Boletim de Pesquisa e Desenvolvimento 31

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1 Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária Centro Nacional de Pesquisa Recursos Genéticos e Biotecnologia Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento ISSN Dezembro, 2002 Boletim de Pesquisa e Desenvolvimento 31 Prospecção de Estirpes de Bacillus sphaericus tóxicas contra Aedes aegypti e Silvânia Ferreira da Silva Daniel Gerheim Souza Dias Erica Soares Martins Carlos Marcelo Silveira Soares José Manuel Cabral de Sousa Dias Rose Gomes Monnerat Brasília, DF 2002

2 Exemplares desta publicação podem ser adquiridos na: Embrapa - Recursos Genéticos e Biotecnologia Serviço de Atendimento ao Cidadão Parque Estação Biológica, Av. W5 Norte (Final) - Brasília, DF CEP Caixa Postal PABX: (61) Fax: (61) sac@cenargen.embrapa.br Comitê de Publicações da Unidade Presidente: José Manuel Cabral de Sousa Dias Secretária-Executiva: Miraci de Arruda Camara Pontual Membros: Antônio Costa Allem Marcos Rodrigues de Faria Marta Aguiar Sabo Mendes Sueli Correa Marques de Mello Vera Tavares Campos Carneiro Suplentes: Edson Junqueira Leite José Roberto de Alencar Moreira Supervisor Editorial: Miraci de Arruda Camara Pontual Revisor de texto: Felisberto de Almeida Normalização Bibliográfica: Sérgio Souza Santos Tratamento de Ilustrações: Jorge Humberto Ribeiro Jr. Editoração Eletrônica: Jorge Humberto Ribeiro Jr. Foto da Capa: Corte transversal de uma célula de Bacillus sphaericus, mostrando o esporo e o cristal proteico (20.000x) Embrapa - Recursos Genéticos e Biotecnologia Capa: Jorge Humberto Ribeiro Jr. 1 a edição 1 a impressão (2002): tiragem 200 Todos os direitos reservados. A reprodução não autorizada desta publicação, no todo ou em parte, constitui violação dos direitos autorais (Lei n o 9.610). Prospecção de estirpes de Bacillus sphaericus tóxicas contra Aedes aegypti e / S. F. Silva... [et al.]. Brasilia : Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia, p. (Boletim de Pesquisa e Desenvolvimento / Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia, ISSN ; n. 31) 1. Bacillus sphaericus - bactéria. 2. Estirpes. I. Silva, S.F. II. Dias, D.G.S. III. Martins, E.S. IV. Soares, C.M.S. V.Dias, J.M.C.S. VI. Monnerat, Rose Gomes. VI. Título. VII. Série. CDD Embrapa 2002

3 Sumário Resumo... 5 Abstract... 7 Introdução... 9 Material e Métodos Resultados e Discussão Conclusão Referências Bibliográficas... 21

4 Prospecção de Estirpes de Bacillus sphaericus tóxicas contra Aedes aegypti e Silvânia Ferreira da Silva 1 Daniel Gerheim Souza Dias 2 Erica Soares Martins 3 Carlos Marcelo Silveira Soares 4 José Manuel Cabral de Sousa Dias 5 Rose Gomes Monnerat 6 Resumo Neste trabalho foram realizados testes de patogenicidade com 246 estirpes de Bacillus sphaericus contra larvas de Aedes aegypti e, a fim de se determinar as mais eficazes para a formatação de um bioinseticida brasileiro. Estas estirpes foram isoladas de diversas regiões do Brasil e estão armazenadas na Coleção de Bacillus spp. da Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia. As estirpes selecionadas foram caracterizadas por métodos morfológicos (microscopia), bioquímicos (SDS-PAGE 10%) e moleculares (Reação em Cadeia da Polimerase). Foram selecionadas 87 estirpes entomopatogênicas de B. sphaericus que apresentaram produtos de PCR de tamanho esperado nas reações com os oligonucleotídeos descritos para detecção de genes codificadores para as toxinas de 42, 51 e 100 kda compatíveis com o perfil de proteínas encontrado para as estirpes, onde foi observado a presença de proteínas de 51 e 42 kda. Duas estirpes (S242 e S260) apresentaram-se promissoras para um produto com dupla finalidade, pois as mesmas foram enquadradas no grupo das mais tóxicas. Termos para indexação: Bacillus sphaericus, controle biológico, mosquitos. 1 Bióloga, MSc, Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia 2 Eng. Agr., Bthek Biotecnologia Ltda., Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia 3 Bióloga, Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia 4 Eng. Agr., PhD, Bthek Biotecnologia Ltda. 5 Eng. Químico, PhD, Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia 6 Bióloga, PhD, Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia

5 Selection of Bacillus sphaericus strains toxic against Aedes aegypti and Abstract In this work, 246 Bacillus sphaericus strains were evaluated against Aedes aegypti and larvae to select the most effective to be used in a basis of a national product. These strains were isolated from different regions of Brazil and they are stored in a Bacillus spp. Collection at Embrapa Genetic Resources and Biotechnology. The selected strains were characterized by morphological, biochemical methods. 87 strains were identified after the selective bioassays. All of them present genes codifying for 42, 51 and 100 kda proteins. Two strains (S242 and S260) are promising to be used as a basis of a product to kill both insects, because they are the most effective. Index terms: Bacillus sphaericus, biological control, mosquitoes.

6 Prospecção de Estirpes de Bacillus sphaericus tóxicas contra Aedes aegypti e 9 Introdução Bacillus sphaericus é uma bactéria gram positiva, aeróbia estrita, com esporo sub-terminal esférico que deforma o esporângio (Neide, 1904). É normalmente encontrada em ambientes com água parada, rios e no solo. A maioria das estirpes não é patogênica a nenhum inseto. As primeiras estirpes entomopatogênicas descritas de B. sphaericus foram isoladas na Califórnia a partir de larvas de Culiseta incidens (Diptera: Culicidae) e foram chamadas de estirpes K e Q (Kellen et al., 1965). Atualmente diversas estirpes tóxicas são conhecidas e muitos trabalhos estão concentrados nas estirpes 1593 e 2362 isoladas respectivamente na Indonésia (Singer, 1973) e na Nigéria (Weiser, 1984). É importante salientar que esta última serve como princípio ativo para todos os produtos comerciais à base de B. sphaericus que são usados para o controle de mosquitos dos gêneros Culex e Anopheles. Por ser inofensiva ao homem, animais e meio ambiente, o uso deste bacilo é recomendado pela Organização Mundial de Saúde em programas de saúde pública (World Health Organization, 1985). Quase todas as espécies de mosquitos do gênero Culex (Diptera: Culicidae), transmissores de filarioses, são sensíveis ao B. sphaericus, assim como os gênero Anopheles (Diptera: Culicidae), transmissores da malária, Psorophora e Mansonia, transmissores de arboviroses. (Cimerman & Cimerman, 2001; Rey, 1992). Entretanto, esta bactéria apresenta pouca ou nenhuma eficácia sobre larvas de mosquitos do gênero Aedes (Diptera: Culicidae), principalmente ao Aedes aegypti, transmissor da dengue e da febre amarela. B. sphaericus é eficaz quando aplicado em águas poluídas, sendo assim, uma boa opção para o combate ao mosquito urbano, que vive em águas poluídas nas cidades das zonas tropicais e subtropicais e que é um importante vetor da filariose bancrofitiana (Regis et al., 2002) A toxicidade do B. sphaericus deve-se a presença de cristais protéicos produzidos durante o processo de esporulação. Esses cristais são compostos por uma toxina binária formada por duas proteínas de pesos moleculares de 51 e 42 kda (Baumann et al., 1987). Foi descrita ainda, uma terceira toxina de 100 kda, chamada MTX, cuja atividade mosquitocida não é muito significativa (Thanabalu et al., 1991).

7 10 Prospecção de Estirpes de Bacillus sphaericus tóxicas contra Aedes aegypti e Os cristais protéicos, uma vez ingeridos pelas larvas dos mosquitos sensíveis, são solubilizados pelo ph alcalino do intestino e em seguida ativados pelas proteinases intestinais. Este processo ativa a toxina que é reconhecida por receptores presentes nas microvilosidades do epitélio intestinal, causando autólise das células e morte da larva (Nicolas et al., 1990). Por ser um microrganismo promissor, diversos laboratórios em todo o mundo buscam novas estirpes desta bactéria que produzam diferentes toxinas ou que estejam mais adaptadas às condições locais, para que tenham melhor eficácia em campo e possam ser usadas no manejo da resistência (Monnerat & Bravo, 2000). A Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia conta com um banco de bactérias entomopatogênicas onde estão armazenadas cerca de 300 estirpes de B. sphaericus. Dentre elas pode-se destacar a estirpe S2, isolada a partir de solo do Distrito Federal, que em bioensaios de laboratório contra C. quinquefasciatus apresentou eficácia semelhante à apresentada pela estirpe 2362 (Schenkel et al., 1992). Neste banco de estirpes, a prospecção, identificação e caracterização de isolados de B. sphaericus geralmente são executadas segundo o seguinte esquema: 1) Coleta de material e isolamento de estirpes a partir de solo, água ou insetos mortos; 2) Observação da morfologia da colônia e repicagem para meio de cultura; 3) Observação da esporulação e formação do cristal ao microscópio óptico em contraste de fase; 4) Crescimento em meio diferencial com estreptomicina; 5) Bioensaios seletivos para mosquitos das espécies C. quinquefasciatus e A. aegypti; 6) Eletroforese de proteínas em gel de poliacrilamida-sds; 7) PCR usando primers desenhados para os genes codificadores das toxinas e 8) Armazenamento e disponibilização (Monnerat et al., 2001a). Este trabalho teve como objetivo selecionar e caracterizar estirpes de B. sphaericus mais eficazes para o controle de A. aegypti e C. quinquefasciatus dentre as do Banco de Bactérias Entomopatogênicas do Gênero Bacillus.

8 Prospecção de Estirpes de Bacillus sphaericus tóxicas contra Aedes aegypti e 11 Material e Métodos Estirpes utilizadas Foram utilizadas 246 estirpes de B. sphaericus pertencentes ao Banco de Bactérias Entomopatogênicas do Gênero Bacillus da Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia. Essas estirpes são originárias de amostras de solo e água coletadas em diferentes regiões do país. (Monnerat et al., 2001b). Bioensaios contra mosquitos das espécies e Aedes aegypti Foram realizados dois tipos de bioensaios: o seletivo, ou discriminante, cujo objetivo foi determinar quais estirpes apresentavam atividade entomopatogênica; e o de dose, cujo objetivo foi determinar qual das estirpes era a mais tóxica. Para isso, foi determinada a concentração letal necessária para matar 50% da população testada (CL 50 ), ou seja, a virulência das estirpes. Bioensaios seletivos: Realizaram-se bioensaios seletivos com as 246 estirpes de B. sphaericus contra larvas de 2 0 /3 0 estágio de C. quinquefasciatus e A. aegypti. Para a realização do bioensaio seletivo, 1 ml do caldo bacteriano crescido em meio NYSM (Kalfon et al., 1983) por 48 horas a 28 C e 200 rpm, foi colocado em 2 copos descartáveis de 200 ml contendo 100 ml de água destilada e 25 larvas de 2 estágio de C. quinquefasciatus ou A. aegypti. Um copo sem a cultura foi deixado como controle e após 48 horas fez-se a leitura do número de sobreviventes. Após 24 e 48 horas realizou-se a leitura dos resultados. Foram consideradas patogênicas as estirpes que causaram 50% ou mais de mortalidade às larvas das espécies dos mosquitos, após 48 horas de contato (Monnerat et al., 2001a). Bioensaio de dose (CL 50 ): Para determinação da CL 50 foram feitas diluições seriadas decimais com a cultura bacteriana cultivada nas mesmas condições descritas no ítem anterior. Em seguida, colocou-se 1 ml de cada uma das diluições em copos, em triplicata, como para o bioensaio seletivo. Um copo sem a cultura foi deixado como testemunha. Quarenta e oito horas após o início do teste foi feita a contagem do número de larvas mortas, e determinou-se a CL 50 (concentração letal necessária para matar 50% das larvas testadas), através da análise de Probits (Finney, 1971).

9 12 Prospecção de Estirpes de Bacillus sphaericus tóxicas contra Aedes aegypti e Para comparação dos resultados de B. sphaericus fez-se o controle positivo com 2362, a estirpe padrão recomendada pela OMS (Organização Mundial da Saúde) que vem sendo utilizada em todo o mundo para o controle de larvas de mosquitos dos gêneros Culex e Anopheles. Eletroforese de proteínas em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE 10%) A análise das proteínas presentes nos cristais das estirpes foi efetuada através de eletroforese de proteínas em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE 10%) o que permitiu conhecer o perfil e a massa molecular das toxinas produzidas pelas estirpes. Para análise das proteínas de cada estirpe, a mistura esporos-cristais foi preparada de acordo com Schenkel et al. (1992). As estirpes foram crescidas em meio NYSM (Kalfon et al., 1983) a temperatura de 30 C por 48 horas em incubador rotativo a 200 rpm. Em seguida, 1 ml do cultivo foi centrifugado a g por 5 minutos. O sedimento foi ressuspendido em 100 µl de água MilliQ autoclavada e 25 µl de tampão de proteína 5X (1,5M Tris-HCl, ph 6,8, Glicerol, SDS, 2βmercaptoetanol, Azul de Bromofenol 0,5%). O material foi fervido durante cinco minutos e aplicado em gel de poliacrilamida SDS-PAGE numa concentração de 10%. O gel foi corado em solução Comassie Blue corante (40% metanol e 25% de Comassie blue 250-R) por 1 hora e descorado em solução descorante (40% metanol e 10% de ácido acético) até a visualização dos produtos. Análise da presença de genes de toxinas através da reação em cadeia da polimerase O DNA total das estirpes de B. sphaericus tóxicas foi extraído segundo protocolo descrito por Otsuki et al. (1997). Uma alçada de cada estirpe cultivada em meio ágar nutritivo a temperatura ambiente por 16 horas foi ressuspendida em 100 µl de Água MilliQ estéril. A suspensão foi colocada no freezer por 1:00 hora, em seguida fervida por 10 minutos e centrifugada a g por 10 segundos.

10 Prospecção de Estirpes de Bacillus sphaericus tóxicas contra Aedes aegypti e 13 Para a realização da PCR, 15 µl do sobrenadante da cultura centrifugada foram transferidos para um tubo contendo 0,5 µm de cada primer, 0,2 mm de dntp, 1,5 mm de MgCl 2, tampão de Taq 1x e 2,5 U de Taq DNA polimerase em um volume total de 50 µl. Os oligonucleotídeos utilizados foram os descritos por Otsuki et al. (1997) que foram desenhados para identificar os genes que codificam a toxina binária e a MTX (Tabela 1). Uma alíquota de 15 µl de cada produto de PCR foi submetida à eletroforese em gel de agarose, corado com brometo de etídio e visualizada em luz ultra-violeta. Tabela 1. Sequência dos oligonucleotideos descritos por Otsuki et al., (1997) correspondentes as toxinas binária e de 100kDa de Bacillus sphaericus Primer Gene Produto (pb) Sequência 5-3 BSN1 BSN2 BSN3 BSN4 BS1 BS2 BS3 BS kda 51.4 kda 41.9 kda 41.9 kda 51.4 kda 51.4 kda 41.9 kda 41.9 kda 100 kda 100 kda , CACGGAATGGTTATGGTT AGGTGCATTAGGATACGA GTACATTCGCGTTATGG GTATCATAGGTGAACC GTAGGGCGCTTGACAGTAGG GGCCTATTTAGCCCCCTTG GGCATAATGGGTCCGT GAGCGCGGACCAACATGC CCAGGGGGAATTCGTC GAGCTACTACTGTTCTCAC

11 14 Prospecção de Estirpes de Bacillus sphaericus tóxicas contra Aedes aegypti e Bioensaios seletivos e dose (CL 50 ) Resultados e Discussão Dentre as 246 estirpes testadas, 69 apresentaram toxicidade apenas contra C. quinquefasciatus e 18 contra C. quinquefasciatus e A. aegypti, totalizando 87 estirpes tóxicas. As 18 estirpes com atividade dupla foram utilizadas para cálculo da CL 50 (Tabelas 2 e 3). Os resultados das CL 50 contra C. quinquefasciatus permitem agrupar as estirpes em 5 grupos distintos. Esses valores variaram entre 0,30 e 12,87 x 10-7 dcf (diluição da cultura final) (Tabela 2). O padrão para comparação foi a estirpe As estirpes mais eficazes para matar larvas de C. quinquefasciatus foram S201 e S162, apresentando valores respectivos de CL 50 de 0,30 e 0,52 x 10-7 dcf. Este resultado mostra que ambas estirpes são pelo menos três vezes mais eficientes que a estirpe padrão 2362, que apresentou CL 50 de 2,13 x 10-7 dcf (Tabela 2). O resultado das CL 50 contra A. aegypti permite agrupar as estirpes em 8 grupos distintos. Esses valores variaram entre 0,003 e 0,349 dcf (Tabela 3). As estirpes mais eficazes contra A. aegypti foram S242, S233 e S260, apresentando CL 50 de 0,003 e 0,004 dcf. A estirpe padrão 2362 e S201 foram as menos tóxicas, apresentando respectivamente valores de CL 50 de 0,240 e 0,349 dcf (Tabela 3). É interessante notar que as estirpes possuem atividades diferentes às duas espécies de insetos-alvo. Os resultados da CL 50 obtidos para C. quinquefasciatus não podem ser extrapolados para A. aegypti. Nenhuma das estirpes foi agrupada nos grupos das mais tóxicas contra os dois mosquitos (grupo de homologia A). A compilação de resultados aponta as estirpes S242 e S260 (isoladas a partir de amostras coletadas respectivamente nas cidades de Planalto/Ba e Belém/Pa), como as mais promissoras para servirem como base para um produto com dupla finalidade, pois as mesmas foram enquadradas no grupo das mais tóxicas ao A. aegypti (A) e no segundo grupo contra C. quinquefasciatus (B).

12 Prospecção de Estirpes de Bacillus sphaericus tóxicas contra Aedes aegypti e 15 Tabela 2. Concentração letal (CL 50 ) das estirpes de B. sphaericus contra C. quinquefasciatus. A unidade utilizada foi diluição da cultura final (dcf) X 10-7 Estirpes CL 50 * Intervalo de confiança Homologia S201 S S242 S200 S295 S260 S516 S524 S15 S16 S233 S444 S662 S438 S64 S558 S1 0,30 0,52 2,13 2,20 2,29 2,29 2,48 2,69 2,69 2,86 3,16 3,16 3,16 3,16 3,54 3,66 5,04 12,87 0,02-0,63 0,39-0,67 1,65-2,88 1,71-2,98 1,77-3,10 1,77-3,10 1,91-3,36 2,07-3,57 2,07-3,57 2,19-3,78 2,40-4,17 2,32-4,31 2,32-4,31 2,32-4,31 2,68-4,62 2,70-4,80 3,73-6,49 8,91-24,61 A A B B B B B B B BC BC BC BC BC BC BC C D * A unidade utilizada foi diluição da cultura final (dcf) X 10-7

13 16 Prospecção de Estirpes de Bacillus sphaericus tóxicas contra Aedes aegypti e Tabela 3. Concentração letal (CL 50 ) das estirpes de B. sphaericus contra A. aegypti. Estirpes CL 50 * Intervalo de confiança Homologia S242 S233 S260 S295 S516 S558 S200 S438 S444 S524 S662 S131 S15 S64 S16 S1 S162 S ,003 0,004 0,004 0,005 0,005 0,005 0,006 0,006 0,006 0,006 0,006 0,009 0,020 0,028 0,046 0,043 0,061 0,240 0,349 0,002 0,005 0,003 0,006 0,003 0,005 0,004-0,007 0,004 0,007 0,004 0,008 0,004 0,008 0,005 0,008 0,004 0,008 0,004 0,009 0,005 0,008 0,007 0,012 0,014 0,029 0,017 0,047 0,026 0,082 0,032 0,059 0,036 0,104 0,080 0,716 0,26-0,456 A A A AB AB AB AB AB AB AB AB B C CD CD D DE E E * A unidade utilizada foi diluição da cultura final (dcf) Eletroforese de proteínas totais (SDS-PAGE) de Bacillus sphaericus Todas as 87 estirpes entomopatogênicas e a padrão 2362, tiveram seu perfil protéico caracterizado através de SDS- PAGE 10%. Os resultados obtidos mostraram que todas elas apresentaram perfis semelhantes, possuindo duas proteínas de pesos moleculares de 51 e 42 kda (Figuras 1 e 2). Este perfil é o característico da toxina binária produzida pelas estirpes tóxicas de B. sphaericus (Baumann et al., 1987).

14 Prospecção de Estirpes de Bacillus sphaericus tóxicas contra Aedes aegypti e 17 kda Fig. 1. Gel de SDS-PAGE 10% das estirpes entomopatogênicas de B. sphaericus 1: Marcador de proteína Gibco BRL; 2: 2362; 3: S242; 4: S233; 5: S260 e 6: S295. kda Fig. 2. Gel de SDS-PAGE 10% das estirpes entomopatogênicas de B. sphaericus 1: Marcador de proteína Gibco BRL; 2: S516; 3: S558; 4: S200; 5: S438 e 6: S444.

15 18 Prospecção de Estirpes de Bacillus sphaericus tóxicas contra Aedes aegypti e Análise da presença de genes de toxinas através da reação em cadeia da polimerase Todas as 87 estirpes entomopatogênicas de B. sphaericus apresentaram produtos de PCR de tamanho esperado nas reações com os oligonucleotídeos descritos para detecção de genes codificadores para as toxinas de 42 (Figuras 3 e 4), 51 (Figuras 5 e 6) e 100 kda (Figura 7). Esses resultados estão compatíveis com o perfil de proteínas encontrado para as estirpes onde foi observada a presença de proteínas de 51 e 42 kda. Entretanto, em nenhum dos géis foi observada a presença da proteína MTX de 100 kda. Foi demonstrado que o promotor do gene codificante desta proteína não é muito eficaz e que muitas estirpes, ainda que apresentem o gene não conseguem expressá-lo (Berry, 1994). Este fato pode estar ocorrendo com as estirpes aqui estudadas e ser a razão para a detecção do gene e a não visualização da proteína de 100 kda. Segundo os mesmos autores, quando o promotor é substituído por um outro capaz de expressar este gene em grande quantidade, a bactéria passa a ser altamente tóxica a algumas espécies de mosquitos. Pb Fig. 3. Produtos de PCR obtidos com os primers BSN1/BSN2 em gel de agarose. 1: Marcador 1kb, Pharmacia; 2: Controle negativo; 3: 2362; 4: S200; 5: S233; 6: S242; 7: S260; 8: S295; 9: S516.

16 Prospecção de Estirpes de Bacillus sphaericus tóxicas contra Aedes aegypti e 19 Pb Fig. 4. Produtos de PCR obtidos com os primers BS1/BS2, em gel de agarose. 1: Marcador 1kb Pharmacia; 2: Controle negativo; 3: 2362; 4: S200; 5: S233; 6: S242; 7: S260; 8: S295; 9: S516. Pb Fig. 5. Produtos de PCR obtidos com os primers BSN3/BSN4, em gel de agarose. 1: Marcador 1kb Pharmacia; 2: Controle negativo; 3: 2362; 4: S200; 5: S233; 6: S242; 7: S260; 8: S295; 9: S516.

17 20 Prospecção de Estirpes de Bacillus sphaericus tóxicas contra Aedes aegypti e Pb Fig. 6. Produtos de PCR obtidos com os primers BS3/BS4 em gel de agarose. 1: Marcador 1kb, Pharmacia; 2: Controle negativo; 3: 2362; 4: S200; 5: S233; 6: S242; 7: S260; 8: S295; 9: S516. Pb Fig. 7. Produtos de PCR obtidos com os primers 100.1/100.2 em gel de agarose. 1: Marcador 1kb, Pharmacia; 2: Controle negativo; 3: 2362; 4: S200; 5: S233; 6: S242; 7: S260; 8: S295; 9: S516.

18 Prospecção de Estirpes de Bacillus sphaericus tóxicas contra Aedes aegypti e 21 Conclusão Os ensaios conduzidos neste trabalho mostraram que as estirpes entomopatogênicas de B. sphaericus, oriundas de diferentes regiões do Brasil, são muito semelhantes, produzindo proteínas tóxicas parecidas e sintetizadas pelos mesmos genes. Ainda que apresentem muita similaridade as estirpes apresentaram virulências diferentes entre si e sobre as diferentes espécies de mosquitos estudadas. As causas dessas diferenças não puderam ser elucidadas neste trabalho. Foi possível selecionar as estirpes de B. sphaericus mais virulentas aos mosquitos C. quinquefasciatus e A. aegypti, armazenadas no Banco de Bactérias Entomopatogênicas do gênero Bacillus da Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia. Referências Bibliográficas BAUMANN, P.; BAUMANN, L.; BOWDITCH, L.; BROADWELL, A. H. Cloning of the gene for the larvicidal toxin of B. sphaericus 2362: Evidence for a family of related sequences. Journal of Bacteriology, Washington, DC, v. 163, p , BERRY, C. The binary and the 100-kDa Mtx toxins from Bacillus sphaericus. In: INTERNATIONAL COLLOQUIUM ON INVERTEBRATE PATHOLOGY AND MICROBIAL CONTROL, 6., Montpellier, França. Proceedings... [S.l.]: Society of Invertebrate Pathology, p CIMERMAM, B.; CIMERMAN, S. Parasitologia humana e seus fundamentos gerais. 2.ed. São Paulo: Atheneu, p. FINNEY, D. Probit analysis. Cambridge: Cambridge University Press, p KALFON, A.; LARGET-THIERY, I.; CHARLES, J. F.; DE BARJAC, H. Growth, sporulation and larvicidal activity of Bacillus sphaericus. European Journal of Applied Microbiology Biotecnology, v. 18, p , 1983.

19 22 Prospecção de Estirpes de Bacillus sphaericus tóxicas contra Aedes aegypti e KELLEN, W. R.; CLARK, T. B.; LINDEGREN, J. E.; HO, B. C.; ROGOFF, M. H; SINGER, S. Bacillus sphaericus Neide as pathogen of mosquitoes. Journal of Invertebrate Pathology, New York, v. 7, p , MONNERAT, R. G.; BRAVO, A. Proteínas bioinseticidas produzidas pela bactéria Bacillus thuringiensis: modo de ação e resistência. In: MELO, I. S.; AZEVEDO, J. L. (Ed.). Controle biológico. Jaguariúna, SP: Embrapa Meio Ambiente, p MONNERAT, R.; SILVA S. F.; SILVA-WERNECK, J. O.; DIAS, J. M. C. S. Métodos de coleta, isolamento, caracterização e armazenamento de estirpes de Bacillus sphaericus. Brasília: Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia, 2001a. 4 p. (Circular Técnica, 9). MONNERAT, R.G.; SILVA, S. F.; SILVA-WERNECK, J. O. Catálogo do banco de germoplasma de bactérias entomopatogênicas do gênero Bacillus. Brasília: Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia, 2001b. 65 p. NEIDE, E. Botanische Beschneibung einiger sporenbildenden Bacterien. Zentralbl. Bakteriol. Parasitenk. Infektionskr. Hyg. Abt., v. 12, p. 1, NICOLAS, L.; HAMON, S.; FRANCHON, E.; SEBALD, M.; DE BARJAC, H. Partial inactivation of the mosquitocidal of Clostridium bifermentans serovar malaysia by extracellular proteinases. Applied Microbiology Biotechnology, Berlin, v. 34, p , OTSUKI, K.; GUAYCURUS, T. V.; VICENTE, A. C.P. Bacillus sphaericus entomocidal potential determined by polimerase chain reaction. Memória do Instituto Oswaldo Cruz, Rio de Janeiro, v. 92, n. 1, p , REGIS, L.; SILVA-FILHA, M. H.; SANTOS, M. A. V. M.; OLIVEIRA, C. M. F.; LEROUX, C. N. Strains and apllication strategies for improving the use of Bacillus sphaericus and Bacillus thuringiensis against mosquitoes. In: INTERNATIONAL COLLOQUIUM ON INVERTEBRATE PATHOLOGY AND MICROBIAL CONTROL ICIPMC, 8., [Abstracts...] [S.l.: s.n.], p (Documentos, 184).

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21 Impressão Gráfica Edicel Fone: (61)