26 a 29 de novembro de 2013 Campus de Palmas

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1 CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR DE Bacillus thuringiensis COM ATIVIDADE TÓXICA PARA Aedes aegypti L. (DÍPTERA: CULICIDAE) Vanessa Mendes Mattje 1 ; Raimundo Wagner de Souza Aguiar 2 1 Acadêmica do Curso de Química Ambiental; Campus de Gurupi; vanessamattje@uft.edu.br PIBIC/UFT 2 Orientador do Curso de Engenharia de Bioprocesso e Biotecnologia; Campus de Gurupi; rwsa@hotmail.com RESUMO Objetivou-se neste trabalho isolar caracterizar isolados de Bacillus thuringiensis com atividade tóxica para Aedes aegypti obtidas de amostras de solos do estado do Tocantins e Maranhão. O B. thuringiensis foi isolado após adição de 1 ml de solução salina, choque térmico (80 ºC por 12 minutos / gelo por 5 minutos) e selecionada em meio NYSM + antibiótico (penicilina). Em seguida incubada a 28 ºC por 48 horas. No total foram isoladas 481 colônias Bacillus, destes 13 apresentaram atividade tóxica para larvas de A. aegypti, e somente três isolados apresentarem 100% de mortalidade em 24 horas para as larvas do mosquito. A caracterização dos isolados obtidos que PAGE para avaliação dos perfis das proteínas. Os produtos amplificados em PCR foram para os apresentaram atividade tóxica para A. Aegypti foram realizadas reações de PCR e testes de coloração para Gram-positiva e analise SDS genes cry4a, cry10 e cyt1, enquanto analise da proteína dos isolados com atividade para larvas de A. aegypti apresentou de 130 kda, proteínas correspondente a cry4a. Desta forma, os resultados de toxicidade apresentada para mosquito pode estar associado à atividade de sinergismo entre estas toxinas. Palavras-chave: Bioinseticida, mortalidade, estirpes, genes Cry, mosquito da dengue. INTRODUÇÃO A distribuição do mosquito Aedes aegypti (Linnaeus, 1762) (Díptera: Culicidae) nos países tropicais vem sendo uma preocupação constante de epidemia de dengue, principalmente, devido às condições ambientais, climáticas e sociais que favorecem a dispersão do mosquito nos centros urbanos. No Brasil, nos últimos anos, alguns estados brasileiros têm passado por graves epidemias de dengue. Principalmente, devido à ineficiência dos métodos de controle utilizados para Aedes aegypti (Cox et al., 2007). Por ser uma técnica efetiva, de baixo custo e de fácil manejo, o controle químico tem sido a forma mais usada no controle de Aedes aegypti em todos estados brasileiros. No entanto, devido à ineficiência dos produtos químicos em controlar este inseto, o uso sistematizado tem ocasionado o aparecimento de populações resistentes de A. aegypti a esses produtos, além da possibilidade de intoxicação dos operadores, da população e contaminação do meio ambiente. Dessa forma, há necessidade do desenvolvimento de novas alternativas para o controle de larvas de A. aegypti (Chang et al., 2009). A descoberta de bactéria de solo Gram positiva Bacillus thuringienses, principalmente a var. israelensis (H-14), possibilitou o desenvolvimento de bioinseticida promissor para o controle larvas de dípteros, e vem

2 sendo comercializadas em vários países do mundo para o controle de vetores de doenças humanas, representando atualmente de 80 a 90% do mercado de agentes biológicos para o controle de mosquito em todo o mundo (Raymond et al., 2010). O número de cópias de cada gene Cry presente em uma determinada estirpe é um fator fundamental na determinação da toxicidade de uma estirpe de B. thuringiensis, assim como, na produção relativa de cada tipo de proteína Cry (Cantón et al., 2011). Desse modo, o presente trabalho tem como objetivo a caracterização molecular de estirpes de Bacillus thuringiensis com atividade tóxica para A. aegypti obtidas de amostras do estado do Tocantins, visando identificar a composição gênica das estirpes com atividade tóxica aumentada para A. aegypti. MATERIAL E MÉTODOS A pesquisa foi desenvolvida no laboratório de Manejo Integrado de Pragas (MIP) do Campus de Gurupi/Universidade Federal do Tocantins - TO. Para o isolamento de B. thuringiensis foi realizada de acordo com procedimentos realizados por MONNERAT et al. (2001). Para a realização dos bioensaios utilizou-se 20 larvas de 1º instar acrescidas em 100 ml de H 2 O destilada em copos descartáveis, para a obtenção dos isolados de B. thuringiensis com atividade tóxica para as larvas de A. Aegypti, verificando-se a mortalidade das larvas após período de 24 e 48 horas. A caracterização molecular foi realizada para confirmação da presença dos genes cry em reações de PCR consistindo de 50 ng de DNA, oligonucleotídeos (0.4 µm de cada) específicos para a detecção dos genes cry4aa, cry4ba, cry10, cry10aa (Cantón et al., 2011) 10 µm de cada dntp, 2,5 μl de tampão de Taq DNA polimerase, MgCl 2 2mM e 1U de Taq polimerase em um volume total de 25 μl. Amplificação dos genes estão sendo realizadas de acordo com os seguintes passos: 94 o C/5 min em seguida por 35 ciclos em 95 o C/30 s, 52 o C/1,30 s, 72 o C/4 min e a extensão final de 72 o C/8 min. Enquanto, analise de SDS-PAGE as amostras foram ressuspendidas em tampão de proteína 5X (1,5 M Tris-HCl, ph 6,8, Glicerol, SDS, 2β-mercaptoetanol, Azul de Bromofenol) fervidas a 100ºC por 5 min e aplicadas em gel de poliacrilamida SDS-PAGE numa concentração de 10%. O gel foi corado em solução Comassie Blue corante (40% de metanol e 25% de Comassie blue 250-R) por 12 h e descorado em solução descorante (40% de metanol e 10% de ácido acético) até visualização das bandas de proteínas que correspondem às toxinas presentes. RESULTADOS E DISCUSSÃO Foram isoladas 481 colônias individualizadas de B. thuringiensis, destes, somente 13 isolados apresentaram atividade com mortalidade para larvas de A. aegypti, mas de acordo com resultados, somente três apresentaram 100% de mortalidade para larvas do referido mosquito, representando menos 0,6% dos isolados obtidos (Tabela 1).

3 Figura 1. Características morfológicas das colônias obtidas de Bacillus thuringiensis de amostras de solos do estado do Tocantins e Maranhão (A e B). Enquanto C, D e E coloração de Gram dos isolados 5689-I, 5775-I e 5775-A pelo método de coloração de Gram. As características apresentadas pelas colônias obtidas de B. thuringiensis apresenta bordas onduladas e uniformes com coloração opaca, obtidas em meio seletivo NYSM (Figura 1A, B, C, D e E). As amostras de solos obtidos foram todos coletados dos estados do Tocantins e Maranhão. O número de isolados associado ao tipo de solo estão de acordo com os obtidos por ALVAREZ et al., (1999) verificou que solos com maior teor de argila são favoráveis a obtenção de maior número de isolados de B. thuringiensis. A caracterização molecular dos isolados obtidos com toxicidade para larvas de A. aegypti foram verificadas para os genes cry4a, ti cry4b, cry10, cry11 e cyt1 e cyt2 (Figura 2 A e B). A B M M pb

4 Figura 2. Resultado da extração de DNA e Perfil plasmidial obtido das estirpes de Bacillus thurigiensis que apresentaram atividade tóxica para larvas de Aedes aegypti obtidas de amostras de solo do estado do Tocantins. Sendo M: marcador, 1= Estirpe 5775-I; 4 = Estirpe 5689-I e 6= Estirpe 5775-A. B PCR caracteriazação dos genes cry ativos para Dipteos. Sendo M- Marcador 1 Kb Ladder (Invitrogen), sendo 1- amplicação do gene cry4aa, 2 gene Cry10Aa, 3 gene cyt Ab, 4 gene cry11ba, 5 gene cry11aa, 6 gene cry 4Ba e 7 gene cyt2aa. A partir das estirpes promissoras, um fragmento correspondente ao gene cry10aa (2.000 pb) foi clonado dentro do vetor de clonagem pgem -T easy e sequenciado. A análise de BLAST mostrou que o gene cry10aa tem 100% de identidade com o gene cry10aa acesso no Genbank = YP_ ). Figura. 3. Analise da expressão da proteína dos isolados SDS-PAGE 12%. M. marcador proteína, 1, 2 e 3 isolados 5689-I, 4, 5 e 6 isolado 5775-I e 7, 8 e 9 isolado 5775-A. A proteína de cerca 130 kda foi detectada nos isolados de B. thuringiensis após submetido a esporulação (Figura 3). Desta forma, os resultados de toxicidade apresentada para mosquito pode estar associado à atividade de sinergismo entre estas toxinas. Conforme relatados ação de sinergismo destas toxinas de algumas estirpes de B. thuringiensis para larvas de A. aegypti (Monnerat et al 2001) e estes estudos ajuda na pesquisa de quais os genes mais apropriados para serem introduzidos no genoma de plantas cultivadas de grande interesse econômico. Para determinar a toxicidade dos isolados B. thuringiensis obtidas contra larvas de A. aegypti foram determinada em função da concentração inicial e tempo de exposição. A mortalidade dos insetos mortos foi conferida no intervalo de 24 horas. Sendo que entre os isolados 5689-I, 5775-I e 5775-A, forma os mais promissores respectivamente Tabela 1. De qualquer modo, a ação letal determinada dos isolados obtidos em bioensaios é comparativa aos encontrados para o IPS 82, base para a síntese de produtos comerciais (Monnerat et al 2001).

5 Tabela1. Número de estirpes selecionadas e toxicidade apresentada para larvas de primeiro instar de Aedes aegypti isoladas de amostras de solo. Estipes (Bt) Localidade % de mortalidade em 96 horas 5689-I Porto Franco-MA I Sandolandia-TO A Sandolandia-TO 100 LITERATURA CITADA ALVAREZ V., V.H.; NOVAIS, R. F.; BARROS, N. F.; CANTARUTTI, R. B.; LOPES, A. S. Interpretação dos resultados das análises de solos. In: RIBEIRO, A. C.; GUIMARÃES, P. T. G.; ALVAREZ V., V. H. (Ed.). Recomendação para o uso de corretivos e fertilizantes em Minas Gerais: 5. Aproximação. Viçosa: Comissão de Fertilidade do Solo do Estado de Minas Gerais, p CANTÓN, P.E., REYES, E.Z., RUIZ, I., BRAVO, A., SOBERÓN, M. Binding of Bacillus thuringiensis subsp. israelensis Cry4Ba to Cyt1Aa has an important role in synergism. Peptides, v.32, p , CHANG C., SHEN W.K., WANG T.T., LIN Y.H., HSU E.L., DAI S.M. A novel amino acid substitution in a voltage-gated sodium channel is associated with knockdown resistance to permethrin in Aedes aegypti. Insect Biochemistry and Molecular Biology. v.39, p , COX, J., GRILLET, M.E., RAMOS, O.M., AMADOR, M., BARRERA R. Habitat segregation of dengue vectors along an urban environmental gradient. American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. v.76, p , MONNERAT, R. G., SILVA, S.F., SILVA-WERNECK, J. O catálogo do banco de germoplasma de bactéria entomopatogênica do gênero Bacillus. Brasília: Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia, 65p RAYMOND, B., JOHNSTON, P.R., NIELSEN-LEROUX, C., LERECLUS, D., CRICKMORE, N. Bacillus thuringiensis: an impotent pathogen. Trends Microbiology. V.18, p AGRADECIMENTOS Agradecemos a Universidade Federal do Tocantins (UFT), Campus de Gurupi, por ter tornado possível a realização desta pesquisa e também aos colaboradores diretos e indiretos.