Métodos de alinhamento de sequências biológicas. Marcelo Falsarella Carazzolle

Transcrição

1 Métodos de alinhamento de sequências biológicas Marcelo Falsarella Carazzolle

2 Resumo - Introdução - Alinhamentos ótimos - Global - Local (Smith-Waterman) - Semi global - Matrizes de alinhamento (BLOSUM) - Alinhamentos heurísticos - BLAST -PHI-BLAST, PSI-BLAST, MEGABLAST e BLAST2SEQS

3 Introdução? - Uma forma rápida de agregar alguma informação sobre uma sequência desconhecida é compará-la com um banco de dados de sequências com funções conhecidas - Esta comparação é feita através de alinhamentos par a par entre as sequências. Isto é, se o banco de dados possuir 1000 sequências conhecidas serão realizados 1000 alinhamentos

4 - Tipicamente são usados os bancos de dados mundiais (NCBI, EMBL) Fonte: - Atualmente uma busca nesses bancos faz 100,000,000 de alinhamentos

5 - Existem vários programas de alinhamentos com diferentes metodologias, sendo que o mais utilizado é o BLAST

6 Relevância biológica - Essencialmente esses alinhamentos devem tentar indicar uma homologia entre as sequências (ou pelos menos terem uma similaridade estatisticamente significante) - Similaridade x Homologia - identidade = número que indica a quantidade de nucleotídeos alinhados - similaridade = é uma medida que considera a probabilidade do alinhamento ter ocorrido por acaso (e-value). Considera todos os outros possíveis alinhamentos - homologia = similaridade entre sequências que dividem a mesma ancestralidade. Possui um significado evolutivo

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8 E-value x probabilidade E-v value = 1 x 10-5 = 1e -5 1e -10 1e -50 1e e Probabilidade do alinham mento ocorrer por acaso Quanto maior o banco de dados, maior o e-value

9 Outras aplicações de alinhamentos - Reconstrução da sequência consensu a partir de sobreposições de fragmentos de sequências (montagens de sequências de DNA) - Alinhamento entre sequências de ESTs e DNA genômico - Comparação entre proteínas e DNA - Construção de mapas físicos - Comparação entre genomas -...

10 Alinhamentos - A comparação entre sequências de DNA de organismos diferentes é baseada no conceito de que estes organismos originaram-se de um ancestral comum. - No contexto de evolução as sequências de DNA sofrem mutações. Estas modificações locais entre os nucleotídeos podem ser : - Inserções : inserção de uma base ou várias bases na sequência - Deleções : deleção de uma base ou mais bases na sequência - Substituições : substituição de uma base por outra - Portanto um programa de alinhamento de sequências biológicas tem que considerar essas mutações

11 Exemplo : Gap = -2 Match = 1 Mismatch = -1 - Gaps representam as inserções e deleções entre as sequências - O melhor alinhamento entre duas sequências é aquele que maximiza o score : - Score = #Matchs * (1) + #Mismatch * (-1) + #Gaps * (-2) = = 10

12 - Alinhamento global Modelos para alinhamentos - útil quando as duas sequências tem tamanhos próximos - Exemplo de programa : CLUSTAL - Alinhamento local - útil para alinhamento entre sequências de tamanhos diferentes e também para sequências com apenas alguns trechos conservados - Exemplo de programa : BLAST E FASTA - Alinhamento semi-global (ou pontas livres) - útil para encontrar sobreposições de fragmentos de sequenciamento - Exemplo de programa : PHRAP E CAP3

13 Programação dinâmica - Motivação : gerar e testar o score de todos os possíveis alinhamentos é exponencial no tamanho das seqüências (n n ), onde n é o tamanho das sequências : - Se o alinhamento de 2 sequências de 100 pb leva 1 segundo, o alinhamento de duas sequências de 1000 bp levaria trilhões de anos. - Abordagem alternativa : programação dinâmica. Com programação dinâmica o tempo de processamento e memória ficam quadráticos (n 2 ): - Se o alinhamento de 2 sequências de 100 pb leva 1 segundo, o alinhamento de 2 sequências de 1000 pb leva 100 segundos - Mas ainda não está bom, pois alinhamento de sequências de 10 Mpb (genoma de Saccharomyces) levaria 377 anos

14 Alinhamento global - Alinhamento de GACATTG com GATCAATG 1 a linha e 1 a coluna da matriz são fáceis de computar: - G A C A T T G G -2 A -4 G GA T -6 C -8 A -10 A -12 T -14 G Lembre-se, penalidade de 1 gap = -2 e de dois gaps = -4

15 - G A C A T T G G -2 A -4 T -6 C -8 A -10 A -12 [i,j]=p(i,j) T -14 G Para um elemento da matriz [i,j] qualquer, temos p(i,j) = 1 se for um match e p(i,j) = -1 se for um mismatch.

16 - G A C A T T G G -2 A -4 T -6 C -8 A -10 A -12 T -14 G -16 [i-1,j-1] [i,j-1] [i-1,j] [i,j] = max([i-1,j] - 2, [i-1,j-1] + p(i,j), [i,j-1] - 2) - O valor de [i,j] é definido exclusivamente pelos elementos [i-1,j-1] (diagonal), [i,j-1] (esquerda) e [i-1,j] (acima).

17 - Construindo o alinhamento A 0-2 G C -4-6 A A A C No alinhamento global o alinhamento deve ser construído a partir do extremo da matriz

18 Alinhamento local (Smith-Waterman) - G A C A T T G G 0 A 0 T 0 C 0 A 0 A 0 T 0 G 0 [i-1,j-1] [i,j-1] [i-1,j] [i,j] = max([i-1,j] - 2, [i-1,j-1] + p(i,j), [i,j-1] 2, 0 zero) - No alinhamento local a primeira linha e coluna são inicializadas com zeros e os valores [i,j] da matriz inteira nunca ficam menores que zero

19 No alinhamento local o alinhamento deve ser construído partir do maior score da matriz e para quando encontrar um score=0

20 Alinhamento semi-global - Não penaliza espaços nas extremidades do alinhamento. - Exemplo CAGCA CTTGGATTCTCGC CAGCGTGG No global teríamos, CAGCA CTTGGATTCTCGC CAGC G- T Qual dos dois alinhamentos é mais interessante?

21 - No alinhamento semi-global a primeira linha e coluna são inicializadas com zeros. O resto é igual ao alinhamento global

22 - A abordagem de programação dinâmica é importante pois garante o melhor alinhamento entre duas seguências, mas ainda temos um problema : - Lembram-se disso : se o alinhamento de 2 sequências de 100 pb leva 1 segundo, o alinhamento de sequências de 10 Mpb (genoma de Saccharomyces) leva 377 anos - A abordagem alternativa é conhecida como o método de k-tuplas, no qual não é garantido encontrar o alinhamento ótimo (heurística) mas é significantemente mais rápido. Com esse método os conceitos de alinhamento discutidos acima foram modificados dando origem aos programas de alinhamento local : - BLAST (Basic Local Align Sequence Tool) : Nucleic Acid Research 25 (1990), FASTA : PNAS 85 (1988), Basicamente este método identifica uma série de palavras curtas em uma das sequências (word size) e depois realiza uma busca exata por essas palavras nas sequências a serem comparadas, filtrando assim os possíveis candidatos.

23 Alinhando proteínas - Alinhamento proteína-proteína - Alinhamento nucleotídeo-proteína - Alinhamento proteína-nucleotídeo - Alinhamento nucleotídeo-nucleotídeo (feito em proteínas)

24 Matrizes de substituição - BLOSUM (BLOcks of amino acid SUbstitution Matrix ) - I e V => Hidrofóbicos - D e W => D (carga negativa) e W (aromático) - C => pontes de sulfeto (estrutural)

25 - A matriz foi construída a partir de alinhamentos múltiplos globais de 504 grupos de proteínas - BLOSUM 62 : grupos com similaridade >62% - BLOSUM 80 : grupos com similaridade >80% - BLOSUM 45 : grupos com similaridade >45% Query Length Substitution Matrix <35 PAM PAM BLOSUM-80 >85 BLOSUM-62 PNAS 89 (1992),

26 BLAST Basic Local Alignment Search Tool Algoritmo BLAST (Alstchul et al.; 1990 J. Biol., 215, ) Implementações: NCBI BLAST e WU-BLAST Acesso via web / local (linux) Consulta de seqüências em BDs biológicos (nt ou proteínas) Alinhamento sobreposição de trechos semelhante de duas seqüências (seqs). BLAST traz pontuação e mostra alinhamentos. Similaridade grau de semelhança de seqs num alinhamento. Homologia genes com ancestral comum

27 BDs nucleotídeos, proteínas, domínios, genomas específicos, dados particulares Blastp prot / prot (distantes) Blastn nt / nt (próximos) Blastx nt trad / prot (novas seqs) Tblastn prot / nt trad (regiões não anotadas) Tblastx nt trad / nt trad

28 Query BD Compara Programa nt nt nt blastn nt (trad) aa aa blastx aa aa aa blastp aa nt (trad) aa tblastn nt (trad) nt (trad) aa tblastx Query = formato da seq de entrada. BD = formato das seqs do BD. nt (trad) = seq em nt traduzida pelo programa. Compara = o que é comparado, nucleotídeos (nt) ou aminoácidos (aa). Programa = um dos cinco principais tipos de blast.

29 BLAST interface

30 BLASTp

31 Limita a região da sequência que será usada na consulta Pode ser usado um arquivo com várias sequências gravadas no formato fasta Pode ser colocado várias sequências ao mesmo tempo ou vários GI s (genbank identifier)

32 Filtro por organismo, use o banco de taxonomia do NCBI para ver a forma correta de escrever o organismo Banco de dados de proteínas do NCBI Filtros mais elaborados usando as opções avançadas de busca do NCBI : protease NOT hiv1[organism] => retornará apenas resultados com proteases que não sejam do organismo HIV 1 Banco de dados de proteínas curadas pelo EBI Banco de dados de proteínas com a estrutura tridimensional conhecida

33 Número máximo de sequências alinhadas E-value de corte Número de bases que serão utilizados para formar as k-tuplas Altera as penalidades de criação e extensão de gaps no alinhamento Mascara regiões de repetição

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36 Link Corte 1e -5

37 1 64 query subject

38 BLASTx diferenças importantes Diferentes códigos genéticos para diferentes organismos

39 A mudança no frame de leitura gera a quebra do alinhamento formando dois HSP s (high scoring pair) query subject

40 Pode ser instalado localmente Bancos de dados próprios e atualizações Facilidades Velocidade de buscas Maleabilidade Automatização Dados locais Independe de internet BLAST local

41 PHI-BLAST - É um blastp com a opção de passar uma outra sequência curta ou um padrão servindo como um vínculo para a consulta N - Qualquer nucleotídeo N(3) - Uma sequência de três nucleotídeos N(2,4) - Uma sequência de 2,3 ou 4 nucleotídeos [AC] - pode ser um A ou um C {AG} - não pode ser nem A e nem G Ex : [CG](5)TG{A}N(1,5)C

42 PSI-BLAST - É um blastp interativo no qual a matriz (BLOSUM), após a primeira interação, é refeita com base nos alinhamentos entre as proteínas resultantes da consulta : - uma posicão conservada no alinhamento recebe um score alto e uma posição não conservada um score baixo - É útil para encontrar membros distantes de famílias de proteínas

43 BL2SEQS - Faz um alinhamento de uma sequência contra a outra (blastn/blastx/blastp/tblastx/tblastn) -

44 Spliced alignments

45 Alinhamento de genomas

46 FIM