Função das Membranas Celulares. 5_Transporte Activo Transmembranar

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1 Licenciatura em Engenharia Biomédica Luís Martinho do Rosário [Depto. de Bioquímica / FCTUC] Função das Membranas Celulares 5_Transporte Activo Transmembranar

2 EQUILÍBRIO DE DONNAN i K + K + o volume constante (não há fluxos líquidos de H 2 O) Inicialmente [KA] i,t=0 = [KCl] o,t=0 A - Cl - Gradiente de concentração para Cl - proteínas carregadas negativamente Ao fim de t= t membrana permeável a K + e Cl - (impermeável a A - ) Fluxo de Cl - de o para i (electroneutralidade) Fluxo de K + de o para i de igual magnitude [K + ] i [K + ] o e [Cl - ] i [Cl - ] o E m = RT/F ln([k + ] o /[K + ] i ) = RT/F ln([cl - ] i /[Cl - ] o ) [K + ] i [Cl - ] i = [K + ] o [Cl - ] o Regra de Donnan #46

3 Pela regra de Donnan e aplicando o princípio da electroneutralidade a ambos os compartimentos... [K + ] i2 = [K + ] o2 + [A - ] i [K + ] i Exemplo [KA] i,t=0 = [KCl] o,t=0 = 100 mm [K + ] i > [K + ] o e [Cl - ] o > [Cl - ] i Cl - K + Total (mm) i o o i A- K + > K + Cl - < Cl - Osmolaridade em i > Osmolaridade em o + A - (100 mm) Fluxo de H 2 O de o para i (membrana elástica) Aumento de volume e ruptura da célula como compensador osmótico Bomba de /K + -ATPase [K + ] i + [Cl - ] i + [A - ] i + [ ] i [K + ] o + [Cl - ] o + [ ] o #47

4 Exercícios 1 Aplicando a Regra de Donnan e o princípio da electroneutralidade a ambos os compartimentos considerados em #50, derive a expressão indicada no topo de #51

5 /K + -ATPase Estequiometria 3 /2K + Energética Transporta iões contra gradiente electroquímico (acoplamento à hidrólise de ATP) Inibidores Glicosídeos cardíacos (ex: ouabaína) Substratos e MgATP no lado intracelular; K + (ou Rb +, NH 4+...) no lado extracelular Estrutura Heterodímero (subunidades αe β) Mecanismo Transições E 1 -E 2 promovidas por fosforilação / desfosforilação) Fosforilação Transição E 1 E 2 E 2 ~P tem elevada afinidade a K + e baixa afinidade a Desfosforilação Transição E 2 E 1 E 1 tem elevada afinidade a e baixa afinidade a K + #48

6 Ca 2+ -ATPases Membrana plasmática Estequiometria 1Ca 2+ / Ciclo Energética Transporta iões contra gradiente electroquímico (acoplamento à hidrólise de ATP) [Ca 2+ ] o >> [Ca 2+ ] i [Ca 2+ ] i (rep.) 100 nm Inibidor Vanadato Substratos Ca 2+ e MgATP no lado intracelular Mecanismo Transições E 1 -E 2 promovidas por fosforilação / desfosforilação (E 1 : alta afinidade a Ca 2+ ; E 2 ~P: baixa afinidade a Ca 2+ ) Regulação Calmodulina Função Neutralização da entrada passiva de Ca 2+ Retículo endoplasmático / sarcoplasmático ADP ATP E~P-Ca ++ 2 E~P-Ca ++ 2 E-Ca Ca ++ Estequiometria 2 Ca 2+ / Ciclo Inibidor Tapsigargina 2Ca ++ P i E ER cytosol membrane lumen Regulação Fosfolambana Função Armazenamento intracelular de Ca 2+ #49

7 Ca ++ SERCA Conformational Cycle enzyme phosphorylation phosphate hydrolysis Alguns sites e animações de interesse Structure/Function Relationships in the Calcium ATPase Toyoshima Lab Movie, see Resources E1-E2 transition Stokes Structural Biology Lab Download movie (reaction cycle of Ca-ATPase)

8 ATPases ATPases tipo P O OH eg. /K + -ATPase, Ca 2+ -ATPases, H + /K + -ATPases (mucosa gástrica) ATP ADP O O P i H 2 O Fosforilação reversível de um resíduo de ácido aspártico durante o ciclo catalítico Outras ATPases Enzyme-C Enzyme-C O P O- P-Class Pumps O- eg. H + -ATPase mitocondrial (F 1.F 0 -ATPase, tipo F) H + -ATPases de outros organelos (tipo V) #50

9 Transporte activo Primário Secundário Uso directo de ATP como fonte de energia (ATPases). Proteína de transporte alterada por ligação covalente de fosfato Uso do gradiente electroquímico de um ião como fonte de energia. Proteína de transporte alterada por modulação alostérica, como resultado da ligação de iões (ex:, Cl - ) Soluto Co-transporte Soluto transportado no mesmo sentido do ião X [ ] elevada [ ] baixa X Contra-transporte Soluto e ião transportados em sentidos opostos Soluto X X #51

10 o i 3 Ca 2+ Trocador /Ca 2+ Estequiometria 3 /1Ca 2+ Energética Transporta iões Ca 2+ contra gradiente electroquímico (acoplamento ao contra-transporte de ) Afinidade a Ca 2+ Baixa em repouso. Aumenta quando a [Ca 2+ ] i aumenta (regulação alostérica) Reversão Potencial de reversão E Na/Ca = 3E Na 2E Ca Modo directo (efluxo) E m < E Na/Ca Modo inverso (influxo) E m > E Na/Ca Modos Directo / inverso Potencial de acção Influxo de Ca 2+ E Na/Ca Efluxo de Ca 2+ Digitalis e insuficiência cardíaca Digitalis Inibição bomba [ ] i [Ca 2+ ] i Força contracção músculo cardíaco #52

11 Transportadores de equivalentes ácidos e regulação do ph citossólico H E m Distribuição passiva de H + s: E H E m E H = RT/F ln ([H + ] o /[H + ] i ) = 60(pH i -ph o ) ph o ph i Em repouso E m = -60 mv ph i = ph o 1 (ou ph = 1.0) E m = -90 mv ph i = ph o 1.5 (ou ph = 1.5) previsão para ph o = 7.4: ph i (repouso) ~ na realidade o Trocador /H + i H + sítio de regulação alostérica Bloqueado por amilorida e derivados Alostericamente activado por H + s Inibido quando ph i 7.2 #53

12 Exercícios 1 Derive a expressão que define o potencial de reversão do trocador /Ca 2+, considerando que a energia livre associada ao gradiente electroquímico de um ião X + é dada por G X =zf(e m -E X ) 2 Calcule o potencial de reversão do trocador /Ca 2+ para um miócito cardíaco em repouso, sabendo que [ ] i/o ~ 10/140 mm e [Ca 2+ ] i/o ~ 100 nm/2 mm. Qual é o modo de funcionamento do trocador nestas condições? 3 O trocador /H + é um dispositivo fundamental para a regulação do ph intracelular. Explique por que razão o trocador contraria a tendência para a acidificação intracelular causada pelo influxo passivo de protões através da membrana celular (ou por exposição das células a pulsos breves de baixas concentrações de nigericina, um trocador K + /H + artificial) 4 A K + /H + -ATPase localizada na face luminal das células parietais do estômago está na base da acidificação do lúmen estomacal (essencial para a digestão de proteínas). Explique por que razão certos inibidores terapêuticos da bomba de H + são comummente utilizados na terapia do excesso de acidez estomacal