Novos modelos de Cultivo de células com interesse biotecnológico 2017 M CNEN 01

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1 Novos modelos de Cultivo de células com interesse biotecnológico 2017 M CNEN 01 Centro de Biotecnologia - CB Resumo Nesse projeto são destacadas pesquisas realizadas no Centro de Biotecnologia em 2017 relacionadas diretamente com o cultivo de células. Esse projeto amplo engloba na prática diferentes atividades que se dividem em subprojetos. Dentre essas atividades de pesquisa destacamos: Efeito de baixas doses de radiação gama em cultura de osteoblastos uma abordagem proteômica; Expressão, purificação e caracterização de proteínas recombinantes produzidas em células HEK293 adaptadas ao crescimento em suspensão; e Desenvolvimento de modelos de cultivo tridimensional in vitro de células tumorais como sistema-teste para avaliação de eficácia de radiofármacos produzidos pelo IPEN. Principais Resultados de 2017: Sub-projeto: Efeito de baixas doses de radiação gama em cultura de osteoblastos uma abordagem proteômica Pesquisas sobre terapia com baixas doses de irradiação têm sido dirigidas objetivando não só entender como esta terapia pode agir nas células como também como um adjuvante em terapias contra o câncer. Análises proteômicas de culturas irradiadas, seja com raios X ou Gama, ainda não foram feitas. No presente trabalho pretendemos analisar o conteúdo proteico dos estágios de maior relevância na proliferação, diferenciação e mineralização de osteoblastos, no qual escolhemos 7, 14 e 21 dias para cada estágio e um ponto no estágio mineralização tardio- 28 dias. Com triplicadas de culturas irradiadas, não irradiadas com e sem ativadores de mineralização (ácido ascórbico e - glicerofosfato), estas serão analisadas separadamente em cada uma das triplicadas e separadamente em cada um dos três compartimentos celulares. Com esta estratégia de obtenção de dados das culturas nas diferentes etapas do processo de mineralização acreditamos que teremos uma visão clara e detalhada do complexo processo aqui estudado.

2 A cultura de células MC3T3 foi estabelecida no laboratório e os ensaios de avaliação quanto à eficiência de plaqueamento com e sem irradiação gama estão sendo feitos. Em um primeiro experimento a eficiência foi de 30% enquanto que a cultura irradiada foi de 40% em relação as não irradiadas, Fig. 1. Houve uma queda significativa na eficiência da cultura irradiada logo com 0.5 Gy e se manteve até 2.0 Gy. O ponto de 0.25 Gy será feito nos próximos experimentos, pois foi a partir destes resultados que foi adicionado este ponto intermediário entre o 0 e 0.5 Gy. A avaliação na formação de nódulos de mineralização pela adição de ácido ascóbico e -glicerofosfato foi feita em culturas de 7, 14 e 21 dias, Fig. 1. Pode-se observar a grande diferença entre a amostra de 21 dias com e sem ativadores da mineralização. Nos próximos experimentos será acrescentado o período de 28 dias. Nódulos de mineralização Nódulos /cm2 C-neg Dias Fig. 1: Gráfico com a quantidade nódulos de mineralização/cm2 nos tempos de 7, 14 e 21 dias de cultura mantida com ácido ascórbico e -glicerofosfato. O controle negativo (C-neg) foi mantido por 21 dias sem os reagentes que provem a mineralização. Após a definição da dose de iradiação que acentua a formação de nódulos de mineralização, serão feitas culturas com essa dose em volume e concentração adequadas para os estudos de proteômica. Sub-projeto: Expressão, purificação e caracterização de proteínas recombinantes produzidas em células HEK293 adaptadas ao crescimento em suspensão

3 A produção de proteínas recombinantes é uma das principais atividades de pesquisa do Centro de Biotecnologia. Atualmente está sendo estudada a síntese de proteínas hormonais por células humanas cultivadas em suspensão. O objetivo é a caracterização geral dessas proteínas, focando em particular estudos sobre a glicosilação. A célula utilizada é a HEK293F (Expi293F TM ). Foram obtidas até o momento as seguintes proteínas: prolactina humana, tireotrofina humana e hormônio folículo estimulante do peixe Arapaima gigas (Pirarucu). Um dos resultados obtidos, a expressão da tireotrofina humana (htsh), é apresentado na Figura 2. Enquanto no sistema de cultivo em suspensão de células Expi293F utilizamos 120 ml de meio condicionado em dois dias, a produção correspondente para células HEK293T aderentes necessitaria de 3000 ml com cinco dias de duração. Além da redução do tempo de produção e da manipulação foram obtidas quantidades necessárias de htsh purificado para futuras análises in vivo e in vitro. Parte dos resultados obtidos foram apresentados no 13 PEACe (Protein Expression in Animal Cells Conference) em Valência, Espanha (24 a 28 de setembro de 2017). Figura 2. (A) SDS-PAGE do meio condicionado de células Expi293 transfectadas com pcdna 3.4 TOPO htsh α e pcdna 3.4 TOPO htsh β. 1) Marcador de massa molecular; 2) meio condicionado contendo htsh (1ª. Produção); 3) meio condicionado contendo htsh (2ª. Produção); 4) padrão comercial de htsh (Thyrogen, Genzyme). (B) Cromatograma do meio condicionado analisado em RP-HPLC. (C) Cromatograma obtido em HPSEC do pico coletado da RP-HPLC. A seta indica o tempo de retenção do padrão comercial de htsh.

4 Sub-projeto: Desenvolvimento de modelos de cultivo tridimensional in vitro de células tumorais como sistema-teste para avaliação de eficácia de radiofármacos produzidos pelo IPEN Testes de fármacos com atividade antitumoral vem sendo realizados em modelos in vitro tridimensionais, em detrimento aos modelos bidimensionais. O Centro de Radiofarmácia IPEN/CNEN-SP é o principal produtor de radiofármacos do país. O processo de avaliação da atividade desses radiofármacos depende de modelos experimentais e se faz presente tanto nos produtos já em seu portfólio, quanto naqueles em desenvolvimento. O projeto propõe a uma rede de trabalho composta principalmente por pesquisadores do CB e CR com objetivo principal de desenvolver modelos de cultivo celular suspenso capazes de fornecer esferóides tumorais. A utilização desses esferóides apresenta expressivas vantagens em relação ao cultivo tradicional, uma vez que reproduzem o formato e as interações célula-célula existentes em tumores sólidos in vivo. Além disso, durante o decorrer do projeto o CB continuará colaborando com cultivos tradicionais em placas (2D) de células de interesse do CR, cultivo esse que deverá ser realizado de forma mais centralizada e seguindo normas de qualidade. Utilizando processos de coprecipitação de íons de ferro, obteve-se as suspensões de partículas de óxidos de ferro. Medições (Malvern ZEN3500, Zetasizer NanoZS) mostraram partículas com diâmetro médio de 79,31±34,49nm, e potencial zeta médio de -35,8mV. A funcionalização das partículas foi realizada com polietileno glicol ou polietileno glicol cianúrico, além do recobrimento final com L-Lisina, aminoácido cuja carga possibilita a adsorção das partículas nas células. Análises por FTIR mostram estiramentos que indicam a associação das partículas com PEG e com Lisina. Esferóides de células de tumor de próstata foram obtidas (Fig. 3). Os resultados estão descritos em dois artigos em anais de congressos, ambos já aceitos e que serão apresentados no XXI Congresso da SBBN (9-11 Outubro de 2017) e no 1st Pan American Congress of Nanotechnology (27-30 Novembro de 2017).

5 Figura 3. Foto representa esferoides cultivados por 9 dias, derivados de densidades celulares iniciais diversas.