Aula de Bioquímica Avançada. Fosforilação Oxidativa

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1 Aula de Bioquímica Avançada Tema: Fosforilação Oxidativa Cadeia transportadora de elétrons Prof. Dr. Júlio César Borges Depto. de Química e Física Molecular DQFM Instituto de Química de São Carlos IQSC Universidade de São Paulo USP borgesjc@iqsc.usp.br

2 Representa o fim das rotas metabólicas de produção de energia em organismos aeróbicos - Representa o estágio 3 do processo Acoplamento da oxidação de NADH e FADH 2 e síntese de ATP - É o principal sítio de produção de ATP em organismos aeróbicos não fotossintetizantes - Envolve o consumo de O 2 e formação de H 2 0 Envolve a teoria Quimiosmótica proposta por Peter Mitchel 1961 Amplamente amparada experimentalmente Nobel Prize Winner, 1978, Chemistry

3 Teoria Quimiosmótica - Fluxo de elétrons por carreadores criam um gradiente de concentração de prótons na membrana mitocondrial - A quebra deste gradiente está acoplada com a síntese de ATP

4 LOCAL: MITOCÔNDRIA - Organela de eucariotos Possui duas membranas Membrana Mitocondrial externa - MME - Permeável a pequenas moléculas Membrana Mitocondrial interna - MMI - Impermeável a maioria das moléculas - Inclusive H + - Necessidade de transportadores de membrana Espaço intermembranal -Cristas membranais Matriz mitocondrial - Local de oxidações - Ciclo de Krebs - β-oxidação de lipídeos - Oxidação de Aminoácidos

5 Mitocôndria Os carreadores que transportam os elétrons do NADH e FADH 2 até O 2 estão na MMI A oxidação de NADH e FADH 2 é promovida pela CTE Alguns desses centros redox são móveis ou proteínas integrais de membrana

6 LOCAL: MITOCÔNDRIA

7 MMI -~ 75% de proteínas: mais rica em proteínas do que a MME LOCAL: MITOCÔNDRIA A impermeabilidade da MMI para a maioria dos íons e metabólitos permite a formação de um gradiente de íons através dessa barreira Resulta na compartimentalização das funções metabólicas entre o citosol e a mitocôndria -É permeável a O 2, CO 2 e H 2 O - Contém proteínas de transporte que controlam a passagem de metabólitos, como ATP, ADP, o piruvato, o Ca 2+ e o fosfato A MMI contém proteínas que acoplam processos: Fluxo de elétrons (favorável) com o fluxo de prótons (desfavorável); Fluxo de prótons (favorável) a fosforilação oxidativa (desfavorável); Os elétrons passam por uma série de carreadores

8 CADEIA TRANSPORTADORA DE ELÉTRONS OU CADEIA RESPIRATÓRIA Os carreadores que transportam os elétrons do NADH e FADH 2 até O 2 estão na MMI - A oxidação de NADH e FADH 2 é promovida pela cadeia de transporte de elétrons - Alguns desses centros redox são móveis ou proteínas integrais de membrana - Dependem dos grupos protéticos associados A sequência de carreadores de elétrons reflete seus potenciais de redução relativos O processo é exergônico Transporte de e 1) 1 e Fe 3+ para Fe 2+ 2) 1 e + 1 H + 3) 2 e na forma de :H -

9 CADEIA TRANSPORTADORA DE ELÉTRONS OU CADEIA RESPIRATÓRIA Potencial de transferência de elétrons ' E 0 = potencial de redução = potencial redox = potencial de oxidorredução Par redox Forma oxidada (oxidante) Forma reduzida (redutor) X X H + : H 2 Potencial de redução = 0 V Potencial de redução 0 A forma oxidada tem menor afinidade por elétrons que o H 2 Potencial de redução 0 A forma oxidada tem maior afinidade por elétrons que o H 2 Um agente redutor forte (como o NADH) tem a tendência de doar elétrons (E 0 < 0); um agente oxidante forte (como o O 2 ) está pronto para aceitar elétrons (E 0 > 0) A força impulsora da fosforilação oxidativa é o potencial de transferência de elétrons de NADH e FADH 2 em relação ao do O 2

10 CADEIA TRANSPORTADORA DE ELÉTRONS OU CADEIA RESPIRATÓRIA NAD(P)H Os carreadores de e São carreadores de elétrons solúveis em água, que se associam reversivelmente a desidrogenases Substrato reduzido + NAD(P) + Substrato oxidado + NAD(P)H + H + **Desidrogenases remoção de 2 átomos de H do substrato :H - NAD + H + Liberado do meio NADH carreador de elétrons das vias catabólicas até a porta de entrada na CTE NADPH geralmente supre elétrons para reações anabólicas [ NADH] + [ NAD ] Nas células [ NADPH] + [ NADP ] NADH Razão baixa carreador de e - no catabolismo NADPH Razão alta Poder redutor a reações anabólicas

11 CADEIA TRANSPORTADORA DE ELÉTRONS OU CADEIA RESPIRATÓRIA Os carreadores de e Flavoproteínas Contêm um nucleotídeo de flavina (FMN ou FAD) parte do sítio ativo da flavoproteína Pode aceitar 1 elétron semiquinona ou 2 elétrons FADH 2 FMNH 2 A forma oxidada (FMN) reage com um próton e um elétron, convertendo-se na forma semiquinona (FMNH ); a incorporação de mais um próton e um elétron resulta na forma totalmente reduzida (FMNH 2 ). Flavoproteínas podem participar da transferência de 1 ou 2 e - intermediários entre reações onde 2e - são doados (desidrogenações) e onde 1 e - é doado (redução de uma quinona a hidroquinona).

12 CADEIA TRANSPORTADORA DE ELÉTRONS OU CADEIA RESPIRATÓRIA Os carreadores de e Carreadores não podem atravessar a MMI, MAS os equivalentes redutores podem ser lançados através da membrana indiretamente Equivalentes redutores termo geral para um elétron ou equivalente de elétron na forma de um átomo de hidrogênio ou de um íon hidreto. Ocorrem 3 tipos de transferência de elétrons na CTE 1 Transferência direta como na redução de Fe 3+ a Fe 2+ 2 Transferência na forma de um átomo de hidrogênio (H + + e - ) 3 Transferência como íon hidreto (:H + ) que tem 2 elétrons + 3 tipos de moléculas carreadoras de elétrons atuam na CTE: 1 Ubiquinona (quinona hidrofóbica) 2 Citocromos 3 Proteínas ferro- enxofre Proteínas (diferentes) que contêm ferro

13 CADEIA TRANSPORTADORA DE ELÉTRONS Os carreadores de elétrons na mitocôndria COENZIMA UBIQUINONA (Q) - Pequena e Lipossolúvel Quinona composto benzênico com duas funções cetona Aceita 1 elétron Constituída de unidades isoprenóides (cada uma com 5C) A coenzima Q 10 é a mais comum em mamíferos (10 unidades de isopreno) Fácil de desprotonar, formando um radical aniônico de semiquinona Aceita 2 elétrons Forma que fixa mais firmemente seus prótons Lipossolúvel se difunde livremente no espaço intermembranas Capaz de fazer a junção entre o doador de 2e- e um aceptor de 1e- (como as flavoproteínas) Carrega tanto elétrons como prótons ** acopla fluxo de e - com o movimento de prótons

14 CADEIA TRANSPORTADORA DE ELÉTRONS Os carreadores de elétrons na mitocôndria PROTEÍNAS COM CENTROS DE FERRO-ENXOFRE - Estrutura variável simples a complexas - O íon Fe sofre reações de óxido-redução Os átomos de ferro estão ligados a átomos de enxofre inorgânico ou com átomos de enxofre em resíduos de cisteína ou com ambos Podem ter de 1 a 4 átomos de ferro *** Proteínas ferro-enxofre de Rieske 1 Fe está associado com dois resíduos de His ao invés de Cys

15 CADEIA TRANSPORTADORA DE ELÉTRONS Os carreadores de elétrons na mitocôndria Citocromos a, b e c Seus grupos prostéticos grupos Heme Citocromo c solúvel no espaço intermembrana Podem interagir com a MMI

16 CADEIA TRANSPORTADORA DE ELÉTRONS O fluxo de elétrons pelos carreadores vai daquele com menor potencial para o maior potencial NADH Q Cit b Cit c 1 Cit c Cit a Cit a 3 O 2 - Potencial Redox diferentes aos das moléculas livres devido a interação com proteínas

17 CADEIA TRANSPORTADORA DE ELÉTRONS Os carreadores de elétrons na MMI: 4 complexos Complexo I é do NADH para formar Ubiquinol NADH:Ubiquinona-oxidoreductase ou NADH-desidrogenase Complexo II é do FADH 2 para formar Ubiquinol Succinato-desidrogenase Complexo III é do Ubiquinol para o Citocromo c Ubiquinona:Citocromo c-oxidoreductase Complexo IV é do Citocromo c para o O 2 Citocromo c-oxidase

18 COMPLEXO I: NADH:UBIQUINONA-OXIDOREDUTASE OU NADH-DESIDOGENASE Grupos prostéticos: FMN e Fe-S Porta de entrada dos e do NADH produzidos dentro da mitocôndria -O Complexo catalisa 2 processos simultâneos e acoplados 1) NADH + H + + Q NAD + + QH 2 Exergônico 2) Transferência de 4 H + para o espaço intermembrana Endergônica

19 COMPLEXO II: SUCCINATO-DESIDOGENASE Porta de entrada dos e do FADH 2 produzidos no ciclo do ácido cítrico Canaliza diretamente os e do succinato para a cadeia transportadora de e FADH 2 + Q FAD + QH 2 Exergônico Sem transferência de H + para o espaço intermembrana QH 2 : Porta de entrada de parte dos e do NADH produzidos no citoplasma Porta de entrada de e de outras vias oxidativas - β-oxidação de ácidos graxos

20 COMPLEXO I E COMPLEXO II Vias de entrada de e para a 4) ubiquinona: 1) NADH mitocondrial, 2) Succinato do ciclo do ácido cítrico, 3) e da β-oxidação de ácidos graxos via Acil-CoA-desidrogenase e do glicerol dos triacilglicerois 1) 2) 3) 4) NADH citosólico via glicerol 3- fosfato A ubiquinona é o ponto de convergência dos e - (Fontes 1 a 4) O ubiquinol de todas essas reações (pool de QH 2 ) é oxidado no Complexo III

21 COMPLEXO III: UBIQUINONA:CITOCROMO C-OXIDOREDUTASE Canaliza os 2 e do Ubiquinol (QH 2 ) para o Citocromo C com a transferência de H+ da matriz mitocondrial para o espaço intermembrana - possui duas unidades de Citocromo b enterrados em 1 fenda na membrana QH Citc 1 (Oxi) + 2 H + N Q + 2 Citc 1 (Red) + 4 H + P

22 COMPLEXO III: UBIQUINONA:CITOCROMO C-OXIDOREDUTASE 2 e do Ubiquinol são afunilados no Citc carreador de 1 e 2 ciclos de redução do Citc com a formação da Semiquinona (. Q - ) 1º Ciclo -1 e do QH 2 é passado para o Citc no primeiro ciclo e o outro e (via citocromo b) para a Q formando Semiquinona - 2 H + transportados para o espaço intermembrana 2º Ciclo -1 e do QH 2 é passado para o Citc e o outro e (via citocromo b) para a Semiquinona formando outra QH 2-2 H + transportados para o espaço intermembrana - 2 outros H + são retirados da matriz 1º Ciclo 2º Ciclo

23 COMPLEXO IV: CITOCROMO OXIDASE Os e do Citocromo c são entregues ao O 2 4 Citc (Red) + 8 H + N + O 2 4 Citc (Oxi) + 4 H + P + 2 H 2 O Os e - do citocromo c são entregues ao O 2 (reduzindo-o a H 2 O) Composto por 13 subunidades aparentemente 3 são essenciais Sub. II: 2 Cu ligados a resíduos de Cys (centro binuclear Cu A ) Sub. I: 2 grupos heme (a e a 3 ) e outro íon Cu (Cu B ) Heme a 3 e Cu B forma outro centro binuclear

24 COMPLEXO IV: CITOCROMO OXIDASE Os e do Citocromo c são entregues ao O 2 4 Citc (Red) + 8 H + N + O 2 4 Citc (Oxi) + 4 H + P + 2 H 2 O Envolve a participação de: Ion Cu A Citocromo a Citocromo a 3 -Cu B (Centro Fe-Cu) O 2 4 ciclos são necessários para reduzir 1 O 2 a 2 H 2 O 4 H + transportados para o Espaço intermembranas 4 outros H + são retirados da matriz para formar as 2 H 2 O 2 H + por par de e -

25 O RESPIROSSOMO Canalização de substratos na membrana mitocondrial interna - Dados cinéticos e estruturais indicam a associam dos complexos da CTE na MMI - Complexo III pode ser extraído juntamente com o Complexo I ou complexo IV Imagens de micrografia eletrônica Complexo III Vermelho Complexo IV Verde

26 CADEIA TRANSPORTADORA DE ELÉTRONS Resumo do processo Equação Vetorial do transporte de Prótons pela cadeia NADH + 11 H + N + ½ O 2 NAD H + P + 1 H 2 O FADH H + N + ½ O 2 FAD + 6 H + P + 1 H 2 O

27 CADEIA TRANSPORTADORA DE ELÉTRONS NADH + H + + ½ O 2 NAD H 2 O A ΔG da reação pode ser medida a partir da diferença de voltagem entre meias células A n+ ox + B - Se G = w' = referente ao trabalho elétrico realizado a pressão e volume constante -Se o red A w el w el = nf E red + B n+ ox 0' [ Ared ][ B G = G + RT ln n+ [ Aox ][ B onde f é a constante de Faraday ( Cmol-1) e - n é o número de e /mol portanto: ] n+ ox n red ] G = nf E Reorganizando ' RT [ Ared ][ B E = E ln n+ nf [ Aox ][ B ] n+ ox n red ] 0 Equação de Nernst - O E 0 representa o potencial de redução padrão nas condições padrões para bioquímica - Um Valor positivo para o E (potencial de redução ou força eletromotiva) sugere espontaneidade da reação - um valor positivo para o E representa um valor negativo para o G

28 CADEIA TRANSPORTADORA DE ELÉTRONS TEÓRICO NADH + H + + ½ O 2 NAD H 2 O NADH/NAD + E 0 = + 0,320 V O 2 /H 2 O E 0 = +0,816 V ΔE 0 = E 0 Red + E 0 oxi = + 1,14 V G 0' = nf E 0' = 2(96,5kJ / V. mol)1,14v = 220kJ / mol( denadh) Succinato + ½ O 2 Fumarato + 1 H 2 O G 0' = nf E 0' = 2(96,5kJ / V. mol).0,785v = 150kJ / mol( desuccinato) A razão da [NADH]/[NAD + ] >1 o que sugere que a ΔG é mais negativa do que -220 kj/mol! E energia liberada é usada para gerar um gradiente de prótons que é então utilizado para a síntese de ATP e para o transporte de metabólitos pela membrana mitocondrial

29 CADEIA TRANSPORTADORA DE ELÉTRONS EFETIVO A energia da transferência de e é eficientemente conservada em um gradiente - Gradiente de prótons - Gradiente eletroquímico FORÇA PROTON-MOTRIZ ENERGIA ELETROQÍMICA A ΔG associada ao processo de criação dos 2 gradientes é: C2 G = RT ln( ) + zf ψ C1 C2 = H + p Lado positivo da MMI Espaço intermembrana C1 = H + n Lado negativo da MMI Matriz mitocondrial Z = valor absoluta da carga elétrica 1 para 1 H + ΔΨ = Diferença do potencial transmembrana C2 ln C1 G = 2,3(log[ H + ] p log[ H = 2,3 RT ph + zf ψ + ] n ) = 2,3( ph n = (5,7kJ ph p ) = 2,3 ph ph = log[ H / mol). ph + (95,6kJ / mol). ψ + ]

30 CADEIA TRANSPORTADORA DE ELÉTRONS A ΔpH da MMI é de 0,75 unidades de ph A ΔΨ da MMI é de 0,15-0,20 V G = ( 5,7kJ / mol).0,75 + (95,6kJ / mol).0,15 = 19kJ / mol A ΔG associada à oxidação de 1 mol de NADH é: Equação Vetorial do transporte de Prótons pela cadeia NADH + 11 H + N + ½ O 2 NAD H + P + 1 H 2 O Logo ΔG = 19 kj/mol*10 = ~190 kj/mol ΔG 0 = 220 kj/mol

31 VAZAMENTO DE E DA CTE) A formação de EROs: Espécies Reativas de Oxigênio: Radicais Livres Íon superóxido O 2-0,1-4% Superóxido dismutase Glutationa-peroxidase - Ação dependente de: Glutationa NADPH

32 SISTEMAS DE TRANSPORTE MITOCONDRIAL Espaço intermembrana: entre a MME e MMI - equivalente ao citosol no que se refere às concentrações em metabólitos e íons A MMI é composta por cerca de 75% de proteínas mais rica em proteínas MME - A MMI é permeável a O 2, CO 2 e H 2 O - Contém proteínas de transporte que controlam a passagem de metabólitos, como ATP, ADP, o piruvato, o Ca 2+ e o fosfato A impermeabilidade da MMI para a maioria dos íons e metabólitos permite a formação de um gradiente de íons através dessa barreira Resulta na compartimentalização das funções metabólicas entre o citosol e a mitocôndria

33 SISTEMAS DE TRANSPORTE MITOCONDRIAL Transporte seletivo de elétrons produzidos no citoplasma para a mitocôndria - O NADH produzido no citosol pela glicólise deve ter acesso à cadeia transportadora de elétrons para a oxidação aeróbica Fígado, rim e coração - Não há uma proteína transportadora de NADH na MMI - Somente os elétrons do NADH citosólico são transportados para a mitocôndria por um dos vários sistemas de transporte LANÇADEIRA DE MALATO- ASPARTATO

34 SISTEMAS DE TRANSPORTE MITOCONDRIAL LANÇADEIRA DE GLICEROL-3-P Músculo esquelético e encéfalo A glicerol-3-fosfato desidrogenase catalisa a oxidação do NADH citosólico pela DHAP para produzir NAD+, o qual retorna à glicólise Os elétrons do glicerol-3-fosfato são transferidos para a Flavoproteína-desidrogenase da MMI, formando FADH 2 O FADH 2 fornece elétrons diretamente para Cadeia Transportadora de Elétrons QH 2

35 SISTEMAS DE TRANSPORTE MITOCONDRIAL TRANSLOCADOR DE ATP/ADP-PI A maior parte do ATP gerado na matriz mitocondrial pela fosforilação oxidativa é utilizado no citosol A MMI contém um translocador de ADP-ATP (ou adenina-nucleotídeo translocase) - Transporta o ATP para fora da matriz mitocondrial acoplado à importação de ADP e Pi produzidos no citoplasma a partir de ATP - Sistema antiporte - Mantém balanço eletrolítico pelo gasto de energia quimiosmótica