Comparação entre sequências biológicas

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1 Comparação entre sequências biológicas Extraíndo e analisando os sinais contidos em biopolímeros ( Alinhamentos ) Prof. Dr. Alessandro Varani UNESP - FCAV

2 Objetivos Abordagens práticas para comparação de sequências; Como comparar? Inferências biológicas e evolutivas geradas a partir da comparação de sequências. Como analisar e interpretar os resultados?

3 Parte 1 Introdução e Conceitos

4 O primeiro fato na análise de sequências biológicas. Dan Gusfield (1997) "Em sequências biomoleculares, uma alta similaridade de sequência frequentemente implica em grande similaridade funcional e estrutural." "Em sequências biomoleculares, alta similaridade de sequência também implica, muito frequentemente, em relação evolutiva."

5 Prólogo (1): Conceitos Básicos Dilema da causalidade ovo ou a galinha? Estrutura de uma biomolécula Genômica estrutural Tábuas da Saúde (Tacuinum sanitatis) Pode ser fisicamente definida: (a) Amostra pura da proteína; (b) Um local apropriado para crescer os cristais; (c) Uma linha de luz sincroton. Sítio catalítico da transposase Bacteriófago Mu

6 Prólogo (2): Conceitos Básicos Função de uma biomolécula Genômica Funcional (Bioquímica) Não é somente uma característica física, mas a descrição de um determinado processo biológico; Só pode ser determinada dentro de um contexto biológico; A função também envolve interações com outras moléculas que também precisam ser identificadas e com função desvendada;

7 Prólogo (3): Conceitos Básicos Função de uma biomolécula Genômica Funcional (Bioquímica) Normalmente, para se definir a função biológica de uma biomolécula, é preciso verificar as interações de muitos componentes num extrato celular, na célula inteira, nos organismos vivos, ou dentro de um ecossistema no qual o organismo seja uma parte. Logo que a função de uma proteína é realizada, sua estrutura pode mudar. Protein Structural Change upon Ligand Binding Correlates with Enzymatic Reaction Mechanism Koike et al., 2008

8 Prólogo (4): Conceitos Básicos Estrutura e Função de uma Biomolécula Apesar de serem geralmente observáveis, não é uma correlação trivial a ser feita! Durante um projeto que envolva a análise e comparação de sequencias biomoleculares, levar em consideração todas as nuances possíveis entre a relação estrutura e função é de fundamental importância. Não basta apenas apelar para o resultado que o computador fornece.

9 Prólogo (5): Conceitos Básicos Com base na similaridade de sequencias: Similaridade de estrutura Similaridade de função Ancestralidade comum Hoffmann et al., PNAS (2010)

10 Prólogo (6): Conclusões A inferência de estrutura e função é inseparável da inferência evolutiva; Quando sequências provenientes de duas biomoléculas são comparadas, nosso caminho a partir da similaridade de sequência até chegar à conclusão sobre similaridade funcional e estrutural nunca é direta; Inversamente, sempre inferimos primeiramente a ancestralidade comum entre sequências e, só a partir daí é que se pode partir para a inferência de estrutura e função. Essa lógica não é óbvia quando a similaridade é muito alta, mas se duas sequências são mais distantemente e relacionadas uma à outra, essa cadeia de raciocínio precisa tornar-se explícita.

11 Prólogo (7): Conclusões Medimos a similaridade entre sequências e imediatamente usamos estatísticas para comparar a similaridade observada com o que seria esperado ao acaso; Se a similaridade é muito alta para ocorrer ao acaso, isso é frequentemente considerado suficiente para a realização de predições sobre a função protéica e estrutural. A única razão pela qual este raciocínio funciona é porque a única forma de uma similaridade de sequência não-aleatória ocorrer é através da descendência a partir de um ancestral comum das duas sequências. (O que é chamado de inferência por homologia) ; Portanto, a inferência das relações evolutivas, torna-se um pré-requisito para a proposição de outras relações, como a estrutura e a função.

12 Prólogo (8): Proteínas Em contrapartida com funções similares não precisam ter sequências similares, e proteínas com estruturas similares também podem apresentar sequências diferentes; Biomoléculas apresentando funções similares podem ter perdido a similaridade de sequência mas, de outra forma, elas podem não ter nunca compartilhado similaridades mas terem convergido para a mesma função a partir de sequências completamente divergentes evolutivamente. Este princípio se aplica a estruturas também: a similaridade de estruturas na ausência de similaridade de sequência pode representar tanto a extrema divergência de sequencias que foram inicialmente similares quanto a convergência de sequências que não eram similares inicialmente; A distinção entre divergência e convergência em nível molecular é um dos problemas mais importantes.

13 Como inferir a ancestralidade comum, estrutura e função? B A C Somente A foi estudada Gene Pti1: Codifica uma serina/treonina kinase Praticamente idênticas Parecida (bastante próxima) Nem todos os resíduos de aminoácidos precisam ser conservados entre A e B para determinar o ancestralidade comum. Por exemplo, podemos não considerar os sítios conservados exclusivamente entre A e B porque não precisamos destes resíduos para reconhecer a similaridade entre A e a sequência mais distante C, tanto quanto a similaridade entre B e C.

14 Como inferir a ancestralidade comum, estrutura e função? B A C Somente A foi estudada Gene Pti1: Codifica uma serina/treonina kinase Praticamente idênticas Parecida (bastante próxima) De outra forma, quando fazemos a seguinte inferência: "as sequências proximamente relacionadas A e B são mais prováveis de apresentarem a mesma função, mas a sequência mais distante C pode apresentar uma função diferente" nós, na verdade, estamos usando a informação sobre os sítios conservados apenas entre A e B, mas não entre cada uma delas de C. Assim, as informações evolutivas, estruturais e funcionais estão entremeadas nas sequências de forma sutil.

15 Como inferir a ancestralidade comum, estrutura e função? Os biopolímeros contêm informação sobre sua evolução, estrutura e função; e esses três tipos de sinal podem interagir em diferentes formas, algumas vezes aumentando e outras vezes interferindo umas com as outras. LUCA Serina / treonina kinase

16 "Nothing in Biology Makes Sense Except in the Light of Evolution (1973)" Theodosius Dobzhansky ( ) " Quase nada no campo da biologia computacional (bioinformática) faz sentido, exceto à luz da comparação de sequencias biomoleculares "

17 Definição de Conceitos Homologia: Mesmo ancestral comum; Parálogos: Duplicação; Analogia: Mesma função origem diferente; Xenólogos: Transferência Lateral Ortologia: Especiação; Kristensen D M et al. Brief Bioinform 2011;12:

18 Introdução: A Semântica O Alfabeto Aminoácidos e nucleotídeos Nucleotídeos

19 Introdução: A Semântica O Alfabeto Aminoácidos

20 Introdução:A sintaxe: regras para a leitura da Inf. Biológica Código Genético

21 Introdução: A sintaxe, regras para a leitura da inf. Biológica Quadros de Leitura 5' ATGACCAATCAAATTACAATACCTAGTGGCCCCGACCTGATGATGCGTAA GACCAATCAAATTACAATACCTAGTGGCCCCGACCTGATGATGCGTAA TGACCAATCAAATTACAATACCTAGTGGCCCCGACCTGATGATGCGTAA ATGACCAATCAAATTACAATACCTAGTGGCCCCGACCTGATGATGCGTAA AATACCAATCAAATTACAATACCTAGTGGCCCCGACCTGATGATGCGGTA AATACCAATCAAATTACAATACCTAGTGGCCCCGACCTGATGATGCGGT AATACCAATCAAATTACAATACCTAGTGGCCCCGACCTGATGATGCGG 3'

22 Parte 2 Alinhamentos de Sequências

23 Análise Comparativa: Alinhamentos Objetivo Encontrar sinais biológicos a respeito da evolução, estrutura e função através do estudo da similaridade entre as sequências par ); (Ex. Alinhamento par-a- Estudo de similaridades (identificação de domínios) entre sequências que já sabemos que são relacionadas, e que conhecemos, pelo menos em parte, de seus sinais biológicos (Ex. Alinhamento Múltiplo ). Não é apenas a construção de um alinhamento...

24 Análise Comparativa: Alinhamentos Demanda Este é atualmente um dos problemas mais importante de toda a bioinformática (biologia computacional), dado o número e diversidade de seqüências existentes e dada a frequência com que ele precisa ser resolvido diariamente pelo mundo a fora.

25 Alinhamentos Análise por comparação entre sequências biomoleculares Uso de algoritmos que permitem comparar uma sequência objeto com um banco de dados de sequências biomoleculares; A comparação é feita alinhando-se a sequência objeto a sequências alvo de um banco de dados; A cada comparação é dado um valor, que é a medida de similaridade entre um par de sequências; A discriminação entre pares reais e artificiais é feita através de uma estimativa da probabilidade que o pareamento tenha ocorrido ao acaso. Algoritmos Conjunto finito de instruções, bem definidas e não ambíguas, sendo executadas em um período de tempo finito e com a quantidade de esforço finito.

26 Algoritmo : Princípio

27 Algoritmo : Princípio

28 Alinhamentos Análise por comparação entre sequências biomoleculares Em termos simples: Fazer um encaixe

29 Alinhamentos Conceito de escore (score ou pontuação) Forma de quantificar os alinhamentos; Caso Simples de Pontuação: +1 para quando ocorrer o pareamento entre polímeros idênticos, -1 quando não há pareamento, -2 para quando houver um gap (abertura de uma lacuna para favorecer o pareamento em outra região)

30 Alinhamentos Conceito de escore (score ou pontuação) Matriz bidimensional de substituição Logo voltamos a falar...

31 Alinhamentos Conceito de escore (score ou pontuação) Novo score

32 Alinhamentos: Conceitos e Desafios Alinhamento pode ser entre pares de sequências ou múltiplos ; Métodos de alinhamento de sequencias: GLOBAL ou LOCAL : Global Needleman-Wunsch 1970 Local Smith-Waterman 1981 Estatísticas para alinhamentos LOCAIS são bem definidas, enquanto para alinhamentos GLOBAIS ainda não são (Altschul, 2006); É importante definir se a similaridade é GLOBAL ou LOCAL.

33 Alinhamentos: Conceitos e Desafios Exemplos: global vs local

34 Alinhamentos: Conceitos e Desafios Alinhamento entre pares de sequências Programação Dinâmica Busca por soluções de problemas por meio de uma sequências de sub problemas semelhantes Menor número de operações para determinar a similaridade Este método resolve o problema de otimização do algoritmo, porém não resolve o X biológico da questão; Sensitividade tem que ser definida pela similaridade e distância entre as sequências que serão comparadas. <<Matriz de Pontuação>>

35 Alinhamentos: Conceitos e Desafios Programação Dinâmica (PD) A abordagem convencional testa todos os possíveis alinhamentos e é n exponencial ao tamanho da sequências ( n ); Se duas sequências a serem comparadas que tem 100bp a comparação leva 1 segundo, duas sequências de 1.000bp levariam =? PD procura por todas as soluções possíveis e encontra a solução ótima, e o tempo 2 de processamento fica quadrático ( n ); Também pode ser muito lento e custoso em termos computacionais, dependendo do tamanho das sequências: Se duas sequências de 100bp levam 1 segundo, duas de 1.000bp levaria 100 segundos, porém: Por exemplo, a comparação entre o genoma de dois fungo com 20 Mb, levaria aproximadamente 750 anos.

36 Alinhamentos: Conceitos e Desafios Problema do Caixeiro-Viajante NP-Completo: Complexidade Exponencial

37 Alinhamentos: Conceitos e Desafios Exemplo 1 - GLOBAL Alinhando as palavras "PELICAN" and "COELACANTH." Iniciando a matriz de alinhamento!

38 Alinhamentos: Conceitos e Desafios Exemplo 1 - GLOBAL Iniciando o alinhamento: Direção -> Flanco superior esquerdo ao flanco inferior direito Movimentos na vertical ou horizontal indicaram lacunas (gaps) As setas indicam a origem/direção do alinhamento.

39 Alinhamentos: Conceitos e Desafios Exemplo 1 - GLOBAL Alinhando P com C e calculando o score +1 para semelhanças / -1 para diferenças Cálculo do score: -1 Maior valor Indica para onde a seta vai apontar +1 Match -1 Mismatch Ordem: Azul escuro, verde vermelho

40 Alinhamentos: Conceitos e Desafios Exemplo 1 - GLOBAL Continuando o processo Score = -2 (Verde + Azul Escuro) + o valor anterior

41 Alinhamentos: Conceitos e Desafios Exemplo 1 - GLOBAL Seguindo o mesmo método completa-se a matriz

42 Alinhamentos: Conceitos e Desafios Exemplo 1 - GLOBAL O melhor alinhamento é escolhido através do método de rastreamento COELACANTH -PELICAN-Começa aqui

43 Alinhamentos: Conceitos e Desafios No alinhamento GLOBAL o alinhamento é construído a partir do extremo da matriz, enquanto no alinhamento LOCAL a primeira linha e coluna são inicializadas com zero e o alinhamento é construído a partir do maior score da matriz e para quando encontra zero. Também há uma terceira modalidade de alinhamento chamada de Alinhamento Semi-Global, cujo princípio não penaliza as extremidades do alinhamento. (Ex. Montagem de Genomas, em programas como por exemplo phrap e CAP3) CAGCA CTTGGATTCTCGC CAGCA CTTGGATTCTCGC CAGCGTGG CAGC G- T Semi-global Global

44 Alinhamentos: Conceitos e Desafios Mesmo utilizando-se boas metodologias de pontuação, o algoritmo de alinhamento irá alinhar qualquer coisas, contendo ou não um sinal biológico. O algoritmo nunca irá dizer se a melhor pontuação é boa o suficiente para indicar o sinal biológico que está sendo procurado; Para escolher sinais biologicamente importantes é necessário uma abordagem estatística para avaliar os alinhamentos e compará-los com um padrão (O programa BLAST por exemplo); Porém mesmo assim, muitos resultados de alinhamentos permanecem em uma região chamada de twilight zone ou na bordas da significância estatística. (ou seja, a homologia não é garantida!) exemplos mais pra frente!

45 Alinhamentos: Conceitos e Desafios Desafio A B C S -> e o alinhamento entre A e B apresenta uma pontuação alta e se o alinhamento entre B e C também apresentar uma pontuação boa, isso não informará absolutamente nada a respeito da pontuação entre A e C. P -> orém em muitas buscas por comparação em banco de dados, muitos resultados indistinguíveis (twilight zone) não são mostrados ( A e C ) a menos que o investigador já conheça a respeito da similaridade entre A e B.

46 Alinhamentos: Conceitos e Desafios A questão da introdução de gaps (lacunas) -> Durante o alinhamento, gaps são introduzidos deliberadamente de acordo com a regras de pontuação; -> Processos biológicos de replicação, recombinação, e reparo, podem ocasionalmente levar a inserção ou deleção de nucleotídeos; -> OK! Justificamos a função de introdução de gaps nos alinhamentos; -> Porém quando introduzidos no alinhamento indicam sinais biológicos; -> As garantias da qualidade da introdução de gaps depende também dos métodos de pontuação do alinhamento. PAWHEAE HEAGAWGHEE ---PAW-HEAE HEAGAWGHEE-

47 Alinhamentos: Conceitos e Desafios A questão da introdução de gaps (lacunas) Métodos de pontuação de gaps foram selecionados por tentativa e erro nos últimos anos... e a maioria dos programas de alinhamento possuem um mesmo valor padrão de pontuação. Se os usuários precisarem utilizar pontuações diferentes, não haverá garantias que os resultados serão apropriados... Uma pontuação alta para abertura de um gap e uma pontuação menor para extensão de um gap tem provado ser a melhor escolha... (Altschul, 2006) Tutorial on-line do BLAST PAWHEAE HEAGAWGHEE ---PAW-HEAE HEAGAWGHEE-

48 Alinhamentos: Conceitos e Desafios Matrizes de pontuação A -> ssociar a informação que temos a respeito da similaridade e distância dos sinais biológicos dos biopolímeros que estão sendo comparados para ser utilizado como forma de pontuar o alinhamento; C -> ontém valores proporcionais a probabilidade de um aminoácido x ser substituído por um aminoácido y ; -> 4x4 = 16 combinações possíveis para nucleotídeos -> 20x20 = 400 Combinações possíveis para aminoácidos

49 Alinhamentos: Conceitos e Desafios Matrizes de pontuação Inicialmente discutido no trabalho seminal de Zuckerkandl e Pauling em 1965 Molecules as Documents of Evolutionary History ; -> Problema: Precisam ser valores numéricos, porém como quantificar? Ácido Aspártico e Glutâmico (D e E) apresentam grupos carboxila na cadeia lateral e são facilmente permutáveis Lisina e Arginina (K e R) apresentam um grupo amino na cadeia lateral e podem ser permutáveis

50 Alinhamentos: Conceitos e Desafios Matrizes de pontuação Ácido Aspártico D Ácido Glutâmico E Uma mudança entre D para K altera a polaridade e tamanho da cadeia lateral deve receber uma pontuação bem diferente do que em relação uma alteração entre D para E. Mas a pontuação deve ser MUITO ou POUCA diferente, como quantificar? Deve ser negativa? E a pontuação entre as trocas entre D->E e K->R? Lisina K Arginina R Como comparar D->K e E->R? A pontuação deve ser simétrica???

51 Alinhamentos: Matrizes de pontuação

52 Alinhamentos: Matrizes de pontuação -> A solução surgiu a partir da era de sequenciamento de DNA e proteínas, entre 1960 e 1970 Dayhoff e colaboradors redefiniram o problema em busca da melhor pontuação: -> Ao invés de se perguntarem sobre o custo de cada tipo de substituição, eles se perguntaram sobre qual a frequência que cada par de aminoácido é alinhado em famílias de proteinas relacionadas. Margaret Oakley Dayhoff Foi a primeira a introduzir o termo Score de Alinhamento"

53 Alinhamentos: Matrizes de pontuação A questão: Como inventar uma matriz de pontuação boa o suficiente? É aqui que entra em cena as matrizes BLOSUM e PAM PAM -> Point Accepted Mutation, ou Percentage Accepted Mutation PAM 250 (Dayhoff et al., 1965; Dayhoff e Eck, 1968)

54 Alinhamentos: Matrizes de pontuação PAM -> São baseadas em alinhamentos globais de proteínas com parentesco próximo; -> PAM 1 é a matriz calculada a partir da comparação entre sequências com menos de 1% de divergência (probabilidade de 1 aminoácido ser substituído a cada 100 aminoácidos) ; -> Outras matrizes PAM são extrapoladas a partir da matriz PAM1 -> Como pode ter 250% (PAM250) de mudanças? -> Saturação

55 Alinhamentos: Matrizes de pontuação BLOSUM -> Desenvolvida por Stephen e Jorja Henikoff de Centro de Pesquisa para o Câncer em Seattle e Howard Hughes Medical Institute a partir de um estudo de alinhamento de proteínas relacionadas (1992 e 1993); -> Desenvolvida mais de 20 anos depois da matriz PAM (muito mais famílias proteicas estavam disponíveis); -> BLOSUM = BLOCK SUBSTITUTION MATRIX -> Os valores são baseados nas observações das frequências de substituição, em bloco de alinhamentos locais de proteínas relacionadas (Focado em fragmentos BLOCOS do alinhamento escolhidos a dedo ).

56 Alinhamentos: Matrizes de pontuação BLOSUM -BLOSUM62 = Calculada a partir de comparações entre sequências, com divergência mínima de 62%

57 Alinhamentos: Matrizes de pontuação BLOSUM -> Inicialmente cada BLOCO foi gerado a partir do banco de dados BLOCKS que foi baseado em padrões do PROSITE (Bairoch, 1992); -> A principal razão do PROSITE ser utilizado na construção dos BLOCOS estava relacionada ao fato que cada padrão do PROSITE foi manualmente curado e verificado e usualmente apresentavam uma função molecular conhecida.

58 Alinhamentos: Matrizes de pontuação Vantagens e desvatagens BLOSUM -> São baseadas em observações reais; -> Detectam melhor sequências com relações biológicas (detectam melhor domínios conservados entre proteínas); -> Não é possível gerar um modelo evolutivo.

59 Alinhamentos: Matrizes de pontuação Vantagens e desvatagens PAM -> É possível montar um modelo evolutivo e assim gerar novas matrizes a partir da primeira; -> Preferencialmente usadas para determinar questões evolutivas (Rastrear proteínas ancestrais) ; -> São baseadas na frequência de substituição encontrada em proteínas de parentesco muito próximo. Portanto são melhores para detectar relações próximas entre proteínas.

60 Alinhamentos: Matrizes de pontuação Vantagens e desvantagens Para comparar seqs mais parecidas (8090% similar) Para comparar seqs mais divergentes (30-40% similar) Sensitividade tem que ser definida pela similaridade e distância entre as sequências que serão comparadas. <<Matriz de Pontuação>> No dia-a-dia a matriz BLOSUM62 tem demonstrado ótimos resultados É a matriz padrão para o programa BLAST

61 Alinhamentos: Conceitos e Desafios Similaridade ou Homologia? O -> grau de similaridade pode ser estimado, por exemplo duas proteína podem ser 75% idênticas; -> Homologia é uma afirmação sobre a história evolucionária de um caractere; Duas sequências são 75% homólogas mais homólogo Duas sequências são 75% idênticas ou similares

62 Alinhamentos Alinhamento Múltiplos -> Processo utilizado para a elucidação de temas biologicamente significantes (estudo de domínios e motivos protéicos por exemplo). -> O alinhamento múltiplo é uma generalização natural do caso de par de sequências. O objetivo é transformar, por meio de gaps, todas as sequências em outras de mesmo comprimento.

63 Alinhamentos Alinhamento Múltiplos -> O alinhamento pode ser visto na forma de uma tabela onde cada linha está associada a uma sequência. -> É uma técnica utilizada em sequências de proteínas.

64 Alinhamentos Alinhamento Múltiplos Motivações: -> Detecção de regiões conservadas em grande número de sequências; -> -> Definição de famílias protéicas; Detecção de resíduos conservados (sítios de fosforilação, glicosilação, ligação com metal, com substrato, com íon, localização celular); -> -> Predição estrutural; Passo para reconstrução filogenética;

65 Alinhamentos Alinhamento Múltiplos: Conceitos -> Motivo: sítios catalíticos, resíduos estruturais importantes; -> Domínio: relacionados a uma função da proteína, pressupõem homologia; -> Família: grupo de proteínas relacionadas evolutivamente; -> Padrão: sintaxe (expressão regular) descrevendo combinações possíveis de resíduos; -> Profile: descreve variabilidade dentro de uma família protéica;

66 Alinhamentos Múltiplos Como são construídos os alinhamentos múltiplos? PD: analisa todos alinhamentos possíveis (100n segundos para n seqüências); Progressive pairwise alignment: analisa todos pares de sequências, constrói uma matriz e uma árvore NJ, seleciona um par inicial e vai adicionando as outras seqs (segundo a árvore). Ex: Clustal, T-Coffee Iterative alignment: começa com um alinhamento feito, e passos consecutivos de iterações são feitos até que o alinhamento não possa mais ser melhorado. Ex: Muscle Anchor-based: partem de subseqüências comuns, e regiões não alinhadas são tratadas posteriormente. Ex: MAFFT Probabilistic methods: pré-computam probabilidades de substituição baseando-se em alinhamentos conhecidos, e procuram aquele com o maior número esperado de predições corretas. Ex: ProbCons

67 Alinhamento Múltiplos Visualização pode parecer fácil

68 Alinhamento Múltiplos Ou um pouco mais complicado...

69 Alinhamento Múltiplos Problemas... Proteínas com muitos domínios, e com rearranjos, não são possíveis de alinhar. Difícil alinhar as proteínas em toda sua extensão. Não funciona abaixo de ~30% de similaridade (twilight zone): isso pode ser corrigido se houver informação de estrutura Como fazer um bom alinhamento? Seleção correta de sequências (>30% similaridade) >80 sítios Identificação de resíduos importantes (por mutantes ou estrutura 3D) Baseado em estrutura secundária

70 Alinhamentos: Para terminar... -> Alinhamento GLOBAL e LOCAL exemplos práticos de uso: -> LOCAL: WATER, MATCHER, LALIGN -> GLOBAL: NEEDLE, STRETCHER Ambos utilizam Programação Dinâmica, para garantir o melhor resultado Porém o custo computacional é alto, e devido a necessidade atual (NGS) e das últimas décadas, de se realizar comparações, essa abordagem se torna inviável. Desta forma foi criada uma abordagem alternativa para comparação de sequências (alinhamento) -> Nesta abordagem alternativa não é garantido encontrar o melhor alinhamento, porém é significativamente mais rápida em termos computacionais, e em termos práticos também é muito eficiente. HEURÍSTICA

71 Parte 3 BLAST

72 BLAST Basic Local Alignment Search Tool Segundo o Google Acadêmico Artigo de > citações Artigo de > citações

73 BLAST -> É um conjunto de algoritmos que busca um alinhamento local ótimo da seqüência objeto com seqüência alvo de um banco de dados; ->O algoritmo BLAST é extremamente simples e se baseia no conceito de par de segmentos ; -> Dada duas seqüêcias, um par de segmentos é definido como um par de sub sequêcias de mesmo comprimento que forma um alinhamento sem gap; -> Este algoritmo determina todos os pares de segmentos entre as sequêcias do banco de dados e a sequência em exame que apresentam um score acima de um valor limiar préfixado pelo usuário; -> Os pares de segmentos (do inglês HSP, High Scoring Pairs) são apresentados como resultado do programa, assim como os valores estatísticos associados; -> A grande inovação do BLAST foi relacionada a capacidade de calcular uma significância estatística para cada resultado de alinhamento;

74 BLAST High Scoring Pairs Summary Geralmente apresentado no final da visualização da busca Number of Hits to DB: 3816 Number of Sequences: 63 Number of extensions: 123 Number of successful extensions: 1 Number of sequences better than 1.0e-01: 0 Number of HSP's better than 0.1 without gapping: 0 Number of HSP's successfully gapped in prelim test: 0 Number of HSP's that attempted gapping in prelim test: 1 Number of HSP's gapped (non-prelim): 0 length of query: 152 length of database: 12,629 effective HSP length: 45

75 BLAST Método -> Utiliza um subconjunto de sequencias, da sequencia objeto, denominadas palavras ou W (word), para criar as sementes do alinhamento; -> Busca fragmentos indênticos a W, com um valor mínimo de T (threshold), utlizando a matriz de substituição; -> Se T é alcançado, W é extendido em ambas as direções, tentando gerar um alinhamento com um valor S (score) inicial.

76 BLAST Método -> Quando maior o valor para W haverá menores possibilidades para matches ; -> Uma vez alinhada a semente, o programa extende o alinhamento em ambas as direções e este é o processo que mais consome tempo; -> Estas variáveis podem ser administradas pelo usário.

77 BLAST Método: Exemplo

78 BLAST

79 BLAST

80 BLAST Significância estatística E-Value (expect value) : Calculado para cada alinhamento, proporciona uma estimativa do número de falsos positivos esperados em uma busca -> Altos valores de E sugerem grande chance do alinhamento ocorrer de forma randômica De uma maneira geral, quando mais próximo a 0 melhor. E< > Provavelmente homólogos ou identicos E<10-3 -> Podem ser relacionados E>1 Provavelmente não há relação 0,5 < E < 1 -> Twilight Zone

81 BLAST Analisando os Resultados

82 BLAST Analisando os Resultados

83 BLAST Analisando os Resultados

84 BLAST Analisando os Resultados

85 BLAST Tipos de comparações Query BD Compara Programa nt nt nt blastn nt (trad) aa aa blastx aa aa aa blastp aa nt (trad) aa tblastn nt (trad) nt (trad) aa tblastx

86 BLAST PHI-BLAST e PSI-BLAST -> PHI-BLAST : É um BLASTP refinado: Opção de indicar uma sequencia curta ou padrão para ser utilizado como referência para a construção do alinhamento -> PSI-BLAST: É também um BLASTP refinado, só que aqui o blastp é interativo. É reconstruída uma matriz com base nos alinhamentos resultantes da primeira consulta. É útil para encontrar membros distantes de famílias protéicas. -> Blast2Seq: Compara duas sequencias <<alinhamento par-a-par>>

87 Epílogo: Busca em banco de dados e alinhamentos Informações evolutivas, estruturais e funcionais

88 Dúvidas, perguntas?