Cinética e regulação enzímicas (a velocidade das reacções enzímicas in vivo e in vitro)

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1 Cinética e regulação enzímicas (a velocidade das reacções enzímicas in vivo e in vitro) rui.fontes@mail.telepac.pt Laboratório de Bioquímica da Faculdade de edicina do Porto 1 As concentrações dos intermediários do metabolismo variam de indivíduo para indivíduo e com o estado metabólico mas mantêm-se em torno de determinados valores. As concentrações dos intermediários do metabolismo dizem-se estacionárias. Exemplo: A concentração de (e a maioria dos outros compostos existentes nos seres vivos) considerando as várias reacções em que intervém como reagente ou produto não está em equilíbrio químico....mas a velocidade do conjunto de reacções que formam é (quase) sempre igual à velocidade do conjunto de reacções em que este se gasta... existe nas células uma concentração estacionária de. s mecanismos que permitem manter o, os intermediários do metabolismo, a do plasma, etc em concentrações estacionárias são muito complexos e denominam-se 2de mecanismos homeostáticos. A regulação do metabolismo de modo a adaptar-se a diferentes condições (actividade ou descanso, jejum ou estado absortivo, diferentes tipos de dieta, etc.) é uma condição de sobrevivência. nutrientes C 2 ureia 2 trabalho mecânico contracção muscular transporte activo Ca Na Estado absortivo= Glicemia Estado de jejum = Glicemia A adaptação a diferentes condições só é possível porque a actividade das 3 enzimas se modifica quando se alteram essas condições. As enzimas são sensores do ambiente onde se encontram variando a sua actividade em função de variações nesse ambiente A As enzimas que catalisam reacções fisiologicamente reversíveis catalisam a conversão líquida no sentido directo ou inverso de acordo com a lei da acção das massas mas não são determinantes no sentido nem na velocidade de fluxo (J) da via metabólica... S 10,01 P 1000 B 0,01 As enzimas marca passo de uma via metabólica catalisam reacções fisiologicamente irreversíveis e a sua actividade determina a velocidade de fluxo nessa via metabólica. Estas enzimas (1) têm baixa actividade, (2) tem um papel determinante na regulação do metabolismo e (3) são controladas por efectores que só às vezes coincidem com os substratos e produtos... Glicólise 4

2 Aumentar a actividade de uma enzima que catalisa uma reacção de desequilíbrio (2 3) pode significar um aumento transitório na concentração do intermediário 3 mas, a enzima a jusante que catalisa a conversão reversível 3 4 rapidamente repõe a concentração de 3 num valor próximo do original. J 1 = (10) = ( ) = 10 É na barragem que se controla o caudal (fluxo) de um rio mudanças no valor do fluxo (J) na barragem provocam mudanças de fluxo idênticas a montante e a jusante da barragem. J 2 = (20) = ( ) = 20 5 Diferentes tipos de mecanismos podem participar na regulação das enzimas marca-passo das vias metabólicas: 1- De instalação lenta (horas ou dias): a quantidade de enzima como a resultante das velocidades da sua síntese e da sua degradação odificação alostérica (, Ca 2 ) 2- De instalação rápida (segundos ou milisegundos): 3- De instalação rápida mas, geralmente, com papel menos importante (pelo menos no metabolismo normal) 2.2- odificação covalente (fosforilação e defosforilação, clivagem hidrolítica ) 2.3- Ciclos de substratos ( fúteis ) -P 2.4- Acesso ao substrato por regulação do transporte transmembranar (GLUT4, CPT ) e concentração de substratos 3.1- Inibição isostérica (competitiva) e inibição pelo produto 3.2- ph Temperatura 1- esmo quando o que varia é apenas a concentração da enzima E sem que tenha variado a actividade de cada uma das suas moléculas se a velocidade da reacção que E catalisa aumentou dizemos que a actividade enzímica da enzima E aumentou (e vice-versa). É um mecanismo de instalação lenta. RNAm v1 Síntese proteica v2 RNAm 2.1- Quando uma fibra muscular se contrai aumenta a velocidade de hidrólise do e aumenta a concentração de (e ; 2 ). liga-se à fosforílase muscular induzindo uma conformação mais activa o é um activador alostérico da fosforílase muscular. Fosforílase muscular na conformação tensa (inactiva) sítio alostérico Fosforílase muscular na conformação relaxada (activa) Glicose-1-P v1 > v2 v2 > v1 Se a velocidade de síntese de uma determinada enzima (v1) é maior que a velocidade com que se degrada (hidrolisa) na célula (v2) a concentração e a actividade dessa 7 enzima aumenta. Na condição inversa a concentração e a actividade diminuem. centro activo 8 C 2

3 A complexidade dos processos de regulação de enzimas induzida por hormonas e neurotransmissores tem levado a que a palavra alostérico não se use neste contexto mesmo quando o termo seria adequado. Insulina ligada ao seu receptor A ligação entre os modificadores (activadores ou inibidores) alostéricos e os sítios alostéricos das enzimas é reversível e é de tipo não covalente. Activador alostérico receptor da insulina pode ser visto como uma enzima alostérica com o seu centro alostérico activador virado para o lado extra-celular (onde se liga a insulina) e o centro activo no lado citoplasmático. Inibidor alostérico Efeitos da insulina A ligação da insulina induz uma alteração conformacional no receptor que se torna capaz de catalisar a fosforilação de resíduos tirosina de proteínas designadas de Substratos do Receptor da Insulina (IRS). 9 e o mesmo acontece nas ligações dos substratos e dos inibidores isostéricos competitivos ao sítio activo das enzimas. Inibidor isostérico competitivo A modificação da actividade de uma enzima pode envolver a sua modificação covalente (hidrólise irreversível ou fosforilação reversível) por acção catalítica de enzimas (normalmente outras enzimas). Certas enzimas são activadas por hidrólise irreversível. São exemplos a activação dos zimogénios na digestão dos nutrientes. Exemplo 1: tripsinogénio é segregado pelo pâncreas. Convertese em tripsina (protéase digestiva) por acção da enteropeptídase (uma ectopeptídase presente no pólo apical dos enterócitos). Tripsinogénio Tripsina (activa) Enteropeptídase polipeptídeo inactivo Exemplo 2: pepsinogénio é segregado pelas células principais do estômago. Converte-se em pepsina (protéase digestiva) por acção hidrolítica do ph ácido do estômago e da próprio pepsina que já se formou. 11 uitas enzimas são reguladas por mecanismos de fosforilação/desfosforilação catalisadas por enzimas (cínases e fosfátases). Forma desfosforilada (activa) A fosfátase da piruvato catalisa a desfosforilação da piruvato que no estado desfosforilado fica activa. Forma fosforilada (inactiva) A cínase da piruvato catalisa a fosforilação da piruvato que no estado fosforilado fica inactiva. A actividade da piruvato depende da percentagem da enzima total que está na forma activa (desfosforilada). valor desta percentagem depende das actividades relativas da (1) cínase 12 da piruvato e da (2) fosfátase da piruvato.

4 2.3- A existência de ciclos de substrato (antigamente chamados de fúteis ) permite amplificar o efeito de um sinal. J=1 J=91 J=1 C 2 v = 9 v = 10 C 2 activa a glicólise muscular porque estimula a cínase da frutose-6-p. Se este aumento for de 10 vezes, o facto de esta enzima fazer parte de um ciclo de substrato 13 permite compreender que o aumento no fluxo possa ser de 91 vezes. v = 9 v = 100 J= Também há ciclos de substrato no fígado (principal órgão da gliconeogénese). Aqui, o sentido do fluxo pode inverter-se. Após uma refeição que contenha glicídeos, a concentração intracelular de frutose-2,6-bisfosfato é alta e fica estimulada a cínase 1 da frutose-6-p (e a glicólise). No jejum, a concentração intracelular de frutose-2,6-bisfosfato é baixa e fica estimulada a frutose-1,6-bisfosfátase (e a gliconeogénese). Glicose-6-P Glicose-6-P J=10 J= - 10 Fosfoenol-piruvato J=10 v = 20 Frutose-2,6- v = 10 v = 20 bisfosfato Frutose- 2,6- bisfosfato Fosfoenol-piruvato J= v = A acessibilidade aos substratos. Nas fibras musculares a entrada de (e a sua subsequente metabolização) é limitada pelo número de transportadores (GLUT4) presentes na membrana sarcoplasmática. Contracção muscular ou insulina Quer o exercício físico quer a insulina estimulam a entrada de para as fibras musculares porque nestas condições, de forma rápida, vesículas intracelulares contendo GLUT4 fundem-se com a membrana sarcoplasmática. Nos adipócitos o mesmo efeito é induzido pela insulina. A insulina e o exercício físico estimulam a remoção da Nas enzimas marca-passo, geralmente, o efeito directo da variação da concentração do substrato é pequeno (que mais não seja porque, in vivo, as concentrações dos metabolitos são estacionárias). as, em alguns casos foi possível estudar in vivo a variação da actividade de enzimas com a concentração do substrato. Num estudo de Brindle et al. (1989) estimulou-se electricamente o nervo ciático de ratos e mediu-se, na musculatura da perna, por NR (1) a concentração de e (2) a incorporação de no (síntase do ). Baixa actividade contráctil Alta actividade contráctil do plasma para as células Brindle et al. (1989) Biochemistry 28:

5 Estudamos até agora os mecanismos 1, 2.1, 2.2, 2.3 e 2.4. Falta referir os 3.1, 3.2 e De instalação lenta: a quantidade de enzima como a resultante das velocidades da sua síntese e da sua degradação. 2- De instalação rápida: 3- De instalação rápida mas, geralmente, com papel menos importante (pelo menos no metabolismo normal) 2.1- Controlo alostérico (, Ca 2 ) 2.2- odificação covalente (fosforilação e defosforilação, clivagem hidrolítica ) 2.3- Ciclos de substratos ( fúteis ) 2.4- Acesso ao substrato por regulação do transporte transmembranar (GLUT4, CPT ) e concentração de substrato 3.1- Inibição isostérica (competitiva) e inibição pelo produto 3.2- ph 3.3- Temperatura produto como inibidor das enzimas marca-passo. Na reacção catalisada pela desidrogénase da -6-P (via das pentoses- P) a reacção inversa não existe mas o NH compete com o N pelo local de ligação deste no centro activo (inibição isostérica e competitiva). N NH N NH G 18 kj; Keq/QR fosfogliconolactona NH é induzida pela insulina) a descida da concentração intracelular de NH 18 A desidrogénase da -6- fosfato é activada sempre que a concentração intracelular de NH desce. Para além de regulada ao nível da transcrição (a desidrogénase da -6-P (um dos produtos) também estimula a actividade da enzima Pensa-se que a variação do ph não tem, em geral, um papel importante na regulação das enzimas intracelulares mas a) No estômago o ph do suco gástrico é ácido e as enzimas deste suco têm ph óptimo ácido No homem, a alteração de actividade das enzimas das células em situações de abaixamento da temperatura corporal ou de febre poderá ser importante mas não desempenha um papel relevante na regulação do metabolismo normal. As enzimas e transportadores humanos (ao contrário do que acontece com outros seres vivos) foram seleccionados de forma a manterem velocidades de fluxo adequadas à vida (nas vias anabólicas e catabólicas) numa estreita gama de temperaturas. b) suco pancreático neutraliza o quimo gástrico (H HC 3- C 2 ) e as enzimas do suco pancreático e as enzimas digestivas Francisco Lázaro ( ) s órgãos para transplante são transportados a baixas temperaturas de forma a lentificar os processos catabólicos nomeadamente a hidrólise de proteínas (enzimas, transportadores, actina-miosina, etc) intestinais têm ph óptimo neutro