IACB 1º Semestre de 2014/2015. Exercicios de Preparação para o Teste 1

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1 IACB 1º Semestre de 2014/2015 Exercicios de Preparação para o Teste 1 Introdução (0 ou 1 questão no teste 1) 1. O que é a BioInformática? Resposta: Bioinformática é um campo interdisciplinar que aplica as técnicas da ciência da computação, matemática aplicada e estatistica para resolver os problemas inspirados na biologia. Outra resposta possível: Bioinformática é a tecnologia de Tecnologias de Informação e Computadores (TIC) ao campo da biologia molecular. ps. Outras definições equivalentes são possíveis. 2. Porque é necessária a BioInformática? Tecnologias de sequenciamento de DNA têm criado enormes quantidades de informação que só podem ser analisados de forma eficiente com os computadores. Assim, com a quantidade massiva de informação disponível, e cada vez maior e mais complexa, são necessárias ferramentas computacionais para classificar os dados. A bioinformática permite aos cientistas inferior a localização dos genes simplesmente analisando dados de sequências usando um computador. 3. Dê 3 exemplos de aplicações da bioinformática Alinhamento de sequências, descoberta de genes, criação de medicamentos, descoberta da origem de doenças, previsão da estrutura de proteínas, interações proteína - proteína, modelação da evolução, etc.

2 Alinhamento de Pares de Sequências 1. Comente a seguinte frase: Nature is a tinkerer and not an inventor Francois Jacob (1977) [Evolution and tinkering, science 196: ] Do ponto de vista evolucionário, novas sequências são adaptadas a partir de sequências pré-existentes, em vez de serem inventadas de novo. Deste facto resulta que a semelhança de sequências (causada por um ancestral comum) é um indicador de homologia. 2. O que é o alinhamento de pares de sequências? Trata-se dum processo para decidir se um par de sequências são relacionadas do ponto de vista evolucionário, ou não, com base numa função de pontuação (ou de custo). 3. Indique três aplicações para o alinhamento de pares de sequências? Descubrir a função, encontrar características cruciais dentro de uma sequência, estudar o mecanismo da evolução, identificar a causa de doenças, procura em bases de dados, comparar um segmento sequenciado por laboratórios diferentes, etc. 4. Defina: a) Distância de Hamming Distância entre duas sequências de igual comprimento dada pelo número de posições nas quais os símbolos correspondentes nas duas sequências são diferentes. Distância de Hamming não é normalmente usado para comparar sequências de ADN ou de proteínas. b) Distância de Edição (Edit distance) Distância entre duas sequências definida como o número mínimo de operações de edição - inserções, eliminações e substituições - necessárias para transformar a primeira cadeia de caractéres na segunda. Correspondências não são contabilizadas. 5. Compare a distância de edição com a distância de Hamming. A distância de Hamming é equivalente à distância de Edição mas só com a operação de substituição. 6. Calcule a Distância de Hamming para as duas sequências ATTCG e ATCCA? ATTCG e ATCCA têm d H =2

3 7. Calcule a Distância de Edição para as duas sequências: TT-CGTCGTAGTCG-GC-TCGACC-TG GTACGTC-TAG-CGAGCGT-GATCCT A distância Longest common subsequence (LCS) é definida como a distância de Edição mas só com as operações de inserção e eliminação. Calcule a Distância LCS para as duas sequências ATTCG e ATCCA? ATT CG e AT CC A têm d LCS =4 9. Diga no que consiste o alinhamento global de um par de sequências Uma alinhamento (global) de duas cadeias de S1 e S2 é obtido inserindo primeiro buracos, quer no meio da sequência S1 e S2 quer nas extremidades, e depois colocando as duas cadeias resultantes uma acima da outra, de modo que cada caractér ou buraco em qualquer sequência fique em frente a um caractér único ou buraco único na outra sequência. 10. Nós vimos três tipos de alinhamento de pares de sequências nas aulas: global, local, e local com repetições. Explique quando cada tipo de alinhamento é a escolha adequada. O alinhamento global é a escolha apropriada quando já sabemos que as seqüências são relacionadas / simelhantes. Uma vez que um alinhamento global tenta encontrar o melhor alinhamento entre todo o comprimento do sequência, maximizando semelhanças e minimizando buracos, não faz muito sentido tentar fazer um alinhamento global de duas sequências que podem não compartilhar qualquer semelhança. O alinhamento local é a escolha correta quando não sabemos nada sobre a semelhança potencial entre as sequências. Alinhamento local pode detectar regiões semelhantes de sequências sem exigir que as sequências inteiras sejam semelhantes. Isso é útil por exemplo para fazer buscas em bases de dados, quando as sequências são de comprimentos diferentes, quando se está à procura por um domínio compartilhado, ou motivo, em proteínas. Nas sequências longas, é possível que existam muitos alinhamentos locais diferentes, com uma pontuação significativa. Por exemplo: muitas cópias de um domínio repetido ou motivo numa proteína. Este método encontra uma ou mais cópias não-sobrepostas de regiões de uma sequência na outra. 11. Buracos resultam de inserções ou eliminações no DNA. Indique dois mecanismos que fazem longas inserções ou remoções no DNA. Cruzamento desigual na meiose; Deslizamento DNA durante a replicação inserções de DNA por retro-vírus; etc...

4 12. Considere os seguintes alinhamentos de duas sequências: WEAGAWGHE-E WEAGAWGHE-E a) P-A--W-HEAE b) --P-AW-HEAE Qual deles é melhor? Justifique. Não é possivel responder com os dados disponíveis. Para alinhar duas sequências precisamos de um modelo quantitativo para avaliar a semelhança entre sequências. 13. Diga para que serve uma função de pontuação (score) no alinhamento de um par de sequências? Serve para quantificar a probabilidade (de acordo com a evolução) de um resíduo ser substituído por um outro num alinhamento (i.e. com base na probabilidade de esta substituição ser encontrada na natureza). 14. Considere uma função de pontuação S dada por S = s(s 1 (i), s 2 (i))+ G(g) i Sendo s(s1,s2) a pontuação para cada par alinhado de resíduos e G(g) as penalidades de buracos (gap penalties). Como se obtêm s(s1,s2), e G? A pontuação s(s1,s2) e as penalidades de buracos G(g) podem ser calculados usando diferentes modelos (matrizes de pontuação e.g. PAM, BLOSUM, modelos probabilisticos, etc). 15. Qual a pontuação do alinhamento seguinte WEGHAHGAE-P WPGH-H-AEHP Considere Gap penalty: -10 Gap extension penalty: -10 E use a matrix de substituição: A E G H P W A 5 E G H P W = 35

5 16. s(i, j) é a pontuação do alinhamento do par de aminoácidos (i, j). a) Qual é a interpretação de um valor positivo de s(i, j)? Um valor positivo para s(i, j) significa que a frequência observada de troca de i e j é maior do que a frequência esperada. Esta substituição é potencialmente favorável. De facto, identidades e substituições conservadoras serão mais prováveis nos alinhamentos do que o esperado por acaso, e por isso contribuem com os termos de pontuação positiva. b) Qual é a interpretação de um valor negativo de s(i, j)? Um valor negativo de s(i, j) significa que a frequência observada de troca de i e j é menor do que a frequência esperada. Esta substituição é desfavorecida. De facto, mudanças não-conservadores deverão ser observadas com menor frequência nos alinhamentos reais do que o esperado por acaso, e por isso contribuem com os termos de pontuação negativa. c) Qual é a interpretação de s(i, j) = 0? Um valor de 0 para s(i, j) significa que a frequência observada de troca de i e j é o mesmo que a frequência esperada. A substituição do i para j é neutro. 17. Conside uma porção da matriz de substituição DNAfull: Calcule a pontuação para o emparelhamento AGTCAG ACTCGG = 7

6 18 (a) Preencha os espaços em branco na tabela de programação dinâmica para determinar o melhor alinhamento global entre as sequências ACTG e CGGA. Suponha que uma correspondência idêntica é marcada com +3 e que correspondências entre simbolos diferentes, e buracos, são marcados cada com -1. C G G A A C T G -4 0 (b) Qual é o alinhamento óptimo correspondente à tabela na parte (a) e qual a sua pontuação? A pontuação deste alinhamento é 3. - C G G A A C T G Usando a matriz de substituição Blosum62 do Anexo B, e penalidade de buraco d = -10, e extensão de buraco e = -1, calcule a pontuação do seguinte alinhamento: ALSD--LHAHK ALLDEPFKAHQ = Considere o algoritmo de Needleman-Wunsch para o alinhamento global de sequências. Dadas as duas sequências: A = HEAGAWGHE, B = PAWHEAE, e usando a matriz de substituição Blosum62 do Anexo B, compare o alinhamento de uma sequência inteira com a outra, preenchendo a tabela. Indique também na tabela os caminhos possiveis, e descreva os emparelhamentos finais possiveis. Considere penalidade de buraco d = -2 e extensão de buraco e = -2. H E A G A W G H E P A W H E A E

7 H E A G A W G H E P A W H E A E Dois emparelhamentos com igual pontuação (15): HEAGAWGH--E --P-AW-HEAE e HEAGAWGHE-- --P-AW-HEAE 21. Considere agora o algoritmo de Smith-Waterman para o alinhamento local de sequências. Dadas as duas sequências: A = HEAGAWGHE, B = PAWHEAE e usando a matriz de substituição Blosum62 do Anexo B, compare uma sequência com a outra, preenchendo a tabela. Indique também na tabela os caminhos possiveis, e descreve os emparelhamentos finais possiveis. Considere penalidade de buraco d = -2 e extensão de buraco e = -2. P A W H E A E H E A G A W G H E H E A G A W G H E P A W H E A E

8 Emparelhamento local com pontuação (22): AWGHE AW-HE 22. Para os exercicios 20 e 21, compare os resultados obtidos, e relacione-os. No caso do emparelhamento local, as regiões HEAG da sequência A, assim como as regiões das extremidades P e AE da sequência B, não são emparelhadas, pois não são semelhante com nenhuma das regiões da outra sequência. Já o emparelhamento global tenta emparelhar as sequências em toda a sua extensão. 23. a) Considere agora o alinhamento local de sequências com correspondências repetidas (repeated matches). Dadas as duas sequências: A = HEAGAWGHE, B = PAWHEAE e usando a matriz de substituição Blosum62 do Anexo B, compare uma sequência com a outra, preenchendo a tabela. Indique também na tabela os caminhos possiveis, e descreva os emparelhamentos finais possiveis. Considere limiar T=8, penalidade de buraco d = -2 e extensão de buraco e = -2 P A W H E A E H E A G A W G H E H E A G A W G H E P A W H E A E Emparelhamento locais: AWGHE AW-HE e HEA HEA

9 b) Considere agora um valor de limiar T=16. Repita o exercicio para este valor, e comente. P A W H E A E H E A G A W G H E H E A G A W G H E P A W H E A E Emparelhamento locais: AWGHE AW-HE e HEA HEA Obteve-se os mesmos emparelhamentos que na questão anterior.

10 Procura de sequências em Bases de Dados 1. Indique dois modos, descrevendo-os, em que uma estratégia heuristica permite buscas em bases de dados mais rápidas e eficientes. 1) Reduzir o espaço de busca, retirando as regiões que não são úteis para os alinhamentos (e.g. filtragem das regiões de sequências de baixa complexidade), permitindo pesquisas mais rápidas, porque apenas uma fracção de todos os alinhamentos possíveis são examinados. 2) Executar estratégias de busca eficientes, através do pré-processamento da base de dados numa nova estrutura de dados para permitir o rápido acesso. 2. Qual o problema das regiões de baixa complexidade das sequências, razão pela qual devem ser filtradas? Não têm informação relevante, e produzem alinhamentos artificiais com alta pontuação que confundem o programa, o qual tenta encontrar as sequências reais significativas na base de dados. 3. Descreva os 3 passos principais do algoritmo de BLAST (Basic Local Alignment Search Tool). 1. Em primeiro lugar, identificar (da forma mais eficiente) alinhamentos curtos, quase exactos, de sequências. 2. Em seguida, estender todos os alinhamentos para procurar pares de sequência com maior pontuação, ou seja, regiões de semelhança mais longas. 3. Finalmente, optimizar o alinhamento usando um algoritmo exato. 4. Para o passo 1 da questão anterior, descreva os 3 sub-passos envolvidos. Dada uma sequência de pesquisa q, com comprimento de palavra w, um limite de pontuação T, e um segmento de limiar S: 1.1 Determinar todas as palavras de comprimento w na sequência de consulta 1.2 Para cada uma das palavras q Fazer uma lista de palavras vizinhas de comprimento w, com pontuação T quando comparada com a palavra q, e acrescentar à lista global de palavras 1.3 Pesquisar a base de dados para correspondências de todas as palavras da lista em 1. Resultado: Pares de segmentos com pontuação S

11 5. Considere w=3, T=5, e o passo 1 para procurar pela sequência W= ATTGC numa base de dados. Para tal: a) Determine primeiro todas as palavras de comprimento w na sequência ATCG {ATC, TCG} b) Para cada uma das palavras q que achou, conside uma porção da matriz de substituição DNAfull: Fazer uma lista de palavras vizinhas de comprimento w, com pontuação T quando comparada com a palavra q. Indique a lista global de palavras. ATC, ATA, ATG, ATT, TTC, GTC, CTC, ATA, ATG, ATT TCG, TCA, TCT, TCC, ACG, CCG, GCG, TCA, TCC, TCT 6. Para uma sequência de nucleotides, e w = 6, quantas correspondências possiveis existem? 4^6 = 2^12 = Considere a sequência CSTWYFSAG a) Determine todas as palavras de comprimento 2 na sequência. {CS, ST, TW, WY, YF, FS, SA, AG} b) Considere a palavra CS, e a matrix BLOSUM62 no Anexo E. Fazer uma lista de palavras vizinhas de comprimento 2, com pontuação T 10, quando comparada com esta palavra. {CS: 13, CT: 10, CA: 10, CN: 10} 8. Diga qual das seguintes opções é incorrecta. O BLAST reporta resultados usando 1. raw score, 2. bit score 3. significance score 4. sequence score 5. todas anteriores 4

12 9. Diga o que entende por raw score (pontuação em bruto) do BLAST. o raw score é a pontuação do alinhamento com base no sistema de pontuação e matriz de pontuação utilizado. 10. Diga o que entende pelo bit score do BLAST. O bit score é calculado a partir da pontuação bruta usando uma fórmula que normaliza este em relação ao sistema de pontuação. Portanto bit scores obtidos em buscas que utilizam sistemas diferentes de pontuação são comparáveis. 11. Diga qual a resposta correcta em relação à expressão para cálculo do E-value: 4 1. m e n representam o tamanho da sequência a pesquisar 2. a scores S maiores correspondem E-values maiores 3. E não varia com o tamanho da base de dados onde é efectuada a busca 4. Nenhuma das anteriores 12. Temos duas bases de dados de sequências: A e B. Base de Dados A contém 20 mil de sequências. Base de Dados B contém de sequências. Procuramos a mesma sequência de consulta em relação a ambas as bases de dados. Os resultados mostram que: O melhor hit na base de dados A é com a sequência x, e o seu valor é de E = O melhor hit na base de dados B é com a sequência y, e o seu valor é de E = Pergunta: Se nós apenas alinharmos a sequência de consulta com sequências x e y, qual o alinhamento de pares que seria mais significativo - consulta com x ou consulta com y? Assumindo número médio de resíduos por sequência é R, semelhante nas duas bases de dados. Seriam ambos iguais. E=Kmnexp(-λs) ó s=-1/λ ln(e/(kmn)) X in A: s=-1/λ ln(10-12 /(Km)) = Y in B: s=-1/λ ln(10-12 /(Km))

13 13. Faça a correspondência correcta, preenchendo a tabela de forma apropriada com as palavras relacionadas e não relacionadas : True positives (TP) False positives (FP) True negatives (TN) False negatives (FN) Sequências Identificadas como Sequências Identificadas como True positives (TP) relacionadas relacionadas False positives (FP) não relacionadas relacionadas True negatives (TN) não relacionadas não relacionadas False negatives (FN) relacionadas não relacionadas 14. Qual a pontuação do alinhamento seguinte WEHWAGGHAE---P P-HE--G-AEAWHP Considere Gap penalty: -10 Gap extension penalty: -1 E use a matrix de substituição: A E G H P W A 5 E G H P W = -7

14 Alinhamento Múltiplo de Sequências 1. Considere o seguinte alinhamento multiplo de sequências de DNA: S 1 - G A G C S 2 C T A G A S 3 C G A - A S 4 A G C G A Complete a tabela seguinte com o perfil médio das frequências de ocorrência, correspondente ao alinhamento em cima, A C T G A C T G Alinhamentos múltiplos se sequências (AMS) podem revelar semelhanças subtis que alinhamentos de pares de sequências não revelam. Dê um exemplo. e.g. 1) Correspondência: Descubrir quais as regiões das sequências que têm a mesma função. Genes semelhantes são conservados entre espécies muito divergentes, e muitas vezes desempenham funções semelhantes e.g. 2) Predição da estrutura:usar o conhecimento da estrutura de um ou mais membros de uma proteína através do AMS para prever a estrutura de outros membros. e.g. 3) Criar "perfis" para famílias de proteínas. Permitam-nos a procurar outros membros da família. e.g. 4) AMS é o ponto de partida para a análise filogenética 3. Complete o sistema de equações para a busca exaustiva de alinhamentos multiplos de sequências usando programação dinâmica em 3D.

15 (i-1,j-1,k-1) (i,j-1,k-1) (i,j-1,k) (i-1,j-1,k) (i,j,k-1) (i-1,j,k-1) (i-1,j,k) (i,j,k) F i,j,k "="max" " " " " F i-1,j-1,k-1 + δ(v i, w j, u k )! F i-1,j-1,k! + δ"(v i, w j, _ )! F i-1,j,k-1! + δ"(v i, _, u k )! F i,j-1,k-1! + δ"(_, w j, u k )! F i-1,j,k! + δ"(v i, _, _)! F i,j-1,k! + δ"(_, w j, _)! F i,j,k-1! + δ"(_, _, u k )!! δ(x,'y,'z)"is"an"entry"in"the"32d"scoring"matrix" Sabendo que F 1,1,1 = 1 F 1,1,2 = 8 F 1,2,1 = 16 F 1,2,2 = 7 F 2,1,1 = 3 F 2,1,2 = 27 F 2,2,1 = 5 δ (x,y,z) = -10 se houver um buraco (e.g. δ ( _,y 1=>2,z 1=>2 )=-10), e δ (x,y,z) = -15 se houver dois buracos (e.g. δ ( _,_,z 1=>2 )=-15), e a pontuação de uma correspondência exacta é de +10. a) calcule F 2,2,2 F 2,2,2 =max(1+10, 8-10,16-10, 7-15, 3-10, 27-15, 5-15)=max(11,-2,6,-8,-7,12,-10)=12. b) Quantas vezes teria que repetir o passo anterior para o alinhamento multiplo de 3 sequências, cada uma de comprimento 10? Para 3 sequencias de comprimento 10, o passo anterior tem que ser executado 10 3 =1000 vezes (dimensão da matriz 3D da programação dinâmica). 4. Considere o passo 1 do Clustal e a seguinte matriz de semelhança: S1 S2 S3 S4 S1 - S S S a) O que representa o valor de 0.50 entre S3 e S4? Representa o nível de semelhança entre as duas sequências b) Como é calculado esse valor?

16 É obtido pela divisão do número de correspondências exactas pelo comprimento da sequência. c) Considere S1=ATCCG, S2=AAAAG, e S3=GGGCG. A tabela dada foi bem calculada? Justifique. S1 e S3 têm 40% de semelhança, como indicado na tabela. S2 e S3 têm 20% de semelhança, como indicado na tabela. S1 e S2 partilham 40% dos simbolos, o que é diferente do valor de 30% indicado na tabela, pelo que a tabela está incorrecta. 4. Considere o passo 1 do Clustal. Construa a matrix de semelhança para as 5 seguintes sequências: s1=atcg s2=agct s3=agcc s4=atat Calcule a matriz de semelhança. S1 S2 S3 S4 S1 S2 S3 S4 S1 S2 S3 S4 S1 - S S S

17 Anexo A: Matrix de Substituição Anexo B: Blosum62