alostérico da fosforílase muscular. Fosforílase muscular na conformação tensa (inactiva) AMP sítio alostérico Fosforílase muscular na conformação relaxada (activa) Glicose-1-P v1 > v2 v2 > v1 AMP Se a velocidade de síntese de uma determinada enzima (v1) é maior que a velocidade com que se degrada (hidrolisa) na célula (v2) a concentração e a actividade dessa 7 enzima aumenta. Na condição inversa a concentração e a actividade diminuem. centro activo 8 C 2 + H 2
3 A complexidade dos processos de regulação de enzimas induzida por hormonas e neurotransmissores tem levado a que a palavra alostérico não se use neste contexto mesmo quando o termo seria adequado. Insulina ligada ao seu receptor A ligação entre os modificadores (activadores ou inibidores) alostéricos e os sítios alostéricos das enzimas é reversível e é de tipo não covalente. Activador alostérico receptor da insulina pode ser visto como uma enzima alostérica com o seu centro alostérico activador virado para o lado extra-celular (onde se liga a insulina) e o centro activo no lado citoplasmático. Inibidor alostérico Efeitos da insulina A ligação da insulina induz uma alteração conformacional no receptor que se torna capaz de catalisar a fosforilação de resíduos tirosina de proteínas designadas de Substratos do Receptor da Insulina (IRS). 9 e o mesmo acontece nas ligações dos substratos e dos inibidores isostéricos competitivos ao sítio activo das enzimas. Inibidor isostérico competitivo A modificação da actividade de uma enzima pode envolver a sua modificação covalente (hidrólise irreversível ou fosforilação reversível) por acção catalítica de enzimas (normalmente outras enzimas). Certas enzimas são activadas por hidrólise irreversível. São exemplos a activação dos zimogénios na digestão dos nutrientes. Exemplo 1: tripsinogénio é segregado pelo pâncreas. Convertese em tripsina (protéase digestiva) por acção da enteropeptídase (uma ectopeptídase presente no pólo apical dos enterócitos). Tripsinogénio H 2 Tripsina (activa) Enteropeptídase + polipeptídeo inactivo Exemplo 2: pepsinogénio é segregado pelas células principais do estômago. Converte-se em pepsina (protéase digestiva) por acção hidrolítica do ph ácido do estômago e da próprio pepsina que já se formou. 11 Muitas enzimas são reguladas por mecanismos de fosforilação/desfosforilação catalisadas por enzimas (cínases e fosfátases). Forma desfosforilada (activa) A fosfátase da desidrogénase do piruvato catalisa a desfosforilação da desidrogénase do piruvato que no estado desfosforilado fica activa. Forma fosforilada (inactiva) A cínase da desidrogénase do piruvato catalisa a fosforilação da desidrogénase do piruvato que no estado fosforilado fica inactiva. A actividade da desidrogénase do piruvato depende da percentagem da enzima total que está na forma activa (desfosforilada). valor desta percentagem depende das actividades relativas da (1) cínase 12 da desidrogénase do piruvato e da (2) fosfátase da desidrogénase do piruvato.
4 2.3- A existência de ciclos de substrato (antigamente chamados de fúteis ) permite amplificar o efeito de um sinal. glicose glicose J=1 J=91 Frutose-6-P Pi H 2 Frutose-1,6-bisP J=1 C 2 + H 2 ATP v = 9 v = 1 ADP Frutose-6-P Frutose-1,6-bisP C 2 + H 2 ATP ADP AMP activa a glicólise muscular porque estimula a cínase da frutose-6-p. Se este aumento for de 1 vezes, o facto de esta enzima fazer parte de um ciclo de substrato 13 permite compreender que o aumento no fluxo possa ser de 91 vezes. Pi v = 9 v = 1 AMP H 2 J= Também há ciclos de substrato no fígado (principal órgão da gliconeogénese). Aqui, o sentido do fluxo pode inverter-se. Após uma refeição que contenha glicídeos, a concentração intracelular de frutose-2,6-bisfosfato é alta e fica estimulada a cínase 1 da frutose-6-p (e a glicólise). No jejum, a concentração intracelular de frutose-2,6-bisfosfato é baixa e fica estimulada a frutose-1,6-bisfosfátase (e a gliconeogénese). Glicose-6-P glicose Glicose-6-P J=1 J= - 1 Pi Frutose-6-P Frutose-1,6-bisP Fosfoenol-piruvato ATP J=1 glicose Pi v = 2 H 2 Frutose-6-P Frutose-2,6- v = 1 v = 2 H 2 bisfosfato ADP Frutose- 2,6- bisfosfato Frutose-1,6-bisP Fosfoenol-piruvato J= - 1 ATP ADP 14 v = A acessibilidade aos substratos. Nas fibras musculares a entrada de glicose (e a sua subsequente metabolização) é limitada pelo número de transportadores (GLUT4) presentes na membrana sarcoplasmática. Contracção muscular ou insulina Quer o exercício físico quer a insulina estimulam a entrada de glicose para as fibras musculares porque nestas condições, de forma rápida, vesículas intracelulares contendo GLUT4 fundem-se com a membrana sarcoplasmática. Nos adipócitos o mesmo efeito é induzido pela insulina. A insulina e o exercício físico estimulam a remoção da glicose Nas enzimas marca-passo, geralmente, o efeito directo da variação da concentração do substrato é pequeno (que mais não seja porque, in vivo, as concentrações dos metabolitos são estacionárias). Mas, em alguns casos foi possível estudar in vivo a variação da actividade de enzimas com a concentração do substrato. Num estudo de Brindle et al. (1989) estimulou-se electricamente o nervo ciático de ratos e mediu-se, na musculatura da perna, por NMR (1) a concentração de ADP e (2) a incorporação de Pi no ATP (síntase do ATP). Baixa actividade contráctil Alta actividade contráctil do plasma para as células Brindle et al. (1989) Biochemistry 28:
5 Estudamos até agora os mecanismos 1, 2.1, 2.2, 2.3 e 2.4. Falta referir os 3.1, 3.2 e De instalação lenta: a quantidade de enzima como a resultante das velocidades da sua síntese e da sua degradação. 2- De instalação rápida: 3- De instalação rápida mas, geralmente, com papel menos importante (pelo menos no metabolismo normal) 2.1- Controlo alostérico (AMP, Ca 2+ ) 2.2- Modificação covalente (fosforilação e defosforilação, clivagem hidrolítica ) 2.3- Ciclos de substratos ( fúteis ) 2.4- Acesso ao substrato por regulação do transporte transmembranar (GLUT4, CPT ) e concentração de substrato 3.1- Inibição isostérica (competitiva) e inibição pelo produto 3.2- ph 3.3- Temperatura produto como inibidor das enzimas marca-passo. Na reacção catalisada pela desidrogénase da glicose-6-p (via das pentoses- P) a reacção inversa não existe mas o NADPH compete com o NADP + pelo local de ligação deste no centro activo (inibição isostérica e competitiva). NADP + NADPH NADP + NADPH G 18 kj; Keq/QR 1 6-fosfogliconolactona NADPH é induzida pela insulina) a descida da concentração intracelular de NADPH 18 + A desidrogénase da glicose-6- fosfato é activada sempre que a concentração intracelular de NADPH desce. Para além de regulada ao nível da transcrição (a desidrogénase da glicose-6-p (um dos produtos) também estimula a actividade da enzima Pensa-se que a variação do ph não tem, em geral, um papel importante na regulação das enzimas intracelulares mas a) No estômago o ph do suco gástrico é ácido e as enzimas deste suco têm ph óptimo ácido No homem, a alteração de actividade das enzimas das células em situações de abaixamento da temperatura corporal ou de febre poderá ser importante mas não desempenha um papel relevante na regulação do metabolismo normal. As enzimas e transportadores humanos (ao contrário do que acontece com outros seres vivos) foram seleccionados de forma a manterem velocidades de fluxo adequadas à vida (nas vias anabólicas e catabólicas) numa estreita gama de temperaturas. b) suco pancreático neutraliza o quimo gástrico (H + + HC 3- C 2 + H 2 ) e as enzimas do suco pancreático e as enzimas digestivas Francisco Lázaro ( ) s órgãos para transplante são transportados a baixas temperaturas de forma a lentificar os processos catabólicos nomeadamente a hidrólise de proteínas (enzimas, transportadores, actina-miosina, etc) intestinais têm ph óptimo neutro. 19 2
6 Estudar as enzimas in vitro (no tubo de ensaio) para quê? A) estudo das enzimas é muito útil em análises clínicas A) estudo das enzimas é muito útil em investigação A1 - Doseamentos de enzimas plasmáticas (algumas enzimas só aparecem no plasma sanguíneo em determinadas patologias) A2 - Doseamentos de enzimas celulares (a deficiência de uma enzima pode ser diagnosticada ) A3 Uso de enzimas purificadas de bactérias ou fungos como instrumento no doseamento de substâncias (como a glicose sanguínea e múltiplas outras substâncias ) B1- estudo das enzimas é uma importante área da investigação bioquímica. B2-As enzimas purificadas são instrumentos imprescindíveis em múltiplas outras áreas de 21 investigação. Quando se quer quantificar a actividade de uma enzima adicionamos num tubo de ensaio a enzima ao(s) substrato(s) e vamos observando ao longo do tempo como evolui a reacção. Produto (micromoles) Acumulação de produto versus tempo 1/min,5/min tempo (min),1/min normal é que (por motivos vários) a reacção se vá lentificando. Quando se atingir o equilíbrio químico ou se esgotar o substrato a velocidade será zero mas actividade enzímica = velocidade da reacção enzímica Produto (micromoles) Acumulação de produto versus tempo Actividade azul (v ou ) = 1 mole / min Tempo (min) Admitamos que fizemos dois ensaios idênticos mas com duas amostras diferentes da mesma enzima E: amostra azul amostra vermelha Em qual das amostras a enzima E tinha maior actividade? Como podemos exprimir quantitativamente a actividade da enzima E na amostra azul? Se respondessemos: actividade = 3 moles/5 min =,6 moles/min... estariamos a falar da velocidade média nos 5 min de ensaio e a dizer que nas duas amostras a actividade era igual. Para a concentração de substrato em que o ensaio se iniciou a velocidade será o declive da curva produto formado versus tempo no tempo zero (v ou ) mas poderemos considerar que, pelo menos no caso do ensaio azul, uma boa estimativa 23 de v pode ser a velocidade média no primeiro minuto de ensaio (1 mole/min). Em teoria a actividade de uma enzima (num sistema de ensaio especificado e adequado) define-se como o aumento de velocidade de conversão (S P) induzido pela enzima: Actividade = = vel. na presença de enzima vel. na sua ausência ph=1 incubar substrato na presença de Fosf Alc. durante um tempo t ph=1 incubar substrato na ausência de Fosf Alc. durante um tempo t NaH NaH ph=12; ph onde a Fosfátase Alcalina pára de funcionar ph=12 ler Absorvância no ensaio enzímico ler Absorvância no ensaio a branco A realização de ensaios a branco (sem enzima) permite prevenir a eventualidade de ocorrer reacção não enzímica. Ao subtrair o branco... também se subtrai o produto que eventualmente 24 se tenha formado na ausência de enzima (ou que esteja presente como contaminante do substrato).
7 Como variará se duplicarmos (ou triplicarmos...) a concentração de enzima num ensaio enzímico? Qual a quantidade de enzima E no ensaio vermelho? Acumulação de produto versus tempo 3 A actividade enzímica ( ou uma boa estimativa de ) num meio especificado e adequado é proporcional à quantidade de enzima ( desde que a concentração molar de enzima seja muito inferior à do substrato). v inicial kcat Km S S E total v const. inicial E total se fizermos ensaios nas mesmas condições (temperatura, ph, etc.) k cat e Km são constantes; se também usarmos a mesma concentração de substrato [S] 25 este factor éconstante Produto (micromoles) Tempo (min) UI (unidade internacional) = quantidade de enzima que catalisa a conversão de 1 mol de substrato em produto / min Embora, pelo menos teoricamente, a quantidade de uma enzima possa ser medida em moles ou em gramas, é mais frequente medir a quantidade de enzima como uma velocidade de reacção; a velocidade da reacção catalisada pela enzima 26 em análise (idealmente no tempo zero; ). Admitindo que 1) a enzima E catalisa a reacção XY 2) o tubo de ensaio A continha 1 ml de solução 3) no tempo zero se adicionou 1 l de soro 4)... e se foi medindo a quantidade X ao longo do tempo Qual a actividade da enzima E no soro em análise? 1) No tubo A nos primeiros 1 min a concentração de X passou de 1 para 9 mm = diminuiu 1 mm (ou 1 M) 2) 1 M *,1 L = 1 moles de X convertido em Y 3) 1 mol de X/ 1 min = 1 mol / min 4) 1 UI / l soro Notar que no tubo B se adicionou um volume diferente do mesmo soro. Porque a velocidade de reacção observada em B era metade da observada em A quer dizer que em B havia metade do número de moles da enzima E. u seja, em B o volume de soro era,5 l. 27 Quando se doseiam enzimas numa preparação que a contém (usando a actividade como medida da quantidade de enzima) pressupõe-se que a actividade ( ) é proporcional à quantidade de enzima. Pâncreas inflamado liberta amílase para o sangue Em química clínica doseiam-se com frequência enzimas no soro (por exemplo a amílase do soro em situações em que se suspeita de pancreatite aguda) exprimindo o resultado do ensaio enzimático em velocidade de reacção / volume de soro sanguíneo Porque as condições de ensaio (concentração e natureza dos substratos, ph, natureza do tampão, temperatura, etc.) podem não ser iguais em dois laboratórios distintos os valores normais de um laboratório podem não ser iguais aos de outro laboratório. 1 mol de glicose é 1 mol de glicose em qualquer sítio do mundo mas 1 UI de amílase (ou outra enzima qualquer) em dois laboratórios 28 distintos pode significar diferentes quantidades de enzima.
8 A actividade enzímica aumenta se o número de moléculas de enzima aumentar (e vice-versa). doseamento de uma enzima em tecidos pode servir para estudar o efeito de hormonas na síntese dessa enzima. A insulina inibe a expressão de genes que codificam enzimas envolvidas na produção de glicose como, por exemplo, o gene da glicose-6-fosfátase. Glicose-6-P Porquê expressar actividade em UI / massa de tecido (ou UI / mg de proteína)? Permite comparar dois ensaios enzímicos em que se usam concentrações de enzima distintas... 2 mg de fígado Homogeneizado de fígado 1 mg de fígado 2 mol/min = 2UI 2 mol / 2min = 1UI o número de moléculas de glicose-6-29 fosfátase aumenta pela razão oposta. Glicose-6- fosfátase no fígado Voice et al. (1992) BST 2:272S Quando há muita insulina o número de moléculas de glicose-6-fosfátase diminui porque diminui a transcrição do seu gene. Quando há pouca insulina 2 UI 2 mg de fígado Actividade específica = 1 UI / mg de fígado 1 UI 1 mg de fígado Actividade específica = 1 UI / mg de fígado 3 Quando se doseia uma enzima necessitamos de um meio de ensaio que contém obrigatoriamente o substrato (ou substratos) da enzima...mas em diferentes laboratórios podem usar-se diferentes temperaturas de ensaio. 2ºC 7ºC Aumentar a temperatura aumenta a velocidade das reacções incluindo a velocidade de desnaturação das enzimas. Para dosear uma enzima, para além da temperatura, também se escolhem outras condições de ensaio como, por exemplo, o ph do meio de ensaio. Quando doseamos uma enzima costuma escolher-se para ph de ensaio um valor próximo do ph óptimo dessa enzima. Se numa amostra de tecido existirem duas enzimas que catalisem a mesma reacção mas essas enzimas tiverem phs óptimos distintos posso, escolhendo o ph de ensaio, estudar uma ou outra dessas enzimas. exemplo da figura indica que se se pretendesse dosear a enzima em questão poderia ser 31mais cómodo escolher para temperatura de ensaio 3ºC... ph 7 favorece isoenzima vermelha ph 1 favorece isoenzima azul 32
9 Para dosear uma enzima, para além da temperatura e do ph, também se escolhe a concentração do substrato. Eventualmente podemos fazer vários ensaios usando diferentes concentrações do substrato. A actividade de uma enzima aumenta com a concentração de substrato......mas para concentrações altas (saturantes) aumentar a concentração de substrato praticamente não afecta a actividade. Considerar apenas um substrato é uma simplificação (estritamente só as isomérases têm um substrato)...mas podem fixar-se as concentrações dos outros substratos e estudar-se como varia a actividade ( )... em função da variação da concentração de um deles. 33 = k cat A actividade é proporcional à quantidade de complexo ES no meio de ensaio (k cat é a constante de proporcionalidade) Para diferentes enzimas o aspecto do gráfico actividade versus S... pode ser hiperbólico ou sigmoide... mas a característica saturabilidade está sempre presente. 34 Num grande número de enzimas o gráfico versus [S] tem o aspecto de uma hipérbole que se ajusta à equação de Michaelis-Menten V S max Km S As enzimas com cinéticas de tipo hiperbólico são aquelas em que o gráfico versus [S] pode ser ajustado a uma equação do tipo V max Km S S... sendo que Vmax e Km são constantes (...se a única condição de ensaio que varia é [S]) 35 Numa reacção enzímica existe um ciclo catalítico em que da ligação entre a enzima livre e o substrato resulta a formação do complexo ES; o complexo ES pode dissociar-se mas também vai formando produto e regenerando enzima livre. Num ensaio enzímico enquanto a concentração de substrato não baixar de forma significativa a concentração do complexo ES vai-se mantendo numa concentração estacionária. valor da concentração estacionária de ES depende (1) da concentração de enzima, (2) da concentração de substrato e (3) da afinidade entre a enzima e o seu substrato. k cat A velocidade de formação do produto é proporcional à concentração do complexo ES (M/min) = k cat [ES] (mol/min) = 36 k cat [ES] x vol. meio de ensaio
10 Actividade ou v ou =k cat [ES] = k cat [Etotal]/2 = Vmax/2 Se não há substrato [ES] = V inicial = Existe uma concentração de substrato (= Km) em que metade das moléculas de enzima estão ligadas ao substrato (enzima hemisaturada) [ES] = [E] [ES] = [Etotal]/2 concentração de substrato = Km Se a concentração de substrato é elevada quase todas as moléculas de enzima estão ligadas ao substrato [ES] [Etotal] k cat [Etotal] Vmax concentração de substrato é saturante 37 Se [S] < K m é quase proporcional a [S]...e menos de metade das moléculas de enzima estão ligadas ao substrato A actividade enzímica para concentração saturante de substrato = V max... se a concentração de substrato é elevada variações moderadas na concentração do substrato não afectam a actividade para dosear enzimas é frequente usarem-se concentrações elevadas de substrato porque o gráfico produto formado versus tempo se mantém linear durante mais tempo. Se [S] = K m = V max / 2...e a enzima está hemisaturada 38 A partir da equação v Vmax Km S S Km é uma medida da afinidade da enzima para o seu substrato...quando maior o valor do Km menor a afinidade (e vive-versa)....pode deduzir-se o valor de v para determinadas concentrações de substrato. v Km >> v V max Km [S] S S... se Km>>[S] denominador Km [S] = Km Km << [S] V S v Vmax v max S S Km S S... se Km<<[S] denominador [S] Vmax S v S v VmaxS v Vmax S 2 S Km v é directamente proporcional a [S] para baixas concentrações de S... se Km=[S] denominador =2 [S] V v 2 max V max v não é afectado por 39[S] para altas concentrações de S Km A enzima azul precisa de uma concentração de substrato menor para ficar hemisaturada......porque tem maior afinidade para o substrato que a enzima cinzenta. Em ambos os casos a enzima está hemisaturada mas Km (no caso da enzima azul) < Km (no caso da enzima cinzenta) Brincando: o Km mede o desamor entre a enzima e o seu substrato Km 4
11 Km mede a afinidade da enzima para o seu substrato...quando maior o valor do Km menor a afinidade. A enzima azul já está hemisaturada ([ES]=[Et]/2) quando [S]= 3 mm (Km = 3 mm) tem alta afinidade para o substrato Vmax1=Vmax2 (mm) A enzima cinzenta está hemisaturada ([ES]=[Et]/2) quando [S]= 1 mm (Km = 1 mm) tem baixa afinidade para o substrato 41 Quando se estuda o efeito da concentração de substrato na actividade de algumas enzimas e se representa versus [S] o gráfico pode ser não uma hipérbole mas um sigmóide. As teorias actualmente mais aceites para interpretar este tipo de comportamento cinético surgiram na década de 6 e visavam interpretar um fenómeno semelhante: a forma sigmoide do gráfico de saturação da hemoglobina. Essas teorias revelaram-se adequadas para interpretar as cinéticas de tipo sigmoide em enzimas com mais de um local de ligação ao substrato por molécula de enzima (enzimas poliméricas). v V S max h 5 h S S h ; h = coeficiente de Hill 42 Quando o gráfico velocidade de reacção (ou velocidade de transporte transmembranar) versus concentração de reagente (ou substância transportada) é uma recta indica-nos que o processo reactivo (ou de transporte) é não enzímico (ou não mediado). Velocidade de reacção ou transporte transmembranar Processo não catalisado; saturabilidade ausente Processos reactivos (ou de transporte) catalisados por enzimas (ou transportadores); saturabilidade presente Concentrações de glicose possíveis no hepatócito A actividade das enzimas pode ser diminuída ou aumentada pela adição ao sistema de ensaio de modificadores da actividade enzímica (inibidores e activadores). Adicionando a um meio de ensaio uma substância M (inibidor ou activador) e mantendo constantes todas as outras condições de ensaio podemos obter diminuição (inibição) ou aumento (activação) da actividade enzímica. na ausência de inibidor = 1 UI = 3 UI Grau de inibição = 3% Actividade enzímica } v o +inibidor v o{ +activador A comparação entre o valor do Km (ou S 5 ) e a concentração estacionária (in vivo) do substrato numa enzima (ou num transportador) diz-nos se a enzima (ou o transportador) 43 é ou não sensível a variações fisiológicas na concentração de substrato. Grau de inibição ou grau de activação = v inicial vinicial na ausência de M 44
12 Um estudo mais aprofundado do efeito de um inibidor na actividade duma enzima pode revelar que ele aumenta o K m do substrato sem modificar V max. Quando se estuda a actividade enzímica para vários valores de S podemos, multiplicando o número de tubos de ensaios, fazer esse estudo: na ausência e na presença de um inibidor I. Algumas vezes observa-se que: 1- Na presença do inibidor o valor de V max não se modifica; para concentrações de substrato elevadas o inibidor I não tem efeito. 2- valor do K m observado é maior na presença de I que na sua ausência; o grau de inibição é mais marcado para concentrações de substrato baixas. Nestes casos falamos de inibição competitiva Para [S] = 4 grau inibição = 14 % Para [S] = saturante grau inibição = % Para [S] = 4 grau inibição =5% 45 Para explicar o comportamento deste sistema (I aumento do K m mas I não afecta V max ) poderemos admitir que o inibidor I e o substrato S se ligam no centro activo da enzima competindo entre si. As possibilidades do modelo apresentado corresponderem à realidade são reforçadas se as estruturas moleculares do substrato e do inibidor forem semelhantes. Nestes casos há inibição isostérica competitiva H 2 A fosfátase alcalina catalisa a hidrólise do para-nitrofenilfosfato: para-nitrofenilfosfato + H 2 para-nitrofenol + Pi vanadato é um inibidor competitivo 46 da fosfátase alcalina. Quando um inibidor isostérico competitivo está presente, para obter hemisaturação da enzima com substrato, preciso de ter maior concentração do substrato; a presença do inibidor aumenta o Km. vanadato é um inibidor competitivo da fosfátase alcalina = eleva o Km do para-nitrofenilfosfato mas não tem efeito no Vmax. Se a concentração de substrato for suficientemente alta compete eficazmente como o inibidor. Vmax sem vanadato Vmax/2 vanadato 2,5 M Na ausência de inibidor esta concentração de substrato permitia hemisaturação. Km era 9. Mas na presença do inibidor para esta concentração de substrato só 1/6 das moléculas de enzima estão ligadas ao substrato. Na presença do inibidor competitivo preciso de aumentar a concentração de substrato para 32 para obter hemisaturação com o substrato. Na presença do inibidor 47 o Km (que era 9) aumentou para 32. Km (sem vanadato) =1,1 mm Km (com vanadato) =7,6 mm Seargeant & Stinson (1979) Biochem J. 181: 247. Quando adicionado a meios de ensaio que contenham para-nitrofenilfosfato e fosfátase alcalina, o vanadato (HV 2-4 ), inibe a actividade da enzima quando a concentração de para-nitrofenilfosfato não é saturante 48 = a inibição é de tipo competitivo.
13 Quando se estuda de efeito de um inibidor para diferentes concentrações de substrato podemos, eventualmente, observar que a inibição não é de tipo competitivo. Algumas vezes observa-se que: 1- V max é menor na presença de I que na sua ausência. 2- Na presença de I o K m não se modifica; a concentração de substrato para a qual se observa um valor de actividade que é metade de V max (ou de V max ) é igual na presença e na ausência de I. Um modelo possível para explicar a inibição de tipo não competitivo é admitir a existência na enzima de um local de ligação diferente do centro activo (um sítio alostérico) cuja ligação ao inibidor impedisse a formação do produto. km1 Km1= Km2 km2 kcat1 Kcat2 = 3- grau de inibição é independente da concentração de substrato. No exemplo o grau de inibição = 4% para todas as concentrações de substrato Nestes casos diz-se que a inibição é não competitiva. 49 De acordo com o modelo (garantindo Km invariante) a afinidade entre a enzima e o substrato é igual nos casos da forma ligada e desligada do inibidor. De acordo com este modelo tudo se passaria como se as moléculas de enzima ligadas ao inibidor estivessem excluídas do processo catalítico, isto é, como se houvesse menos moléculas de enzima no meio de ensaio. 5 Um ligando diferente do substrato que se liga ao centro activo é um inibidor isostérico (se se liga no centro activo só pode inibir). Se a ligação entre um inibidor isostérico e o centro activo for reversível (se poder se deslocado pelo substrato) esse inibidor comporta-se funcionalmente como inibidor competitivo... mas se a ligação do inibidor ao sítio activo for irreversível (não podendo ser deslocado por altas concentrações de substrato) as moléculas de enzima ligadas ao inibidor ficam excluídas do processo catalítico. A lípase pancreática catalisa a hidrólise de triacilgliceróis no intestino. No tratamento da obesidade pode usar-se um fármaco (orlistat; xenical) que é um inactivador (= inibidor irreversível) da lípase pancreática. Neste caso o inibidor comporta-se funcionalmente como não competitivo e é, frequentemente, orlistat reage com uma serina (formando uma ligação covalente e irreversível) situada no centro activo da enzima usado o termo inactivador bloqueando a sua actividade.
14 No estudo in vitro de enzimas reguladas por fosforilação/desfosforilação podem usar-se inibidores das cínases e das fosfátases envolvidas. doseamento da actividade da desidrogénase do piruvato pode ser feito em homogeneizados. Se o homogeneizado é preparado na presença de inibidores quer da cínase (dicloroacetato) quer da fosfátase (fluoreto)...quando se faz o ensaio mede-se a actividade actual. Se o homogeneizado é preparado na presença do inibidor da cínase (dicloroacetato) mas na ausência de fluoreto...quando se faz o ensaio mede-se a actividade total. Na ausência de inibidor (fluoreto), a fosfátase do tecido transforma toda a desidrogénase do piruvato na sua forma activa. Pi H 2 fluoreto P ADP Dicloroacetato ATP 53 Bibliografia utilizada: 1. Rakus, D., Maciaszczyk, E., Wawrzycka, D., Ulaszewski, S., Eschrich, K. & Dzugaj, A. (25) The origin of the high sensitivity of muscle fructose 1,6- bisphosphatase towards AMP, FEBS Lett. 579, Sugden, M. C. & Holness, M. J. (26) Mechanisms underlying regulation of the expression and activities of the mammalian pyruvate dehydrogenase kinases, Arch Physiol Biochem. 112, Veiga-da-Cunha, M., Courtois, S., Michel, A., Gosselain, E. & Van Schaftingen, E. (1996) Amino acid conservation in animal glucokinases. Identification of residues implicated in the interaction with the regulatory protein, J Biol Chem. 271, Jeukendrup, A. E. (22) Regulation of fat metabolism in skeletal muscle, Ann N Y Acad Sci. 967, Sterk, J. P., Stanley, W. C., Hoppel, C. L. & Kerner, J. (23) A radiochemical pyruvate dehydrogenase assay: activity in heart, Anal Biochem. 313, Voet, D. & Voet, J. G. (24) Biochemistry, 3rd edn, John Wiley and Sons, Inc., USA. 7. Nelson, D. L. & Cox, M. M. (25) Lenhinger principles of biochemistry, 4ª edn, New York. 8. Thorens, B. (1996) Glucose transporters in the regulation of intestinal, renal, and 54 liver glucose fluxes, Am J Physiol. 27, G
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