EXPRESSÃO DA PROTEÍNA DA CAPA PROTÉICA ÍNTEGRA E DELETADA DO COTTON LEAFROLL DWARF VIRUS EM BACTÉRIA E PLANTA 1

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1 EXPRESSÃO DA PROTEÍNA DA CAPA PROTÉICA ÍNTEGRA E DELETADA DO COTTON LEAFROLL DWARF VIRUS EM BACTÉRIA E PLANTA 1 Régis Lopes Corrêa (UFRJ / regislcorrea@yahoo.com.br), Alexandre Alberto Queiroz de Oliveira (UFRJ), Maite Vaslin de Freitas Silva (UFRJ) RESUMO - A doença azul do algodoeiro ou mosaico das nervuras f. Ribeirão Bonito é uma das principais doenças do algodoeiro no cerrado, devido a grande utilização de variedades suscetíveis. Recentemente descobriu-se que a doença está associada com um vírus da família Luteoviridae chamado Cotton leafroll dwarf vírus. Este trabalho teve como objetivo expressar a capa viral em sistemas in vivo. Para tanto foram utilizadas duas estratégias: expressão em bactérias e também em sistemas vegetais. Observou-se uma alta eficiência de expressão em ambos os modelos o que permitirá purificar a proteína e utilizá-la para estudos básicos da biologia viral e também para o desenvolvimento de kits de diagnóstico. Palavras-chave: doença azul, algodoeiro, Gossypium hirsutum INTRODUÇÃO A doença azul do algodoeiro, também conhecida como mosaico das nervuras f. Ribeirão Bonito, Cotton blue disease,, ou ainda azulão tornou-se um dos principais problemas fitossanitários da cultura do algodão nos estados de Mato Grosso e Goiás e em outras regiões produtoras do país (Freire, 1998). Recentemente foi verificado que a doença azul está associada com um novo vírus Cotton leafroll dwarf virus (CLRDV) que pertence à família Luteoviridae que é transmitido de forma circulativa e persistente pelo pulgão Aphis gossypii e os sintomas são caracterizados por nanismo, enrolamento foliar e amarelecimento das nervuras (CORREA et al., 2005). A gravidade dos sintomas depende da severidade da infecção e do estado fisiológico da planta. Em casos extremos de infecções precoces e intensas as plantas podem ter seu porte reduzido tornando-se enfezadas (TAKIMOTO, 2003). No Brasil, diversas variedades de algodão são cultivadas, incluindo genótipos desenvolvidos por instituições brasileiras públicas e privadas e genótipos introduzidos dos Estados Unidos e Austrália. Entretanto, essas variedades se mostraram altamente susceptíveis à doença Azul. Freire (1998) relatou perdas de até 1500 kg.ha-1 em alguns estados do Brasil. O objetivo deste trabalho foi expressar a proteína da capa protéica (CP) íntegra e deletada do CLRDV a em sistemas in vivo de Escherichia coli e Nicotiana bethamiana. MATERIAL E MÉTODOS 1 Agências Financiadoras: FACUAL e CNPq.

2 O fragmento correspondente a CP foi amplificado por RT-PCR e clonado pela tecnologia Gateway em plasmídeos contendo fusões com glutationa S-transferase (GST). No entanto, com o objetivo de reduzir o número de codons raros de E. coli, apenas os 372 nucleotídeos finais dos 606 existentes na CP foram clonados. Assim, foi possível eliminar 14 dos 19 codons raros existentes na capa viral. Bactérias eletrocompetentes foram transformadas em aparelhos da marca BioRad e estocadas a - 80 C. As bactérias foram inoculadas em 7mL de meio 2XYT líquido contendo 100 µg/ml de ampicilina por cerca de 12h a 37 C e em seguida crescidas em meio 2XYT sólido contendo o mesmo antibiótico. Uma colônia isolada foi inoculada em 5mL de meio 2XYT líquido por cerca de 12h a 37 C e o pré-inóculo foi em seguida diluído em 1000 ml de 2XYT líquido. A cultura foi mantida em agitação até atingir uma densidade ótica entre 0,5 e 1,0 a 600 nm. Para a indução da expressão das bactérias, foram adicionados 1,0 mm de IPTG em cada frasco contendo 500 ml. As bactérias foram mantidas em agitação por 4h a 37 C. Foram coletadas duas alíquotas de 1mL de bactérias não induzidas, que foram sedimentadas por 5 minutos a RPM e o pellet congelado. Em cada coleta as bactérias foram sedimentadas por 5 minutos a g e ressuspensas em tampão de corrida para gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) contento 6% de SDS, 10% de β-mercaptoetanol, 20% de glicerol, 0,5% de azul de bromo fenol (ABF) e 125 mm de tris-hcl. As amostras foram separadas em géis de poliacrilamida 12% a 100 V por cerca de 3 horas em tampão contendo 3 g/l de tris, 14,4 g/l de glicina e 1 g/l de SDS. Foi utilizado o Bench Marker Molecular Weight (Invitrogen) como marcador de peso molecular. Em seguida os géis foram corados por cerca de duas horas com coomassie blue e depois descorados por cerca de duas horas com uma solução contendo 50% de metanol e 10% de ácido acético. Para expressão da CP em plantas, toda a região codificante foi clonada em vetores gateway e em seguida recombinada para um vetor contendo uma fusão c-terminal com FLAG (Sigma). A construção foi então transformada em Agrobacterium cepa GV3101 e em seguida utilizada em experimentos de expressão transiente em Nicotiana benthamiana. Para tanto, as bactérias foram pré-inoculadas em 5 ml de LB contendo antibióticos e crescidas a 28 0 C por 20 horas. O pré-inóculo foi diluído em 50 ml de LB contendo antibióticos e então agitado a 28 0 C por mais 20 horas. As bactérias foram sedimentadas e ressuspendidas em uma solução contendo 10 mm de MÊS, 10 mm de cloreto de magnésio e acetoceringona. As infiltrações foram realizadas com o auxílio de uma seringa de 3 ml sem agulha. Para realização dos testes de Western Blot, géis de SDS-PAGE foram transferidos para membrana PVDF por uma hora a 80V em um tampão de transferência (3 g/l Tris, 14,4 g/l Glicina, metanol 20%). Antes da hibridação, a membrana foi bloqueada com TBS 1X (Tris 50 mm; NaCl 0,2M), contendo 0,1% de Tween e 3% de leite em pó. Em seguida a membrana foi lavada três vezes com TBS 1X e o anticorpo primário, anti-flag, foi adicionado em uma diluição de 1:10000 em PBS 1X. A solução foi agitada por cerca de 20 horas e em seguida lavada por três vezes com PBS 1X. Finalmente o anticorpo secundário contendo uma peroxidase foi adicionado para realizar a revelação. RESULTADOS E DISCUSSÃO Experimentos anteriores mostraram que a capa viral é pouco expressa em sistema bacteriano, possivelmente em função do grande número de códons raros de E. coli (dados não mostrados). Como é possível observar na figura 1, a seqüência da CP apresenta 19 codons raros de E. coli, sendo que alguns deles estão seguidos um do outro. Existem trabalhos mostrando que a existência de apenas oito codons raros já poderia limitar drasticamente a expressão de proteínas em bactéria (GUSTAFSSON et al., 2004). Sendo assim, a região 3` da capa viral, que contém apenas cinco dos 19 codons raros existentes, foi

3 fusionada com GST e transformada em E. coli cepa Rosetta-gami 2 (Novagen). Essa bactéria possui um plasmídeo contendo genes que codificam para alguns trnas raros em E. coli, tais como AGA, AGG, ATA e CTA. A indução de bactérias contendo a região deletada da CP, no entanto, mostrou-se muito eficaz. Amostras foram coletadas em duas, quatro, seis e 20 horas após a indução. Como se pode observar na figura 2, em duas horas de indução a expressão já estava próxima aos níveis máximos. Com o intuito de expressar toda a região codificadora da CP, tentou-se, também, a expressão transiente em plantas. Para tanto, a CP foi clonada em sua forma íntegra sob o controle do promotor constitutivo de plantas 35S e também com uma fusão C-terminal com FLAG. Com o objetivo de aumentar a eficiência de expressão, a CP foi co-infiltrada com uma outra cepa de Agrobacterium contendo a proteína P0 do Potato leafroll virus. A P0 é uma potente supressora de silenciamento gênico, permitindo assim uma maior expressão em sistemas de expressão em plantas. O gel de SDS-PAGE corado com comassie blue, no entanto, não evidenciou a existência de bandas diferencialmente expressas entre as plantas infiltradas somente com a P0 e as plantas co-infiltradas com a P0 e a CP (figura 3A). Uma banda diferencialmente expressa foi observada, contudo, quando o gel foi transferido para uma membrana e hibridado com anticorpos anti-flag (Fig. 3B). A B AGA AGG ATA CCC CGA CTA Figura 1. Codons raros de E. coli na CP do CLRDV. A Todos os codons raros de E. coli. B Disposição dos codons raros de E. coli existentes na seqüência da CP.

4 CLRDV CP3 Figura 2. Gel SDS-PAGE contendo o extrato total de bactérias induzidas com a construção CP3` mostrando a presença de bandas diferencialmente expressas no tamanho esperado para a fusão com GST (~ 41 KDa). Na primeira coluna foi aplicado o marcador de peso molecular, na segunda a bactéria sem indução e nas colunas seguintes tempos de indução de 2h, 4h, 6h e 20h, respectivamente. CP + NI P0 P0 A B Figura 3. Expressão da capa protéica viral integra do CLRDV agente causal da doença azul do algodoeiro em sistema vegetal. NI Não infiltrada; P0 Proteína supressora de silenciamento gênico do PLRV; CP Capa viral do CLRDV; A Gel de SDS-PAGE corado com comassie blue. B Western blot hibridado com anticorpos anti-flag e revelado com peroxidase. CONCLUSÕES

5 Neste trabalho a proteína do capsídeo do Cotton leafroll dwarf virus foi expressa em dois sistemas. Em bactérias, foram obtidos altos níveis de expressão quando os códons raros de E. coli foram retirados da seqüência (figura 2). Em sistema vegetal conseguiram-se altos níveis de expressão da proteína íntegra, quando co-infiltrada com uma supressora de RNAi através de Agrobactéria. Esse resultado demonstra, portanto, que o sistema de expressão transiente via agrobactéria é uma boa alternativa para expressar e purificar proteínas com alto conteúdo de codons raros bacterianos. CONTRIBUIÇÃO PRÁTICA E CIENTÍFICA DO TRABALHO Parte da capa protéica do CLRDV foi expressa em sistema bacteriano e toda a capa em sistema transiente vegetal. Em breve deverá ter início o processo de purificação das proteínas com resinas de GST, no sistema bacteriano, e com resinas anti-flag, no sistema vegetal. As proteínas purificadas serão utilizadas para a produção de anticorpos visando o desenvolvimento de kits de diagnóstico ELISA e também para experimentos básicos sobre a biologia viral. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS CAUQUIL, J.;VAISSAYRE, M. La maladie bleue du cotonnier en Afrique: transmission de cotonnier à cotonnier par Aphis gossypii glover. Cot. Fib. Trop., v.26, p , CORRÊA, R.L.; SILVA, T.F.; SIMÕES-ARAÚJO, J.L.; BARROSO, P.A.; VIDAL, M.S. e VASLIN, M.F.S. Molecular characterization of a virus from the family Luteoviridae associated with cotton blue disease. Arch. Virol., v. 150, p , FREIRE, E.C. Doença azul tem solução. Cultivar, Pelotas, v. 1, p , TAKIMOTO, J.K. Estudo da relação vetor-patógeno-hospedeiro para a doença azul do algodoeiro f. Dissertação (Mestrado) Instituto Agronômico de Campinas, Campinas, SP. GUSTAFSSON, C.; GOVINDARAJAN, S.; E MINSHULL, J. Codon bias and heterologous protein expression. Trends in Biotechnology, v. 22, p , 2004.