Rui Fontes. O sentido das reacções de oxi-redução e a fosforilação oxidativa

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1 Rui Fontes O sentido das reacções de oxi-redução e a fosforilação oxidativa Porto 2005

2 Índice 1. As tabelas de potencial redox dos bioquímicos não são iguais às dos químicos porque são diferentes as condições de reacção convencionadas nos dois casos O potencial redox padrão de um determinado par redox é uma medida da estabilidade termodinâmica da forma reduzida relativamente à forma oxidada desse par A diferença de potencial padrão é a diferença de potencial entre eléctrodos construídos com base nesses pares quando as condições são aquelas que se convencionaram como padrão A diferença de potencial padrão entre dois pares redox é uma medida da Keq da reacção em que intervêm esses pares redox A diferença de potencial entre dois pares redox só coincide com a diferença entre os potenciais padrão quando as condições efectivas coincidem com as que se convencionaram como padrão A energia de Gibbs associada a um processo reactivo concreto é uma medida da razão entre a Keq e o QR As enzimas e os transportadores de membrana funcionam muitas vezes como acopladores de processos exergónicos ( G<0) e endergónicos ( G>0) possibilitando a ocorrência destes últimos Reacções de oxidação-redução exergónicas podem estar acopladas a processos de transporte contra-gradiente electroquímico através da acção catalítica de enzimas/transportadores O transporte de iões a favor do gradiente (exergónico) pode estar acoplado a reacções químicas endergónicas através da acção catalítica de enzimas/transportadores Tal como as outras enzimas as enzimas/transportadores são apenas catalisadores e não determinam o sentido em que o processo ocorre Este texto foi escrito por Rui Fontes em Dezembro de 2000 tendo-o revisto em Novembro de Os autor agradece todas as críticas que queiram fazer-lhe. Página 2 de 9

3 1. As tabelas de potencial redox dos bioquímicos não são iguais às dos químicos porque são diferentes as condições de reacção convencionadas nos dois casos. O valor da diferença entre os potenciais de oxiredução padrão de dois pares oxidante/redutor permite calcular a constante de equilíbrio relativamente à reacção de oxiredução em que intervêm esses dois pares e, conhecida a constante de equilíbrio e o QR, é possível deduzir o sentido em que a reacção tem tendência a evoluir. Exemplos concretos permitem compreender melhor este problema e por isso copiamos de um livro de texto (Voet and Voet; Biochemistry) a tabela I onde se mostram os potenciais de oxiredução (ou redox) padrão (Eº ) de uma série seleccionada de pares redox. Tabela I: Semi-reacção Eº (Volt) ½ O e H + H 2 O + 0,815 Cyt c (Fe 3+ ) + e- Cyt c (Fe 2+ ) +0,254 Q + 2H e- QH2 +0,045 Oxalacetato + 2H e- malato -0,166 Piruvato + 2H e- lactato -0,185 NAD e - + H + NADH -0,315 Escrevemos Eº e não Eº porque esta tabela foi construída tendo em conta resultados experimentais obtidos com soluções com ph fixado e igual a 7 e não a ph 0. As tabelas de potenciais de oxiredução dos bioquímicos (Eº ) são diferentes das dos químicos (Eº) porque é diferente o ph das soluções a que é suposto ocorrerem as reacções de oxidação-redução a que dizem respeito. 2. O potencial redox padrão de um determinado par redox é uma medida da estabilidade termodinâmica da forma reduzida relativamente à forma oxidada desse par. O potencial de oxiredução padrão de um determinado par redox é uma medida da estabilidade termodinâmica relativa das duas formas oxidada e reduzida: quanto maior o seu valor maior a estabilidade da forma reduzida relativamente à forma oxidada desse par. O oxigénio é um potente oxidante porque tem tendência a oxidar outras substâncias: o oxigénio tem tendência a reduzir-se, recebendo electrões dessas outras substâncias. Dito de outra maneira: comparativamente com outros pares redox, no par ½ O 2 /H 2 O, a forma reduzida (H 2 O) é muito estável relativamente à forma oxidada (O 2 ) e o potencial redox padrão do par ½ O 2 /H 2 O é muito elevado (Eº =0,815 Volts). Pelo contrário, e no outro extremo da tabela I, no caso do par NAD + /NADH a forma mais estável é a forma oxidada (NAD + ) e é o NADH que tem tendência a reduzir outras substâncias cedendo electrões. O baixo potencial redox padrão do par NAD + /NADH (Eº = - 0,315 Volts) reflecte a maior estabilidade da forma oxidada. Por consulta directa da tabela I podemos, de forma imediata, deduzir que a tendência para a redução do oxigénio é muito maior que a tendência para a redução do NAD + e também que a Página 3 de 9

4 tendência para a redução do piruvato é superior à do NAD +. Dito com mais rigor: podemos deduzir que as reacções em que o oxigénio oxida o NADH 1/2 O 2 + NADH H 2 O + NAD + (1) ou o piruvato oxida o NADH piruvato + NADH lactato + NAD + (2) têm constantes de equilíbrio de valor superior a 1 e que, consequentemente, se o QR for, por exemplo, de valor 1, evoluem no sentido indicado. 3. A diferença de potencial padrão é a diferença de potencial entre eléctrodos construídos com base nesses pares quando as condições são aquelas que se convencionaram como padrão. A diferença de potencial de oxiredução padrão entre dois pares redox também nos permite deduzir o valor do potencial gerado numa pilha construída com base nesses pares. O valor do potencial da pilha é igual à diferença entre os potenciais padrão se as condições são padrão: 25ºC e as concentrações dos compostos intervenientes na reacção e em solução com excepção da concentração da água e dos protões são unitárias (1 atm para gases e 1 M para substâncias solúveis). Numa pilha hipotética, com o ph fixado e de valor 7, em que num dos eléctrodos borbulha oxigénio (com a pressão de uma atmosfera) e no outro eléctrodo estão, a igual concentração (1M), NAD + e NADH a diferença de potencial seria de +1,13 V [= +0,815 (- 0,315)] sendo o eléctrodo de oxigénio positivo e o de NAD + /NADH negativo. Os electrões movimentar-se-iam nestas condições na direcção do eléctrodo de oxigénio ou seja, neste eléctrodo (cátodo) ocorreria a redução do oxigénio e no outro (ânodo) o NADH oxidar-se-ia com formação de NAD +. De igual modo a diferença de potencial de uma pilha construída com base nos pares piruvato/lactacto e NAD + /NADH em que todos os reagentes e produtos estivessem presentes e tivessem concentrações de 1 M seria (-0,185-(-0,315)) +0,13 V e os electrões fluiriam na direcção do eléctrodo correspondente ao par piruvato/lactato. Ignorando as reacções ácido-base (o ph foi fixado em 7) as reacções de oxiredução em questão são descritas pelas equações (1) e (2). Em condições padrão, com excepção da água, dos protões e de substâncias no estado sólido que não entram na definição da Keq e do QR, as concentrações dos reagentes e produtos são unitárias e o QR é consequentemente igual a 1. A reacção evolui no sentido indicado nas equações (1) e (2) porque a constante de equilíbrio é superior a A diferença de potencial padrão entre dois pares redox é uma medida da Keq da reacção em que intervêm esses pares redox. Existe uma relação entre a constante de equilíbrio e a diferença entre o potencial redox padrão dos pares redox intervenientes na reacção em análise. Essa relação é conhecida como equação de Nernst: RT Eº ' = lnkeq (3) nf Eº = diferença de potencial para condições padrão (25 ºC; ph 7; conc. de reagentes e produtos em solução com concentração de 1M ou 1 atm) R= constante dos gases perfeitos = 8,314 J K -1 mol -1 T= temperatura absoluta (K) n= número de moles de electrões transferidos na reacção considerada. F= constante de Faraday (carga de um mole de electrões) = C mol -1 Página 4 de 9

5 Numa determinada reacção de oxiredução (a temperatura constante) a diferença de potencial padrão entre os pares redox envolvidos é directamente proporcional ao ln da Keq. A curva que relaciona a diferença de potencial (em abcissas) com a Keq (em ordenadas) é uma exponencial com a concavidade voltada para cima e cruza o eixo das ordenadas no ponto (0,1); quando a diferença de potencial é zero a Keq=1. Considerando uma temperatura de 25ºC (298 Kelvin) e ph 7 é possível com base nos valores da tabela I deduzir as constantes de equilíbrio para reacções de enorme importância biológica (ver tabela II). Tabela II: reacções de oxiredução Enzima Eº' Keq 1/2 O 2 + NADH H 2 O + NAD + Cadeia respiratória 1,13 1,7* atm -1/2 piruvato + NADH lactato + NAD + Desidrogénase 0,13 2,5*10 +4 láctica Oxalacetato + NADH malato + NAD + Desidrogénase do 0,149 1*10 +5 malato 1/2 O Cyt c (Fe 2+ ) H 2 O + 2 Cyt c Complexo IV 0,561 9,5* atm -1/2 (Fe 3+ ) 2 Cyt c (Fe 3+ ) + QH 2 2 Cyt c (Fe 2+ ) + Q Complexo III 0,209 11,8*10 +6 Q + NADH QH 2 + NAD + Complexo I 0,36 1,51* Porque escrevemos as reacções considerando o sentido em que a forma oxidada do par redox com potencial superior oxida a forma reduzida do par com potencial redox inferior os valores das Keq são todos superiores a 1. Quanto maior a diferença de potencial entre os pares redox envolvidos maior a Keq. A ordem de grandeza da Keq da reacção de oxidação do NADH pelo oxigénio indica-nos que só se atinge o equilíbrio quando o reagente limitante está praticamente esgotado e que a reacção de sentido contrário não existe. No entanto, apesar de o valor da Keq parecer indicar irreversibilidade no processo reactivo oxalacetato + NADH malato + NAD + (ciclo de Krebs) os valores das concentrações dos compostos envolvidos pode, na célula, ser tal que o QR seja superior a 1*10 +5 e a reacção pode, em condições fisiológicas, evoluir no sentido inverso ao indicado. Uma situação semelhante acontece no caso da reacção piruvato + NADH lactato + NAD +. Na célula a concentração de NAD + é, normalmente, cerca de 1000 vezes superior à de NADH mas esta razão pode sofrer variações. A existência de variações fisiológicas na razão NAD + /NADH ajuda a compreender que as duas últimas reacções sejam fisiologicamente reversíveis. Se, por qualquer motivo, a concentração de NADH aumenta (com a correspondente diminuição na concentração de NAD + ) o QR das reacções em que estes compostos intervêm pode modificar-se de tal forma que podem passar a evoluir em sentido inverso àquele que uma consulta simplista e acrítica da tabela I parece indicar. Numa dada reacção, um valor de Eº positivo (diferença de potencial positiva para condições padrão) não nos assegura por si só que a reacção tenha tendência a evoluir, num sistema concreto, no sentido da redução da forma oxidada do par com potencial de oxiredução mais elevado e com oxidação da forma reduzida do par com potencial de oxiredução mais baixo. Um valor de Eº (padrão) positivo significa, simplesmente, que a Keq relativa à reacção em que a forma oxidada do par com potencial de oxiredução mais elevado (O 2 por exemplo) oxida a forma reduzida do par com potencial de oxiredução mais baixo (NADH por exemplo) tem um valor superior a 1. A reacção terá, obviamente, tendência a evoluir no sentido inverso se o valor da QR for superior ao da Keq. Página 5 de 9

6 5. A diferença de potencial entre dois pares redox só coincide com a diferença entre os potenciais padrão quando as condições efectivas coincidem com as que se convencionaram como padrão. A equação de Nernst pode ser reescrita para incorporar a informação relativa às concentrações (ou melhor seria dizer as actividades) dos compostos que participam na reacção de oxiredução num sistema concreto, ou seja, o QR: RT Keq E'= ln (4) nf QR Esta equação permite calcular a diferença de potencial real ( E ), a diferença de potencial que tem em conta o QR; o valor de E respeitante às condições concretas em que um determinado sistema reactivo se encontra só excepcionalmente coincidirá com as condições que se convencionaram como padrão. O sinal de E é função da razão Keq/QR: i) positivo se Keq>QR; a reacção tem tendência a evoluir no sentido directo. ii) zero se Keq=QR; reacção em equilíbrio. iii) negativo se Keq<QR; a reacção tem tendência a evoluir no sentido inverso. No caso concreto da reacção de oxidação do NADH (½ O 2 + NADH H 2 O + NAD + ) se admitirmos que na célula a razão [NAD + ]/[NADH] 1000 e que a pressão parcial de O atm podemos estimar E como sendo +1,03 V e a razão Keq/QR como sendo 5,4 X Notar que, como já referido, E só coincide com Eº quando o QR = A energia de Gibbs associada a um processo reactivo concreto é uma medida da razão entre a Keq e o QR. Independentemente do tipo de reacção, as reacções evoluem no sentido que se pode predizer se conhecermos a razão Keq/QR e esta razão relaciona-se com a energia livre (ou de Gibbs) envolvida no processo reactivo pela equação de Gibbs. Keq G = RT ln (5) QR Numa dada reacção A P a energia de Gibbs é negativa sempre que a Keq>QR; ou seja, todas as reacções reais têm energia de Gibbs negativa. Quando a energia de Gibbs é positiva quer-se, simplesmente, dizer que a reacção só pode evoluir em sentido inverso ao indicado, isto é, que só pode evoluir no sentido P A. Consideremos, como exemplo, a reacção de fosforilação de uma aceitador A pelo ATP: ATP + A A-P + ADP. A energia livre (ou de Gibbs) da reacção diz-se negativa ( G<0) quando a reacção tende a evoluir (Keq>QR) no sentido da transferência de fosfato do ATP para A. Admitindo que na reacção de fosfotransferência do ATP para A a Keq>QR, porque a energia de Gibbs é negativa, a reacção diz-se exergónica. Para um mesmo valor de QR a reacção inversa diz-se endergónica e não existe. É, no entanto, possível, pelo menos a nível conceptual, desdobrar a reacção em análise como o somatório de duas reacções: a de hidrólise do ATP em ADP + Pi e uma reacção de condensação de A com o Pi e concomitante libertação de H 2 O. A reacção de hidrólise de um mole de ATP é nas condições de concentrações de ATP, ADP e Pi existente nas células altamente exergónica ( G -50 KJ) enquanto que as reacções de condensação como a referida (A + Pi A-P) são endergónicas ( G>0). Podemos então afirmar que uma reacção exergónica (a hidrólise do ATP) forneceu a energia necessária para que uma reacção endergónica (a condensação de A com o Pi) tivesse lugar. A energia de Gibbs da reacção de transferência de fosfato do ATP para A é o somatório das energias de Gibbs das duas reacções consideradas; a reacção pode ocorrer porque a energia associada à hidrólise do ATP é negativa e de valor absoluto superior à que está associada ao processo de formação de A-P. Página 6 de 9

7 No caso concreto das reacções redox a combinação das equações (4) e (5) permite deduzir uma equação que relaciona E com o G: G = nf E' (6) 7. As enzimas e os transportadores de membrana funcionam muitas vezes como acopladores de processos exergónicos ( G<0) e endergónicos ( G>0) possibilitando a ocorrência destes últimos. O acoplamento de processos endergónicos com processos exergónicos é geral e as máquinas que, nos seres vivos, fazem esse acoplamento, são as enzimas e/ou os transportadores de membrana. De facto os conceitos de enzimas e transportadores confundem-se: (1) a ATPase do Na + /K + catalisa a hidrólise do ATP e o transporte de Na + e K + contra gradiente, (2) os complexos proteicos I, III e IV da cadeia respiratória catalisam, no seu conjunto, a oxidação do NADH pelo O 2 e o transporte de protões contra gradiente e (3) a síntase do ATP da membrana interna da mitocôndria catalisa a síntese de ATP (a partir de ADP e Pi) e o transporte de protões a favor de gradiente. 8. Reacções de oxidação-redução exergónicas podem estar acopladas a processos de transporte contra-gradiente electroquímico através da acção catalítica de enzimas/transportadores. Na membrana interna da mitocôndria existem enzimas/transportadores capazes de catalisar a oxidação do NADH pela coenzima Q (complexo I: NADH + Q NAD + + QH2), da coenzima Q pelo citocromo c (complexo III: 2 Cyt c (Fe 3+ ) + QH 2 2 Cyt c (Fe 2+ ) + Q) e do citocromo c pelo oxigénio (complexo IV: 1/2 O Cyt c (Fe 2+ ) H 2 O + 2 Cyt c (Fe 3+ )). Estas reacções redox são exergónicas mas os complexos proteicos I, III e IV também são transportadores de protões através da membrana interna da mitocôndria e a reacções de oxiredução são indissociáveis do processo de transporte. Admite-se actualmente que a reacção catalisada pelo complexo I (2 electrões transferidos do NADH para a coenzima Q) está acoplada com o bombeamento de 4 protões da matriz da mitocôndria para o citosol. Nos casos dos complexos III e IV o número de protões expulsos por par de electrões transferidos entre os pares redox envolvidos não é tão simples de explicar. No caso do complexo III quando um mole de QH2 reduz dois moles de citocromo c há 2 protões que desaparecem na matriz e 4 que aparecem no citosol. No caso do complexo IV quando dois moles de citocromo c reduzem um ½ O 2 a H 2 O há 4 protões que desaparecem na matriz e 2 que aparecem no citosol. O somatório da actividade dos três complexos mostra que à transferência de 2 electrões entre o NADH e o oxigénio corresponde o transporte de 10 protões da matriz para o citosol. O bombeamento de protões é o responsável pela criação de um gradiente electrónico (cargas positivas na face externa da membrana mitocondrial interna) e químico (maior concentração de protões no espaço extramitocôndrico) e o processo oxidativo (processo exergónico) está acoplado com o transporte de protões contra gradiente electroquímico (processo endergónico). Estima-se que, na mitocôndria, a diferença de potencial entre as faces matricial (negativo) e externa (positivo) da membrana interna seja de cerca de 0,15 V. O transporte de um mole de Página 7 de 9

8 cargas positivas contra este gradiente eléctrico (por exemplo um mole de protões de dentro para fora) equivale ao consumo de 14,4 KJ ( G = E * Z * F; Z = carga do ião transportado). Também se estima que a diferença entre o ph da matriz (mais alcalino) e do espaço intermembranar (mais ácido) possa ser de cerca de 0,75 unidades. No que se refere à concentração de protões o sistema estaria em equilíbrio se os phs fossem idênticos. A energia consumida para transportar um mole de protões contra este gradiente químico (supondo que não há gradiente eléctrico) pode calcular-se usando a equação (7) obtendo-se um valor de 4,5 KJ. + [ H ] fora G = RT ln (7) + [ H ]dentro Pode assim admitir-se que a energia despendida no transporte de um mole de protões contra o gradiente electroquímico (eléctrico e químico) existente na mitocôndria seja de cerca de 19 KJ ( 14,4 + 4,5). Assim, o transporte de 10 protões pelos complexos I, III e IV consumiria algo como 190 KJ. Podemos interrogar-nos se a energia associada à oxidação de um mole de NADH pelo oxigénio pode fornecer a energia suficiente para o processo. Se nas condições da célula o E associado à transferência de 2 electrões entre o NADH e o oxigénio é de +1,03 V (ou Keq/QR = 5,4 X ) a aplicação das equações (5) e (6) permite calcular G como sendo -193 KJ. De acordo com estas estimativas podemos concluir que a energia libertada na oxidação de um mole de NADH pelo oxigénio (processo exergónico; G = -193 KJ) fornece a energia suficiente para que, nas condições da mitocôndria, 10 moles de protões sejam transportados contra gradiente electroquímico (processo endergónico; G = KJ). Os dois processos estão acoplados pelos complexos proteicos da cadeia respiratória e constituiriam, no seu conjunto, um processo exergónico ( G = -3 KJ); ou seja, as estimativas que efectuamos estão de acordo com a possibilidade de o transporte de electrões na cadeia respiratória ser o responsável pela criação do gradiente electroquímico. No caso da oxidação do succinato a reacção é catalisada por uma desidrogénase (desidrogénase do succinato ou complexo II) que contém FAD como grupo prostético e que cede directamente os electrões à coenzima Q. Neste caso o número de protões bombeados é menor porque o complexo I não está envolvido no processo. Página 8 de 9

9 9. O transporte de iões a favor do gradiente (exergónico) pode estar acoplado a reacções químicas endergónicas através da acção catalítica de enzimas/transportadores. A síntese de ATP (ADP + Pi ATP + H 2 O) é um processo endergónico catalisado pela síntase de ATP, uma proteína da membrana da mitocôndria. A síntase de ATP é também um transportador de protões e os dois processos são também indissociáveis. O fluxo de protões a favor de gradiente electroquímico (de fora para dentro) é um processo exergónico que está acoplado com a síntese de ATP (processo endergónico) pela síntase do ATP. Admite-se (embora seja incerto) que para que a síntese de um mole de ATP tenha lugar 3 protões são transportados a favor de gradiente de fora para dentro da mitocôndria. Usando o valor de 19 KJ por mole de protões como o da energia libertada no processo de transporte (a favor do gradiente electroquímico) através da membrana interna da mitocôndria o G correspondente ao transporte de 3 protões seria de 57 KJ. Se, nas condições da célula, à hidrólise de 1 mole de ATP corresponde um G de -50 KJ, no processo de síntese a partir de ADP e Pi (a reacção inversa) o G = +50 KJ. No processo acoplado de transporte de 3 protões a favor de gradiente electroquímico e de síntese de 1 mol de ATP o G seria, de acordo com estas estimativas, de 7 KJ (exergónico). 10. Tal como as outras enzimas as enzimas/transportadores são apenas catalisadores e não determinam o sentido em que o processo ocorre. Os transportadores/enzimas catalisam o transporte de substâncias através de membranas e catalisam reacções químicas mas, tal como as enzimas, não determinam o sentido em que o processo ocorre. Foi por exemplo demonstrado que, em condições adequadas, a síntase de ATP das mitocôndrias pode funcionar em sentido inverso ao apontado acima. Numa preparação de mitocôndrias em que se fez baixar o valor do gradiente electroquímico mantendo no interior uma razão [ATP]/([ADP] [Pi]) elevada a síntase de ATP funciona como hidrólase de ATP e bombeia protões da matriz para o citosol. Página 9 de 9