Dezembro Bioinformática. e Anotação. Eduardo Fernandes Formighieri Laboratório de Genômica e Expressão / UNICAMP

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1 Dezembro Bioinformática e Anotação Eduardo Fernandes Formighieri Laboratório de Genômica e Expressão / UNICAMP

2 Hoje 1. Introdução à Genômica 2. Introdução à Bioinformática 3. Introdução à Anotação 4. BLAST

3 Dezembro Introdução à Genômica Eduardo Fernandes Formighieri Laboratório de Genômica e Expressão / UNICAMP

4 Conceitos O que é? Genômica Seqüenciamento Bioinformática Montagem (assembly ou clusterização) Bancos de dados BLAST Anotação E que importância isto tem para você?

5 Conceitos Genômica Ciência que estuda o genoma, ou o conjunto do material genético de um organismo. Ex.: Genoma da Xylella fastidiosa écomposto pelo DNA cromossomal mais o DNA plasmidial.

6 Conceitos Seqüenciamento de DNA Determinação da sua seqüência nucleotídica (ACGTs). A tecnologia de seqüenciamento atual exige que se quebre o DNA em pequenos fragmentos de cerca de pares de bases (Sanger), exigindo a montagem dos fragmentos. (a montagem será detalhada posteriormente)

7 Introdução seqüenciamento enciamento denaturação anelamento dos primers extensão

8 Introdução seqüenciamento enciamento

9 Conceitos seqüenciamento enciamento Exemplo de gel de eletroforese utilizado nos seqüenciadores de gel (ex.: 377). A diferença de tamanho permite a separação dos grupos de fragmentos, e esta distribuição normal da passagem dos fragmentos é representada pelo eletroferograma (ou cromatograma) de cada seqüência (read).

10 Conceitos nt Estruturas e ligações. O RNA é composto por ribonucleotídeos, o DNA por desoxiribonucleotídeos (sem o OH no C2), e o dideoxiribonucleotídeo também não tem o OH do C3, impedindo a continuidade da ligação.

11 Conceitos fita DNA As seqüências são sempre descritas no sentido 5 => 3, salvo aviso em contrário, e isto diz respeito à posição das ligações nos carbonos 5 e 3. A lógica é a mesma para proteínas, de N-terminal para C-terminal.

12 Conceitos O que é um projeto genoma? Seqüenciamento de material genético de organismo e anotação de estruturas e genes encontrados Ex.: Seqüenciamento do genoma humano; do cromossomo IV de S. cerevisiae; de ESTs de diferentes espécies de Eucalyptus.

13 Projetos Genoma Tipos de projeto DNA seqüenciamento de estruturas do genoma ou de trechos destas. Ex.: X. fastidiosa ESTs seqüenciamento de cdna, feitos a partir de bibliotecas de mrna. Bibliotecas feitas para diferentes situações. Ex.: ESTs de café

14 Projetos Genoma Esquema muito resumido para projetos genoma. O seqüenciamento pode ser total ou parcial. A montagem feita por diferentes programas. O objetivo final pode ser um produto, publicações ou respostas.

15 Projetos Genoma Estratégias de seqüenciamento DNA Shotgun de genoma inteiro Shotgun de pedaços do genoma (cosmídeos) Primerwalking ESTs Convencional Orestes

16 Projetos Genoma genoma humano Exemplo de shotgun orientado

17 Dezembro Introdução à Bioinformática Eduardo Fernandes Formighieri Laboratório de Genômica e Expressão / UNICAMP

18 Conceitos Bioinformática Aplicação da informática na biologia molecular. Utilização e desenvolvimento de ferramentas computacionais para estudo e resolução de problemas biológicos.

19 Conceitos Gerenciamento de informações Armazenar dados genéticos e disponibilizá-los de forma maleável e facilitada. Gerenciar a troca de informações. Inclui bancos de dados, páginas de serviços via internet, listas de correio eletrônico, submissão e busca de dados etc.

20 Conceitos Bancos de Dados (BDs) Armazenamento organizado de informações que possibilita fácil, preciso e rápido acesso às mesmas.

21 Bancos de dados - exemplo

22 Bancos de dados Alguns dos principais BDs biológicos NCBI (link) National Center for Biotechnology Information EBI (link) European Bioinformatics Institute KEGG (link) Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes GO (link) Gene Ontology Consortium COG (link) Clusters of Orthologous Groups of proteins

23 Conceitos Desenvolvimento Desenvolvimento, em bioinformática, é a área onde são criadas ferramentas computacionais para resolução de problemas da biologia molecular.

24 E ainda... Manutenção de sistema (precisa, né?) Gerenciamento de dados Adaptação e desenvolvimento de ferramentas Segurança de dados Etc.

25 Bioinformática montagem Phred/Phrap/Consed Phred valores de qualidade para bases Cross-match comparação e marcação Phrap e CAP3 montagem Phrapview e Consed - visualização

26 Bioinformática montagem Região de qualidade alta Picos bem definidos e grandes. Linha de base boa. Distância entre picos anterior e posterior constante (há exceções).

27 Bioinformática montagem Região de qualidade média poucas ambigüidades Picos razoavelmente bem definidos e de tamanho médio. Linha de base boa a razoável. Distância entre picos anterior e posterior razoável.

28 Bioinformática montagem Região de qualidade baixa baixa confiabilidade Picos mal definidos e de tamanho pequeno. Linha de base confusa. Distância entre picos anterior e posterior inconstante.

29 Bioinformática montagem A B B Alguns problemas de montagem C <= Repetições (regiões de cor verde) atrapalham a montagem <= Estruturas secundárias => podem interromper o seqüenciamento, assim como regiões ricas em GC, AT etc.

30 Bioinformática resolução Primers, sub-bibliotecas, programas específicos de seqüenciamento etc.

31 Dezembro Anotação Eduardo Fernandes Formighieri Laboratório de Genômica e Expressão / UNICAMP

32 Introdução base Anotação de genes Anotar um gene é postular função ao produto deste gene. Para DNA, inicialmente são localizados os ORFs. Para cdna, busca-se a identificação do trecho seqüenciado. Utilizam-se diversos programas de comparação com dados genéticos conhecidos e buscas de padrões.

33 Introdução base ORFS Os ORFs (Open Reading Frames) a partir de determinado tamanho são genes em potencial. ATG AAT GCT TGC ACC CCG TCA GGC CTG TAA ini fim Códon iniciador, região codificadora e códon terminador.

34 Introdução base Código genético (Fonte das figuras:

35 Introdução ão metabol.. virtual

36 Anotação Postular função para produto de gene; ou Predizer estruturas do genoma e suas funções. Anotam-se: Genes que codificam proteínas trnas rrnas ORFs hipotéticos Clusters de GC Repetições Codon usage Promotores...

37 Anotação algumas ferramentas

38 Anotação inicial

39 Anotação metabólica

40 Anotação BLAST BLAST Ferramenta de busca de similaridade de seqüências. Consulta de seqüências em BDs biológicos

41 Anotação BLAST Basic Local Alignment Search Tool Algoritmo BLAST (Alstchul et al.; 1990 J. Biol., 215, ) Implementações: NCBI BLAST e WU-BLAST Acesso via web / local Consulta de seqüências em BDs biológicos Alinhamento, similaridade e homologia

42 Anotação BLAST Query BD Compara Programa nt nt nt blastn nt (trad) aa aa blastx aa aa aa blastp aa nt (trad) aa tblastn nt (trad) nt (trad) aa tblastx

43 Bancos de dados Alguns dos principais BDs NCBI (link) National Center for Biotechnology Information EBI (link) European Bioinformatics Institute GO (link) Gene Ontology Consortium KEGG (link) Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes COG (link) Clusters of Orthologous Groups of proteins

44 Anotação trnas Programa trnascan-se COVE lento, mas preciso trnascan -> COVE Show structure

45 Anotação rrnas rrnas Blastn Estrutura secundária

46 Anotação repetições Programa Tandem Repeat Finder - microsatélites Programa REPuter Forward vs. Forward (F) - tandem Forward vs. Reverse (R) Forward vs. Complement (C) Forward vs. Reverse Complement (P)

47 Anotação conteúdo de GC GC Clusters de GC Porcentagem de GC GC skew - (G-C)/(G+C) GC skewcumulativo

48 Dezembro BLAST Eduardo Fernandes Formighieri Laboratório de Genômica e Expressão / UNICAMP

49 BLAST base Basic Local Alignment Search Tool Algoritmo BLAST (Alstchul et al.; 1990 J. Biol., 215, ) Implementações: NCBI BLAST e WU-BLAST Acesso via web / local Consulta de seqüências em BDs biológicos Alinhamento sobreposição de trechos semelhante de duas seqüências (seqs). BLASt traz pontuação e mostra alinhamentos. Similaridade grau de semelhança de seqs num alinhamento. Homologia genes com ancestral comum (vide slide).

50 BLAST conceitos 1 Genes nariz Homólogos Ortólogos: 2 e 3; ancestral comum = 1 Ortólogos: 2 e 4; ancestral comum = 1 Parálogos: 3 e 4; ancestral comum = 3 Especiação Duplicação 3

51 BLAST programas BDs nucleotídeos, proteínas, domínios, genomas específicos, dados particulares Blastp prot / prot (distantes) Blastn nt / nt (próximos) Blastx nt trad / prot (novas seqs) Tblastn prot / nt trad (regiões não anotadas) Tblastx nt trad / nt trad (ESTs)

52 BLAST programas Query BD Compara Programa nt nt nt blastn nt (trad) aa aa blastx aa aa aa blastp aa nt (trad) aa tblastn nt (trad) nt (trad) aa tblastx Query = formato da seq de entrada. BD = formato das seqs do BD. nt (trad) = seq em nt traduzida pelo programa. Compara = o que é comparado, nucleotídeos (nt) ou aminoácidos (aa). Programa = um dos cinco principais tipos de blast.

53 BLAST query = nts Vs. Nt MEGABLAST identificar a seq Blastn identificar a seq ou encontrar similares Tblastx comparação por proteínas (nts trad) Vs. Prot Blastx comparação com proteínas (nts trad) Pequenas seqs de nt Search for short, nearly exact matches busca para primers ou motivos

54 BLAST query = aas Vs. Prot Blastp - identificar a seq ou encontrar similares PSI-Blast encontrar membros da família da proteína ou genes muito distantes PHI-Blast busca similaridade de seq + padrão Domínios conservados CD-search encontra no query CDART encontra no query e busca outras

55 BLAST query = aas Vs. Nt Tblastn busca proteínas similares Pequenas seqs de proteínas Search for short, nearly exact matches busca para motivos Especializadas (nt ou prot) Blast 2 sequences BDs específicos (genomas etc.)

56 BLAST resultado Query / Subject Low score filter Gráfico Lista de alinhamentos Score e E value Alinhamentos Identidades (matchs) Positivos Posições de início e fim

57 BLAST resultado Escolher BD

58 BLAST resultado ERRO!! Domínio encontrado ID facilita busca

59 BLAST resultado

60 Link BLAST resultado

61 BLAST resultado 1 64 query subject

62 BLAST local Pode ser instalado localmente (Linux) BDs e atualizações Facilidades Velocidade de buscas Maleabilidade Automatização Dados locais Independe de internet

63 Perguntas? Obrigado Edu :)