Alinhamentos de sequências e Busca de Similaridade

Transcrição

1 Alinhamentos de sequências e Busca de Similaridade Ariane Machado Lima ariane.machado@usp.br Escola de Artes, Ciências e Humanidades - USP

2 Contexto

3 Contexto

4 Buscas por sequências (o sentido biológico) Busca de identidade: SABER o que é, onde está, etc. Busca de similaridade: INFERIR o que é

5 Busca de identidade Comparar 2 sequências para saber se: são iguais possuem uma subsequência em comum

6 Exemplo Localização de subsequência sequência genoma

7 Exemplo Localização de subsequência sequência genoma

8 Exemplo Localização de subsequência sequência genoma BUSCA POR IDENTIDADE

9 Exemplo 2 Como faço para saber que proteína é essa? MMETERLVLPPPDPLDLPLRAVELGCTGHWELLNLPGAPESSLPHGLPPCAPDLQQEAEQLFLSSPAWLPLHGVEHSARKW QRKTDPWSLLAVLGAPVPSDLQAQRHPTTGQILGYKEVLLENTNLSATTSLSLRRPPGPASQSLWGNPTRYPFWPGGM DEPTITDLNTREEAEEEIDFEKDLLTIPPGFKKGMDFAPKDCPTPAPGLLSLSCLLEPLDLGGGDEDENEAVGQPGGPRG DTVSASPCSAPLARASSLEDLVLKEASTAVSTPEAPEPPSQEQWAIPVDATSPVGDFYRLIPQPAFQWAFEPDVFQKQAI LHLERHDSVFVAAHTSAGKTVVAEYAIALAQKHMTRTIYTSPIKALSNQKFRDFRNTFGDVGLLTGDVQLHPEASCLIMTT EILRSMLYSGSDVIRDLEWVIFDEVHYINDVERGVVWEEVLIMLPDHVSIILLSATVPNALEFADWIGRLKRRQIYVISTVTR PVPLEHYLFTGNSSKTQGELFLLLDSRGAFHTKGYYAAVEAKKERMSKHAQTFGAKQPTHQGGPAQDRGVYLSLLASL RTRAQLPVVVFTFSRGRCDEQASGLTSLDLTTSSEKSEIHLFLQRCLARLRGSDRQLPQVLQMSELLNRGLGVHHSGILP ILKEIVEMLFSRGLVKVLFATETFAMGVNMPARTVVFDSMRKHDGSTFRDLLPGEYVQMAGRAGRRGLDPTGTVILLCK GRVPEMADLHRMMMGKPSQLQSQFRLTYTMILNLLRVDALRVEDMMKRSFSEFPSRKDSKAHEQALAELTKRLGALEE PDMTGQLVDLPEYYSWGEELTETQHMIQRRIMESVNGLKSLSAGRVVVVKNQEHHNALGVILQVSSNSTSRVFTTLVLC DKPLSQDPQDRGPATAEVPYPDDLVGFKLFLPEGPCDHTVVKLQPGDMAAITTKVLRVNGEKILEDFSKRQQPKFKKDP PLAAVTTAVQELLRLAQAHPAGPPTLDPVNDLQLKDMSVVEGGLRARKLEELIQGAQCVHSPRFPAQYLKLRERMQIQK EMERLRFLLSDQSLLLFPEYHQRVEVLRTLGYVDEAGTVKLAGRVACAMSSHELLLTELMFDNALSTLRPEEIAALLSGLV CQSPGDAGDQLPNTLKQGIERVRAVAKRIGEVQVACGLNQTVEEFVGELNFGLVEVVYEWARGMPFSELAGLSGTPEG LVVRCIQRLAEMCRSLRGAARLVGEPVLGAKMETAATLLRRDIVFAASLYTQ

10 Exemplo 2 Como faço para saber que proteína é essa? MMETERLVLPPPDPLDLPLRAVELGCTGHWELLNLPGAPESSLPHGLPPCAPDLQQEAEQLFLSSPAWLPLHGVEHSARKW QRKTDPWSLLAVLGAPVPSDLQAQRHPTTGQILGYKEVLLENTNLSATTSLSLRRPPGPASQSLWGNPTRYPFWPGGM DEPTITDLNTREEAEEEIDFEKDLLTIPPGFKKGMDFAPKDCPTPAPGLLSLSCLLEPLDLGGGDEDENEAVGQPGGPRG DTVSASPCSAPLARASSLEDLVLKEASTAVSTPEAPEPPSQEQWAIPVDATSPVGDFYRLIPQPAFQWAFEPDVFQKQAI LHLERHDSVFVAAHTSAGKTVVAEYAIALAQKHMTRTIYTSPIKALSNQKFRDFRNTFGDVGLLTGDVQLHPEASCLIMTT EILRSMLYSGSDVIRDLEWVIFDEVHYINDVERGVVWEEVLIMLPDHVSIILLSATVPNALEFADWIGRLKRRQIYVISTVTR PVPLEHYLFTGNSSKTQGELFLLLDSRGAFHTKGYYAAVEAKKERMSKHAQTFGAKQPTHQGGPAQDRGVYLSLLASL RTRAQLPVVVFTFSRGRCDEQASGLTSLDLTTSSEKSEIHLFLQRCLARLRGSDRQLPQVLQMSELLNRGLGVHHSGILP ILKEIVEMLFSRGLVKVLFATETFAMGVNMPARTVVFDSMRKHDGSTFRDLLPGEYVQMAGRAGRRGLDPTGTVILLCK GRVPEMADLHRMMMGKPSQLQSQFRLTYTMILNLLRVDALRVEDMMKRSFSEFPSRKDSKAHEQALAELTKRLGALEE PDMTGQLVDLPEYYSWGEELTETQHMIQRRIMESVNGLKSLSAGRVVVVKNQEHHNALGVILQVSSNSTSRVFTTLVLC DKPLSQDPQDRGPATAEVPYPDDLVGFKLFLPEGPCDHTVVKLQPGDMAAITTKVLRVNGEKILEDFSKRQQPKFKKDP PLAAVTTAVQELLRLAQAHPAGPPTLDPVNDLQLKDMSVVEGGLRARKLEELIQGAQCVHSPRFPAQYLKLRERMQIQK EMERLRFLLSDQSLLLFPEYHQRVEVLRTLGYVDEAGTVKLAGRVACAMSSHELLLTELMFDNALSTLRPEEIAALLSGLV CQSPGDAGDQLPNTLKQGIERVRAVAKRIGEVQVACGLNQTVEEFVGELNFGLVEVVYEWARGMPFSELAGLSGTPEG LVVRCIQRLAEMCRSLRGAARLVGEPVLGAKMETAATLLRRDIVFAASLYTQ Posso procurá-la em bancos de proteínas anotadas (procuro por ela, ou seja, por uma sequência idêntica)

11 Exemplo 2 Como faço para saber que proteína é essa? MMETERLVLPPPDPLDLPLRAVELGCTGHWELLNLPGAPESSLPHGLPPCAPDLQQEAEQLFLSSPAWLPLHGVEHSARKW QRKTDPWSLLAVLGAPVPSDLQAQRHPTTGQILGYKEVLLENTNLSATTSLSLRRPPGPASQSLWGNPTRYPFWPGGM DEPTITDLNTREEAEEEIDFEKDLLTIPPGFKKGMDFAPKDCPTPAPGLLSLSCLLEPLDLGGGDEDENEAVGQPGGPRG DTVSASPCSAPLARASSLEDLVLKEASTAVSTPEAPEPPSQEQWAIPVDATSPVGDFYRLIPQPAFQWAFEPDVFQKQAI LHLERHDSVFVAAHTSAGKTVVAEYAIALAQKHMTRTIYTSPIKALSNQKFRDFRNTFGDVGLLTGDVQLHPEASCLIMTT EILRSMLYSGSDVIRDLEWVIFDEVHYINDVERGVVWEEVLIMLPDHVSIILLSATVPNALEFADWIGRLKRRQIYVISTVTR PVPLEHYLFTGNSSKTQGELFLLLDSRGAFHTKGYYAAVEAKKERMSKHAQTFGAKQPTHQGGPAQDRGVYLSLLASL RTRAQLPVVVFTFSRGRCDEQASGLTSLDLTTSSEKSEIHLFLQRCLARLRGSDRQLPQVLQMSELLNRGLGVHHSGILP ILKEIVEMLFSRGLVKVLFATETFAMGVNMPARTVVFDSMRKHDGSTFRDLLPGEYVQMAGRAGRRGLDPTGTVILLCK GRVPEMADLHRMMMGKPSQLQSQFRLTYTMILNLLRVDALRVEDMMKRSFSEFPSRKDSKAHEQALAELTKRLGALEE PDMTGQLVDLPEYYSWGEELTETQHMIQRRIMESVNGLKSLSAGRVVVVKNQEHHNALGVILQVSSNSTSRVFTTLVLC DKPLSQDPQDRGPATAEVPYPDDLVGFKLFLPEGPCDHTVVKLQPGDMAAITTKVLRVNGEKILEDFSKRQQPKFKKDP PLAAVTTAVQELLRLAQAHPAGPPTLDPVNDLQLKDMSVVEGGLRARKLEELIQGAQCVHSPRFPAQYLKLRERMQIQK EMERLRFLLSDQSLLLFPEYHQRVEVLRTLGYVDEAGTVKLAGRVACAMSSHELLLTELMFDNALSTLRPEEIAALLSGLV CQSPGDAGDQLPNTLKQGIERVRAVAKRIGEVQVACGLNQTVEEFVGELNFGLVEVVYEWARGMPFSELAGLSGTPEG LVVRCIQRLAEMCRSLRGAARLVGEPVLGAKMETAATLLRRDIVFAASLYTQ Posso procurá-la em bancos de proteínas anotadas (procuro por ela, ou seja, por uma sequência idêntica) BUSCA POR IDENTIDADE

12 Exemplo 3 Como faço para saber que proteína é essa? MMETERLVLPPPDPLDLPLRAVELGCTGHWELLNLPGAPESSLPHGLPPCAPDLQQEAEQLFLSSPAWLPLHGVEHSARKW QRKTDPWSLLAVLGAPVPSDLQAQRHPTTGQILGYKEVLLENTNLSATTSLSLRRPPGPASQSLWGNPTRYPFWPGGM DEPTITDLNTREEAEEEIDFEKDLLTIPPGFKKGMDFAPKDCPTPAPGLLSLSCLLEPLDLGGGDEDENEAVGQPGGPRG DTVSASPCSAPLARASSLEDLVLKEASTAVSTPEAPEPPSQEQWAIPVDATSPVGDFYRLIPQPAFQWAFEPDVFQKQAI LHLERHDSVFVAAHTSAGKTVVAEYAIALAQKHMTRTIYTSPIKALSNQKFRDFRNTFGDVGLLTGDVQLHPEASCLIMTT EILRSMLYSGSDVIRDLEWVIFDEVHYINDVERGVVWEEVLIMLPDHVSIILLSATVPNALEFADWIGRLKRRQIYVISTVTR PVPLEHYLFTGNSSKTQGELFLLLDSRGAFHTKGYYAAVEAKKERMSKHAQTFGAKQPTHQGGPAQDRGVYLSLLASL RTRAQLPVVVFTFSRGRCDEQASGLTSLDLTTSSEKSEIHLFLQRCLARLRGSDRQLPQVLQMSELLNRGLGVHHSGILP ILKEIVEMLFSRGLVKVLFATETFAMGVNMPARTVVFDSMRKHDGSTFRDLLPGEYVQMAGRAGRRGLDPTGTVILLCK GRVPEMADLHRMMMGKPSQLQSQFRLTYTMILNLLRVDALRVEDMMKRSFSEFPSRKDSKAHEQALAELTKRLGALEE PDMTGQLVDLPEYYSWGEELTETQHMIQRRIMESVNGLKSLSAGRVVVVKNQEHHNALGVILQVSSNSTSRVFTTLVLC DKPLSQDPQDRGPATAEVPYPDDLVGFKLFLPEGPCDHTVVKLQPGDMAAITTKVLRVNGEKILEDFSKRQQPKFKKDP PLAAVTTAVQELLRLAQAHPAGPPTLDPVNDLQLKDMSVVEGGLRARKLEELIQGAQCVHSPRFPAQYLKLRERMQIQK EMERLRFLLSDQSLLLFPEYHQRVEVLRTLGYVDEAGTVKLAGRVACAMSSHELLLTELMFDNALSTLRPEEIAALLSGLV CQSPGDAGDQLPNTLKQGIERVRAVAKRIGEVQVACGLNQTVEEFVGELNFGLVEVVYEWARGMPFSELAGLSGTPEG LVVRCIQRLAEMCRSLRGAARLVGEPVLGAKMETAATLLRRDIVFAASLYTQ Posso procurá-la em bancos de proteínas anotadas (procuro por ela, ou seja, por uma sequência idêntica) E SE EU NÃO ENCONTRASSE UMA IDÊNTICA, MAS UMA SIMILAR?

13 Inferência de função a partir de similaridade

14 Inferência de função a partir de similaridade

15 Inferência de função a partir de similaridade

16 Nem sempre funciona...

17 2 sequências cacttttaactctctttccaaagtccttttcatctttccttcacagtacttgttcactat cacttttaactctctttccaaagaacttttcatctttccctcacggtacttgtttgctat

18

19 Processo evolutivo

20 Homologia, paralogia e ortologia Homologia: 2 sequências são homólogas se elas possuem uma sequência ancestral comum Ortologia Paralogia

21 Ortologia: homologia por especiação

22 Paralogia: homologia por duplicação

23 Homologia, paralogia e ortologia Paralogia Ortologia

24 Aplicações de busca de similaridade Predição de genes Predição de estrutura de proteínas de RNA/DNA Inferência de árvores filogenéticas Busca de polimorfismos / marcadores

25 Identidade, similaridade e homologia CUIDADO: Se duas (ou mais) sequências são parecidas: elas podem ser homólogas elas podem ter funções similares elas podem ter a mesma estrutura

26 Como encontrar identidade e similaridade?

27 Como encontrar identidade e similaridade? ALINHAMENTOS!

28 Alinhamentos de 2 sequências Deixar 2 sequências o mais parecidas possível Ajustando as posições de suas letras, se necessário usando espaços: ROSAVERMELHA AMOROSOVERME

29 Alinhamentos de 2 sequências Deixar 2 sequências o mais parecidas possível Ajustando as posições de suas letras, se necessário usando espaços: ROSAVERMELHA AMOROSOVERME ---ROSAVERMELHA AMOROSOVERME---

30 ROSAVERMELHA AMOROSOVERME ---ROSAVERMELHA AMOROSOVERME--- Alinhamentos permitem comparações entre as sequências Identidade Similaridade

31 ROSAVERMELHA AMOROSOVERME ---ROSAVERMELHA AMOROSOVERME--- Identidade: 8% (/2) Identidade: 53% (8/5)

32 Sistema de scores Pontos para match (ex: +2) Penalidades para mismatch (ex: ) Penalidades para gap abertura (ex: ) extensão (ex: )

33 ROSAVERMELHA AMOROSOVERME ---ROSAVERMELHA AMOROSOVERME--- Identidade: 8% (/2) SCORE:??? Identidade: 53% (8/5) SCORE:???

34 ROSAVERMELHA AMOROSOVERME ---ROSAVERMELHA AMOROSOVERME--- Identidade: 8% (/2) SCORE: -9 Identidade: 53% (8/5) SCORE:???

35 ROSAVERMELHA AMOROSOVERME ---ROSAVERMELHA AMOROSOVERME--- Identidade: 8% (/2) SCORE: -9 Identidade: 53% (8/5) SCORE: +3

36 ROSAVERMELHA AMOROSOVERME ---ROSAVERMELHA AMOROSOVERME--- Identidade: 8% (/2) SCORE: -9 Identidade: 53% (8/5) SCORE: +3 Para um dado sistema de score, calculo o alinhamento de maior score (alinhamento ótimo) PROBLEMA DE OTIMIZAÇÃO

37 Similaridade entre os aminoácidos

38 Matrizes de score (matrizes de substituição de aa) Matrizes 2x2 Algumas matrizes: PAMs BLOSUMs

39 Reference: Henikoff, S. and Henikoff, J. G. (992). Amino acid substitution matrices from protein blocks. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: A R N D C Q E G H I L K M F P S T W Y V B Z X * A 4 R 5 2 N 6 3 D C 9 Q E G 6 H 8 2 I L K 2 5 M 2 5 F 6 3 P 7 S 4 T 5 W 2 Y V 3 4 B Z X *

40 Matrizes de score (matrizes de substitição de aa) Matrizes 2x2 Algumas matrizes: PAMs BLOSUMs Também pode usar matrizes de nucleotídeos...

41 Matrizes de score (matrizes de substitição de aa) Matrizes 2x2 Algumas matrizes: PAMs BLOSUMs Veremos sobre essas matrizes mais adiante... Também pode usar matrizes de nucleotídeos...

42 Identidade, similaridade e homologia Tipo de Medida Sentido Identidade Quantitativa quantos idênticos Similaridade Quantitativa quantos parecidos Homologia QUALITATIVA TEM ou NÃO TEM um ancestral comum

43 Alinhamentos Pairwise: 2 sequências Múltiplo: mais de 2 sequências

44 Tipos de alinhamentos Global Semi-global Local

45 Alinhamento global QUERIDA---ROSAVERMELHA QUEROUMAMOROSOVERME---

46 Alinhamento global Aplicação: comparar 2 proteínas (ex. para inferir estrutura secundária)

47 Estrutura 3D de proteínas

48 Alinhamento global Aplicação: comparar 2 proteínas (ex. para inferir estrutura secundária)

49 Alinhamento múltiplo

50 Alinhamento pairwise global Algoritmo Exato: Needleman-Wunsch (pairwise) Programas: needle (EMBOSS) stretcher (EMBOSS) (demora mais, mas economiza memória) FASTA Outros de alinhamento múltiplo

51 Alinhamento múltiplo (global) Ferramentas normalmente usadas NÃO SÃO EXATAS! Necessita alguma edição manual Parece não haver um consistentemente melhor que todos

52 Alinhamento múltiplo (global) Algumas ferramentas: ClustalW / ClustalX T-Coffee Muscle

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54 ClustalX Alinhar helicases_humanas.fasta Alinhar dicers.fasta

55 Alinhamento global Outras aplicações Identificação de SNPs (single nucleotide polimorphism) e outros polimorfismos Identificação de domínios proteicos mais conservados Identificação de isoformas Construção de árvores filogenéticas

56 Helicases humanas (SNPs)

57 Várias helicases (domínios)

58 Várias helicases (domínios)

59 Identificação de isoformas

60 Identificação de isoformas

61 Outra aplicação Criação de modelos e identificação de RNAs não codificantes (ou outros elementos) com estrutura secundária Ex: micrornas

62 Alinhamento estrutural

63 Alinhamento semi-global ---ROSAVERMELHA AMOROSOVERME---

64 Alinhamento semi-global Aplicação: montagem de genomas!

65 Sequenciamento shot-gun

66 Alinhamento semi-global Aplicação: montagem de genomas!

67 Alinhamento local QUERIDA---ROSAVERMELHA QUEROUMAMOROSOVERME--QUER QUER ROSAVERME ROSOVERME

68 Alinhamento local Aplicações: Encontrar um gene em um genoma sequência genoma

69 Alinhamento local Aplicações: Identificar possíveis homólogos em um banco de dados MMETERLVLPPPDPLDLPLRAVELGCTGHWELLNLPGAPESSLPHGLPPCAPDLQQEAEQLFLSSPAWLPLHGVEHSARKW QRKTDPWSLLAVLGAPVPSDLQAQRHPTTGQILGYKEVLLENTNLSATTSLSLRRPPGPASQSLWGNPTRYPFWPGGMDEP TITDLNTREEAEEEIDFEKDLLTIPPGFKKGMDFAPKDCPTPAPGLLSLSCLLEPLDLGGGDEDENEAVGQPGGPRGDTVSAS PCSAPLARASSLEDLVLKEASTAVSTPEAPEPPSQEQWAIPVDATSPVGDFYRLIPQPAFQWAFEPDVFQKQAILHLERHDSV FVAAHTSAGKTVVAEYAIALAQKHMTRTIYTSPIKALSNQKFRDFRNTFGDVGLLTGDVQLHPEASCLIMTTEILRSMLYSGSDV IRDLEWVIFDEVHYINDVERGVVWEEVLIMLPDHVSIILLSATVPNALEFADWIGRLKRRQIYVISTVTRPVPLEHYLFTGNSSKT QGELFLLLDSRGAFHTKGYYAAVEAKKERMSKHAQTFGAKQPTHQGGPAQDRGVYLSLLASLRTRAQLPVVVFTFSRGRCD EQASGLTSLDLTTSSEKSEIHLFLQRCLARLRGSDRQLPQVLQMSELLNRGLGVHHSGILPILKEIVEMLFSRGLVKVLFATETF AMGVNMPARTVVFDSMRKHDGSTFRDLLPGEYVQMAGRAGRRGLDPTGTVILLCKGRVPEMADLHRMMMGKPSQLQSQF RLTYTMILNLLRVDALRVEDMMKRSFSEFPSRKDSKAHEQALAELTKRLGALEEPDMTGQLVDLPEYYSWGEELTETQHMIQ RRIMESVNGLKSLSAGRVVVVKNQEHHNALGVILQVSSNSTSRVFTTLVLCDKPLSQDPQDRGPATAEVPYPDDLVGFKLFLP EGPCDHTVVKLQPGDMAAITTKVLRVNGEKILEDFSKRQQPKFKKDPPLAAVTTAVQELLRLAQAHPAGPPTLDPVNDLQLKD MSVVEGGLRARKLEELIQGAQCVHSPRFPAQYLKLRERMQIQKEMERLRFLLSDQSLLLFPEYHQRVEVLRTLGYVDEAGTV KLAGRVACAMSSHELLLTELMFDNALSTLRPEEIAALLSGLVCQSPGDAGDQLPNTLKQGIERVRAVAKRIGEVQVACGLNQT VEEFVGELNFGLVEVVYEWARGMPFSELAGLSGTPEGLVVRCIQRLAEMCRSLRGAARLVGEPVLGAKMETAATLLRRDIVF AASLYTQ

70 Alinhamento Local Algoritmo Smith-Waterman (exato) Programas BLAST (NCBI / WU) BLAT (mais preciso bom para localização) water (EMBOSS - exato) matcher (demora mais, mas economiza memória exato) cross_match (swat) bom para mascaramento FASTA

71 BLAST Basic Local Alignment Search Tool NCBI BLAST ou WU-BLAST Heurísticas

72 Palavras do BLAST (W) MLIIKRDELVISWASHERE MLI LII IIK IKR KRD RDE DEL ELV LVI VIS ISW SWA WAS ASH SHE HER ERE sequência query todas as palavras de tamanho 3 com sobreposição

73 Palavras do BLAST (W) Valores default para aminoácidos e para nucleotídeos CUIDADO!!!!! Veja se isso não é muito para o seu caso!

74 Exercício Primeiro usar ClustalX (alinhamento global) para alinhar mouse_hemoglobinas.fasta (uma sequência genômica e um transcrito) Depois usar bl2seq (Blast) para alinhar as mesmas sequências Qual a diferença?

75 Exercício Localizar onde está (no genoma do camundongo) o gene da hemoglobina Qual programa blast usar? Qual sequência usar? (gene todo ou transcrito?)

76 Exercício Encontrar hemoglobinas parecidas Quais programas blast usar? Qual sequência usar? (gene todo ou transcrito?)

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79 Formato FASTA >Identificador da sequência GCCCCCGGCCCCGCCCCGGCCCCGCCCCCGGCCCCGCCCCGCAAGGGTC ACAGGTCACGGGGCGGGGCCGAGGCGGAAGCGCCCGCAGCCCGGTACCG GCTCCTCCTGGGCTCCCTCTAGCGCCTTCCCCCCGGCCCGACTCCGCTG GTCAGCGCCAAGTGACTTACGCCCCCGACCTCTGAGCCCGGACCGCTAG

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82 Significância de scores E-value (s): número de hits com score tão bom ou melhor que s puramente por chance em um banco de dados aleatório, do mesmo tamanho e com a mesma composição de bases Quanto menor...

83 Significância de scores E-value (s): número de hits com score tão bom ou melhor que s puramente por chance em um banco de dados aleatório, do mesmo tamanho e com a mesma composição de bases Quanto menor melhor!!!!

84 Significância de scores E-value (s): número de hits com score tão bom ou melhor que s puramente por chance em um banco de dados aleatório, do mesmo tamanho e com a mesma composição de bases P-value (s): probabilidade de obter um score tão bom ou melhor que s puramente por chance em um banco de dados aleatório, do mesmo tamanho e com a mesma composição de bases

85 Significância de scores E-value é um número real não negativo Quanto menor melhor!!!! E-value depende de... E(S) = Kmne-λS... por isso não existe número mágico

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87 Programas standalone Programas como Blast, BLAT e muuuuitos outros: via web server standalone (linha de comando) Perl scripts!!!! NCBI x WU BLAST netblast: linha de comando, mas executa remotamente

88 BLAT Blast Like Alignment Tool Mais rápido e mais preciso (para sequências altamente similares) Aplicação: mapeamento de sequências (ex: transcritos) Mantém um índice de todo o banco em memória (non-overlapping k-mers)

89 SIM4 e outros Para alinhar regiões sequências em nucleotídeos de regiões codificantes (alinhamento de códons)

90 Cuidado com anotações erradas!!! Cuidado com bancos não curados

91 Voltando ao sistema de score... Match/mismatch pode ser substituído por uma matriz 4x4 (nucleotídeos) uma matriz 2x2 (aminoácidos)

92 Similaridade entre os aminoácidos

93 Matrizes de score (matrizes de substituição)

94 Reference: Henikoff, S. and Henikoff, J. G. (992). Amino acid substitution matrices from protein blocks. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: A R N D C Q E G H I L K M F P S T W Y V B Z X * A 4 R 5 2 N 6 3 D C 9 Q E G 6 H 8 2 I L K 2 5 M 2 5 F 6 3 P 7 S 4 T 5 W 2 Y V 3 4 B Z X *

95 Matrizes de score (matrizes de substituição) qij: probabilidade do aminoácido i ser substituído pelo aminoácido j pi: probabilidade do aminoácido i mij = log (qij / pi pj) = mij

96 Matrizes de score (matrizes de substituição) qij: probabilidade do aminoácido i ser substituído pelo aminoácido j pi: probabilidade do aminoácido i mij = log (qij / pi pj) = mij

97 Matrizes de score (matrizes de substituição) qij: probabilidade do aminoácido i ser substituído pelo aminoácido j pi: probabilidade do aminoácido i mij = /λ log (qij / pi pj) = mij

98 Matrizes de score (matrizes de substitição) Como achar qij, pi e pj? Algumas matrizes: PAMs BLOSUMs

99 Matrizes PAM de aminoácidos Point Accepted Mutation Dayhoff, 978 Processo: Alinhamento de conjuntos de sequências relacionadas (85% id) Construção de árvores filogenéticas Cálculo da frequência de substituição de cada par de aminoácido Normalização das frequências: % de mudança ~ 5 milhões de anos (PAM)

100 Matrizes PAM de aminoácidos Point Accepted Mutation Em um período de 2 PAMs, pode ter havido A?, e então? D Extrapolação: PAM2 = PAM x PAM PAMy = PAM x PAM x... x PAM PAM2: 4% de identidade PAM25: 2% de identidade

101 Diagonal PAM25 Hidrofóbicos Hidrofílicos

102 Problemas das PAMs Inferida por um conjunto restrito de proteínas Extrapolação Muitas novas proteínas foram sequenciadas desde 78...

103 Matrizes BLOSUM de aminoácidos Henikoff & Henikoff, 992 Alinhamentos de blocos de vários grupos de proteínas relacionadas (banco de dados BLOCKS) Cálculo de frequência de substituição de cada par de aminoácido BLOSUMx: blocos de sequências com no máximo x% de identidade Ex: BLOSUM62 e BLOSUM85

104 BLOSUM62 Reference: Henikoff, S. and Henikoff, J. G. (992). Amino acid substitution matrices from protein blocks. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: A R N D C Q E G H I L K M F P S T W Y V B Z X * A 4 R 5 2 N 6 3 D C 9 Q E G 6 H 8 2 I L K 2 5 M 2 5 F 6 3 P 7 S 4 T 5 W 2 Y V 3 4 B Z X *

105 PAMs e BLOSUMs Para encontrar alinhamentos mais curtos e com maior similaridade: PAMs BLOSUMs Para encontrar alinhamentos mais longos e com menor similaridade: PAMs BLOSUMs

106 PAMs e BLOSUMs Para encontrar alinhamentos mais curtos e com maior similaridade: PAMs mais baixas BLOSUMs mais altas Para encontrar alinhamentos mais longos e com menor similaridade: PAMs BLOSUMs

107 PAMs e BLOSUMs Para encontrar alinhamentos mais curtos e com maior similaridade: PAMs mais baixas BLOSUMs mais altas Para encontrar alinhamentos mais longos e com menor similaridade: PAMs mais altas BLOSUMs mais baixas

108 Papel dos gaps Inserções / deleções MUITO ALTAS GLOBAL LOCAL Inibir trechos de gap Inibir trechos de gap maior alinhamentos ruins (muitos número de blocos mismatches) MUITO Muitos gaps espalhados pelo Muitos gaps espalhados pelo BAIXAS alinhamento (alinhamento alinhamento (alinhamento ruim) ruim e possivelmente maior do que deveria)

109 Exercícios

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111 Ex: Identidade e similaridade Qual é o melhor alinhamento? a) % b) 9% c) 74% d) 53% (/) (95/4) (8/8) (59/)

112 Ex - Matrizes BLOSUM Usando a matriz de escore default BLOSUM62, você encontrou duas proteínas que divergiram bem recentemente. Se você quiser refinar seu alinhamento, que matriz você deveria usar (com número mais alto ou mais baixo)?

113 Ex - Sequências de proteína x DNA Sequências de DNA são menos conservadas que sequências de aminoácidos, que por sua vez são menos conservadas que a estrutura de uma proteína Se você quer inferir função, qual das duas usar? Se você quer detalhes mais finos (ex: distância evolutiva), qual usar?

114 Referências Básico: O'Reilly - Caprichado (geral): Mount - Durbin R, Eddy S, Krogh A, Mitchison G. (998). Biological sequence analysis: probabilistic models of proteins and nucleic acids, Cambridge University Press, 998. BLAST: