Identificação de genes por similaridade de seqüência

Transcrição

1 Identificação de genes por similaridade de seqüência

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3 Evolução do genoma Os genes evoluem a partir de genes ancestrais comuns acumulando mutações Homologia Genes ancestrais estão presentes nas espécies modernas Citocromo C

4 Dinâmica genômica Mutação Molecular clock Transferência horizontal Recombinação exon-suffling Duplicação gênica Perda de genes

5 Surgimento de Novos Genes Duplicação recombinação cromossômica Exon suffling genes modernos Transferência horizontal coexistência

6 Duplicação gência É o principal gerador de novos genes Geram homólogos dentro de um mesmo genoma Com o tempo os homólogos assumem funções especializadas Evento de duplicação Mutação Deriva geética seleção natural Novas funções

7 Paralogia e Ortologia Especiação Espécie X Espécie Y Evento de duplicação Mutação e seleção natural

8 Parálogos e ortólogos

9 As globinas e o transporte de O 2

10 O genoma evolui basicamente por duplicação gênica.

11 Novos genes duplicação Pressão seletiva mutações Nova função Deriva genética Novos genes, novas funções Aumento de complexidade

12 Surgimento de Novos Genes Duplicação Exon suffling Transferência horizontal

13 Genes mosaico A B C C A C B

14 Surgimento de Novos Genes Duplicação Exon suffling Transferência horizontal

15 Transferência Horizontal de Genes

16 HGT modula a árvore da vida

17 Seqüências biológicas estão em constante mudança Mudanças de base, mutações, aparecem constantemente Podem se fixar ou desaparecer Podem ser silenciosas ou não

18 GTHKLPYHNMVDEWQASDCGA GTHKLPLHNMVDEWQASDCGA GTHKLPLHNMVEEWQASDCGA GTHKLPLHNMVEEWQATDCGA GTHRLPLHNMVEEWQATDCGA GTHRIPLHNMVEEWQATDCGA GTHRIPLHNLVEEWQATDCGA 1/21 95% 2/21 90% 3/21 85% 4/21 80% 5/21 75% 6/21 70% GTHRIPLHQLVEEWQATDCGA 7/21 65%

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25 Sequence Similarity Homology Function inference Structural Similarity

26 HOMOLOGIA SIMILARIDADE?

27 Similaridade x Homologia Duas seqüências são ditas similares quando se parecem em nível peptídico ou nucléico mas a similaridade pode ser devida a: Homologia Convergência Chance Por outro lado, duas seqüências são ditas homólogas quando derivam de um ancestral comum Um bom alinhamento deve resgatar esse aspecto homólogo entre as seqüências

28 Sequence Similarity??? Homology Function inference Structural Similarity

29 Alinhando Seqüências Protéicas RLLGNVLVCVLAHHFGKEFTPPVQAAYQKVVAG : :: :: : : RLLGNVIVVVLARRLGHDFNPNVQAAFQKVVAG Identidade 24/33 = 72% Similaridade 31/33 = 94%

30 Alifáticos de cadeia longa

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35 Pontuando um alinhamento Para comparar alinhamento distintos é necessário pontuá-los A pontuação (score) permite ranquear os melhores alinhamentos, apontando as seqüências mais próximas

36 Alinhando Seqüências Protéicas RLLGNVLVCVLAHHFGKEFTPPVQAAYQKVVAG : :: :: : : RLLGNVIVVVLARRLGHDFNPNVQAAFQKVVAG

37 Pontuando (Scoring) Proteínas Matrizes Posição Independentes Matrizes PAM (Percent Accepted Mutation) Derivada de observação; pequeno conjunto de dados Modelo implícito de evolução Todas derivadas da PAM1 PAM250 é a mais utilizada MAtrizes BLOSUM (BLOck SUbstitution Matrices) Derivada de observação; grande conjunto de dados de blocos conservados Cada matriz é derivada independentemente de blocos com dado corte de percentagem de identidade BLOSUM62 matriz default do BLAST Position Specific Score Matrices (PSSMs) usado no PSI-BLAST

38 BLOSUM62 A 4 R -1 5 N D Amino acidos comuns têm peso discreto C Q E G H I L Amino ácidos raros tem peso expressivo K M F P S T W Y V X 0-1 Sustituições neutras tem -1 peso -1-1 positivo A R N D C Q E G H I L K M F P S T W Y V X Substituições drásticas impõem pena

39 Alinhando Seqüências Protéicas RLLGNVLVCVLAHHFGKEFTPPVQAAYQKVVAG : :: :: : : RLLGNVIVVVLARRLGHDFNPNVQAAFQKVVAG

40 Pontuando seqüências alinhadas RLLGNVLVCVLAHHFGKEFTPPVQAAYQKVVAG = 124 RLLGNVIVVVLARRLGHDFNPNVQAAFQKVVAG score

41 Pontuando Seqüências Protéicas Seq1 Seq2 RLLGNVLVCVLAHHFGKEFTPPVQAAYQKVVAG RLLGNVIVVVLARRLGHDFNPNVQAAFQKVVAG BLOSUM 68 BLOSUM 45 BLOSUM 80 PAM 30 Seq1 Seq Seq1 Seq

42 Alinhando seqüências contra um banco de dados Um problema clássico é procurar seqüências similares entre um conjunto predeterminado de seqüências Query Banco de dados Alinhamento pontuado e classificado 1990

43 Basic Local Alignment Search Tool Calcula similaridade entre sequencias biologicas Encontra o melhor alinhamento local Abordagem heurística baseada no algoritmo de Smith- Waterman Procura por palavras similares, não resíduos individuais Usa estatística para determinar se um dado match ocorreu por chance

44 Nucleotide Words Query: GTACTGGACATGGACCCTACAGGAA Lookup table de palavras (words) GTACTGGACAT Word Size = 11 TACTGGACATG ACTGGACATGG CTGGACATGGA TGGACATGGAC GGACATGGACC GACATGGACCC ACATGGACCCT... Minimum word size = 7 blastn default = 11 megablast default = 28

45 Requerimento mínimo para um hit ATCGCCATGCTTAATTGGGCTT CATGCTTAATT um match exato Nucleotide BLAST requer um match exato O alinhamento é esticado para ambos os lados para estabelecer o HSP

46 Protein Words Query: Lookup table de Palavras (words) GTQITVEDLFYNIATRRKALKN GTQ TQI QIT ITV TVE VED EDL DLF... Word Size = 3 Word Size entre 2 e 3 (default = 3) Palavras similares LTV, MTV, ISV, LSV, etc.

47 Requiremento mínimo para um hit GTQITVEDLFYNI SEI YYN Dois matches próximos Com proteínas o BLAST requer dois matches separados por menos de 40 aa O alinhamento é esticado para estabelecer o HSP

48 Estatística de alinhamento local O score de um alinhamento local entre duas seqüências aleatórias segue a distibuição de valores extremos (Extreme Value Distribution) Expect Value E ~ número de hits com a database que voce espera encontrar ao acaso

49 Espaço de busca Tamanho do banco de dados (m) Tamanho da seqüência em teste (n) 2 8 N= n.m 2 33

50 Definindo o valor de E E = m n 2 -S = m n 2 S

51 Como interpretar o resultado do Blast Qual o grau de identidade entre com os melhores hits? Quanto maior a identidade maior a probabilidade de compartilhar estrutura-função Extensão do alinhamento Alinhamento muito localizado poder refletir módulos funcionais. Ex.: proteína kinase Entre os melhores hits, tem algum caracterizado experimentalmente? Inferindo sobre inferência pode ser ariscado

52 BLAST Output: Alignments >gi sp Q9Y5X1 SNX9_HUMAN Sorting nexin 9 (SH3 and PX domaincontaining protein 1) (SDP1 protein) Length = 595 Score = 255 bits (652), Expect = 4e-68 Identities = 140/322 (43%), Positives = 185/322 (56%), Gaps = 7/322 (2%) Query: 221 SSATVSRNLNRFSTFVKSGGEAFVLGEASGFVKDGDKLCVVLGPYGPEWQENPYPFQCTI 280 SS+++ LN+F F K G E ++L A K +K+ +++G YGP W F C + Sbjct: 197 SSSSMKIPLNKFPGFAKPGTEQYLL--AKQLAKPKEKIPIIVGDYGPMWVYPTSTFDCVV 254 Query: 281 DDPTKQTKFKGMKSYISYKLVPTHTQVPVHRRYKHFDWLYARLAEKF-PVISVPHLPEKQ 339 DP K +K G+KSYI Y+L PT+T V+ RYKHFDWLY RL KF I +P LP+KQ Sbjct: 255 ADPRKGSKMYGLKSYIEYQLTPTNTNRSVNHRYKHFDWLYERLLVKFGSAIPIPSLPDKQ 314 Query: 340 ATGRFEEDFISKRRKGLIWWMNHMASHPVLAQCDVFQHFLTCPSSTDEKAWKQGKRKAEK 399 TGRFEE+FI R + L WM M HPV+++ +VFQ FL + DEK WK GKRKAE+ Sbjct: 315 VTGRFEEEFIKMRMERLQAWMTRMCRHPVISESEVFQQFL---NFRDEKEWKTGKRKAER 371

53 BLAST Programa Query Database blastn N N blastp P P

54 Opções do BLAST Particularmente útil para seqüências nucleotidicas desconhecidas como as ESTs e DNA genomico Programa Query Database blastx N P P PP P PP tblastn P N P PP P PP tblastx N P PP P PP N P PP P PP

55 Position Specific Substitution Rates Serina pouco conservada Serina dentro do sítio ativo

56 Position Specific Score Matrix (PSSM) A R N D C Q E G H I L K M F P S T W Y V 206 D G V I S S C N Serina 7 0 é -2 pontuada diferentemente G nas -4 duas -7-7 posições D S G G P -2-6 Sítio -6 ativo -5-6 nucleofílico L N C Q A

57 PSI-BLAST Permite criar a sua própria PSSM Passível de detectar relações filogenéticas longínquas query BLOSUM62 PSSM Alignment Alinhamento

58 PSI BLAST >gi sp P03958 ADA_MOUSE ADENOSINE DEAMINASE (ADENOSINE AMINOH MAQTPAFNKPKVELHVHLDGAIKPETILYFGKKRGIALPADTVEELRNIIGMDKPLSLPGFLAKFDYY VIAGCREAIKRIAYEFVEMKAKEGVVYVEVRYSPHLLANSKVDPMPWNQTEGDVTPDDVVDLVNQGLQ EQAFGIKVRSILCCMRHQPSWSLEVLELCKKYNQKTVVAMDLAGDETIEGSSLFPGHVEAYEGAVKNG RTVHAGEVGSPEVVREAVDILKTERVGHGYHTIEDEALYNRLLKENMHFEVCPWSSYLTGAWDPKTTH VRFKNDKANYSLNTDDPLIFKSTLDTDYQMTKKDMGFTEEEFKRLNINAAKSSFLPEEEKKELLERLY e value cutoff for PSSM NCBI Field Guide

59 PSI Results: Initial BLAST Run NCBI Field Guide

60 First PSSM Search Other purine nucleotide metabolizing enzymes not found by ordinary BLAST NCBI Field Guide

61 Third PSSM Search: Convergence Just below threshold, another nucleotide metabolism enzyme NCBI Field Guide

62 Comparando DNA x Proteína

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64 Filogenia das H + ATPases

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