Mecanismo de Inibição de Enzimas Preparação de Micro e Macromoléculas Docagem Molecular Exemplo de Aplicação

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1 bjetivos FFI0776 Modelagem e Engenharia de Proteínas Mecanismo de Inibição de Enzimas Preparação de Micro e Macromoléculas M l Docagem Molecular Exemplo de Aplicação Prof. Rafael V. C. Guido rvcguido@ifsc.usp.br Bacharelado em Ciências Físicas e Biomoleculares em e Biomoleculares Instituto de Física de São Carlos USP Mecanismo de inibição Sítio de ligação Inibidor competitivo GAPDH Leishmania mexicana IC 50 = 4 µm inibidor competitivo Suresh et al J Mol Biol

2 Sítio de de ligação Inibidor não-competitivo Mecanismo de inibição RA Polimerase vírus hepatite C Sítio catalítico = V max [I] = 9 µm K M 1/V [I] = 5 µm [I] = 3 µm Sítio de ligação [I] = 0 µm IC 50 =093µM =0,93 inibidor não competitivo L t l J Vi l /[substrato] Inibidor competitivo Identificação da cavidade de ligação Preparação de macro e micromoléculas para docagem molecular molecular Análise de complexos cristalográficos Ligante-macromolécula Análise estrutural t comparativa membro conhecido da superfamília da macromolécula em complexo com um ligante

3 Seleção da geometria Macromoléculas possuem alto grau de liberdade interno Flexibilidade determina o fenômeno conhecido como mudança conformacional Local envolvem apenas as cadeias laterais de resíduos de aminoácidos (e.g., rotâmeros estruturais) Mudança conformacional GAPDH Global - rearranjo tetrâmero conformacional da estrutura GAPDH terciária da monômero macromolécula GAPDH Domínio de ligação do AD + Domínio de ligação do substrato Moléculas de água Moléculaslas de água possuem papel importante em sistemas macromoleculares, estando presentes em aproximadamente 70% dos complexos cristalográficos Ligantes Preparação de ligantes moléculas pequenas que se ligam nas cavidades de interação de macromoléculas Estruturas t 3D dos ligantes devem ser submetidas a um processo de minimização de energia conformacional

4 Validação dos resultados Estruturas cristalográficas de receptores alvo em complexo com ligantes podem ser empregadas no processo de validação do modo de interação proposto pelo método de docagem molecular Valores de rmsd menores que 2 Å são considerados satisfatórios Docagem molecular Método que consiste na predição do modo de ligação de pequenas moléculas no sítio de ligação de macromoléculas alvo com subseqüente avaliação e classificação dos modos de ligação propostos. Docagem molecular A docagem molecular foi introduzida no início da década de 80, e desde d então tem encontrado ampla aplicação em química medicinal i e biologia estrutural, sendo, portanto, uma ferramenta de grande valor em projetos de planejamento de fármacos Kuntz, I. D.; Blaney, J. M.; atley, S. J.; Langridge, R.; Ferrin, T. E. A geometric approach to macromolecule ligand interactions. J. Mol. Biol., 161, , 1982

5 Docagem molecular Criação de modelos de interação entre o compostos líder e o receptor timização de compostos líderes cujo modo de interação é conhecido Identificação de novos compostos (Triagem virtual) Programas para docagem molecular Uma das etapas mais importantes desta estratégia de é a escolha do programa de docagem ~ 30 programas disponíveis Uso acadêmico livre: DCK 6.0 Autodock FTDCK (MULTIDCK) ZDCK Uso acadêmico pago; GLD FlexX FlexE DockVision Docagem molecular Docagem molecular processo de docagem molecular pode ser dividido em duas etapas fundamentais determinação do modo de ligação predição da afinidade do ligante pelo sítio de interação predição da afinidade Classificação Pontuação Amostragem Complementaridade Estéreo 6 Química 3 4 modo de ligação ligante sítio de ligação

6 Determinação do modo de ligação Função de busca Modo de interação Métodos de amostragem atribuem flexibilidade as moléculas gerar todos os complexos possíveis s programas de docagem molecular, l em geral, consideram que a molécula do receptor é rígida, enquanto que a molécula do ligante pode ter uma flexibilidade parcial; Essa flexibilidade é traduzida através da variação dos ângulos torsionais do ligante; (i) métodos sistemáticos construção incremental, amostragem conformacional (ii) métodos aleatórios ou estocásticos Monte Carlo, algoritmo genético (iii) métodos de simulação dinâmica molecular e minimização de energia ângulos torsionais docagem Função de busca minimizada Função de busca biotiva processo de reconhecimento molecular é um processo tridimensional Mínima energia bioativa

7 Predição da afinidade de ligação Mecânica molecular Funções de pontuação avaliam e classificam os modos de ligação propostos Funções de pontuação que levam em conta as interações intermoleculares descritas por termos clássicos da mecânica molecular (i) campos de força métodos de mecânica molecular capazes de quantificar a energia proveniente das interações ligante-receptor t (ii) empíricas ajuste teórico de equações (regressão linear) que reproduzem dados experimentais (iii) com base no conhecimento funções que utilizam dados estatísticos dos potenciais de pares atômicos de interação distância de ligação ângulo de ligação ângulo torsional Interação de van der Waals Interação eletrostática Métodos empíricos Dados ajustados a partir de um conjunto de complexos cristalográficos cujo K i foi determinado experimentalmente; ligante-enzima proteína-proteína p antígeno-anticorpo Com base no conhecimento Funções que utilizam dados estatísticos dos potenciais de ç q p pares atômicos de interação, os quais são derivados de conjuntos de dados provenientes de complexos cristalográficos entre ligantes e proteínas G= G vdw (A ij /r ij 12 B ij /R ij6 ) + G hbond E(t) (C ij /r ij 12 D ij /r ij 10 ) + GG G G ( elet q i q j / (r ij )r ij + G tor tor + G sol (S i V j + S j V i )e (-r/2 ) função de energia baseada no campo de força AMBER (AUTDCK)

8 Validação dos resultados Estruturas cristalográficas de receptores alvo em complexo com ligantes podem ser empregadas no processo de validação do modo de interação proposto pelo método de docagem molecular Valores de rmsd menores que 2 Å são considerados satisfatórios Tuberculose Tuberculose Proteína Tirosina Fosfatase A (PtPA) Impacto Global Distribuição Mortes: 2 milhões/ano Global Agente Etiológico Micobacterium tuberculosis s Tratamento Parcialmente eficaz; Diversas limitações: falta de adesão do paciente longos regimes prescritos resistência toxicidade rifampicina H H 3CC H H H 3 C H H (a) H 2 (b) (c) H 2 H pirazinamida isoniazida MM = 18 kda Fator de virulência do M. tuberculosis Molécula essencial para o l l desenvolvimento intracelular A inibição da PtpA determina redução significativa na taxa de na taxa de crescimento do M. tuberculosis

9 Identificação de Inibidores Mecanismo de Inibição K i = 3 µm K i = 5 µm K i = 15 µm K i = 3 µm Inibidores Competitivos K i =13 µm K i = 10 µm Mascarello et al Bioorg Med Chem Modelagem Molecular Atividade in vitroin vitro Macrófagos THP-1 infectados com a cepa de M. tuberculosis H37Rv 5a K i = 3 μm 4a K i = 15 μm Mascarello et al Bioorg Med Chem Mascarello et al Bioorg Med Chem