MELHORAMENTO GENÉTICO DE AGENTES BIORREMEDIADORES E SEU USO EM BIORREATORES. Ronaldo Biondo. Doutor em Biotecnologia

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1 MELHORAMENTO GENÉTICO DE AGENTES BIORREMEDIADORES E SEU USO EM BIORREATORES Ronaldo Biondo Doutor em Biotecnologia 2009

2 PESQUISAS DE MELHORAMENTO GENÉTICO DE MICRORGANISMOS VISANDO A BIORREMEDIAÇÃO DE EFLUENTES DE METAIS PESADOS PARTE II Convênio CVRD/CPB-NAP-USP Coordenadoras: Profª Drª Ana Clara Guerrini Schenberg Profª Drª Elisabete José Vicente 2009

3 LINHAS DE PESQUISA: DESENVOLVIMENTO DE BIOSSENSORES BACTERIANOS PARA DETECÇÃO DE METAIS PESADOS. DESENVOLVIMENTO DE MICRORGANISMOS BIORREMEDIADORES DE EFLUENTES CONTAMINADOS POR METAIS PESADOS. Laboratório de Genética de Microrganismos

4 Consumo 74% setor agrícola 20% setor inustrial 6% consumo doméstico resíduos bilhões ,1 bilhões Aumento de resíduos Metais pesados

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6 PRINCIPAIS MECANISMOS DE RESISTÊNCIA A METAIS PESADOS

7 BIOSSENSORES

8 CONSTRUÇÃO DO BIOSSENSOR PARA DETECÇÃO DE MERCÚRIO EM AMOSTRAS AMBIENTAIS VANTAGENS: Testes rápidos e de baixo custo; Fácil análise dos resultados; Não necessita de substrato. Faixa de detecção: 0,15 µm 2,5 µm CONAMA: 0,05 µm

9 ETAPAS EM DESENVOLVIMENTO ( ) Aumento da Faixa de Sensibilidade do Biossensor de Mercúrio; Construção do Biossensor de Chumbo; Construção do Biossensor de Arsênio.

10 BIORREMEDIADORES

11 DESENVOLVIMENTO DE MICRORGANISMOS PARA BIORREMEDIAÇÃO DE AMBIENTES CONTAMINADOS POR METAIS PESADOS: BACTÉRIAS Gram-negativas; BACTÉRIAS Gram-positivas; LEVEDURAS

12 BACTÉRIAS Gram-negativas Resistência Cupriavidus metallidurans CH34 Ag +2, Bi +2, Cd +2, Co +2, CrO 4-2, Cu +2, Hg +2, Mn +2, Ni +2, Pb +2, SeO 4-3, Tl +1 e Zn genes

13 Expressão do promotor pan em C. metallidurans CH34 pan = derivado do promotor do gene mrga (metal regulated gene A) de Bacillus subtilis com modificações. Figura esquemática do plasmídeo pbb-panegfp.

14 Visualização de células de C. metallidurans CH34/pBB-panEGFP em microscópio de epifluorêscencia com aumento de 1000 vezes. B

15 Medida da Fluorescência por Citometria de Fluxo (FACS) em C. metallidurans

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17 Capacidade de Biossorção de metais Espectrometria de massas de alta resolução com fonte de plasma indutivamente ativado (ICP-MS), realizada no Laboratório de Caracterização Química e Isotópica do IPEN. µm de Cd +2 µm de Co +2 µm de Cu +2 µm de Hg +2 µm de Mn +2 µm de Ni +2 µm de Zn +2 µm de Pb +2 mg ps mg ps mg ps mg ps mg ps mg ps mg ps mg ps C. metallidurans CH34 11,1 4,5 24,29 0,05 4,73 5,84 16,0 17,62 C. metallidurans CH34/pCM2 12,6 5,0 25,72 0,1 5,06 6,46 18,82 25,14 C. metallidurans CH34/pCM2 Induzido 17,6 (59%) 5,1 (13%) 42,65 (76%) 0,05-6,2 (31%) 8,46 (45%) 51,07 (219%) 54,75 (210%)

18 Eletromicrografia de transmissão de cortes histológicos de células de C. metallidurans CH34. A - C. metallidurans CH34 cultivada em meio TSM e incubada com água MilliQ; B - C. metallidurans CH34 cultivada em meio TSM e incubada com água MilliQ contendo Pb +2 ; C - C. metallidurans CH34/pCM2 cultivada em meio TSM e incubada com água MilliQ e; D - C. metallidurans CH34/pCM2 cultivada em meio TSM contendo Pb +2 e incubada com água MilliQ contendo Pb +2. A visualização das células foi realizada com aumento de vezes. As setas indicam a presença de agregados do elemento Pb +2 ligados na membrana externa da célula bacteriana.

19 02 - Pedidos de Patentes INPI 02 - Prêmios Santander de Ciência e Inovação Prêmio ANA/MMA (Biotecnologia) (Agência Nacional de Águas) 01 -Menção Honrosa no Congresso do ICB/2008

20 Artigo 1 Environmental Microbiology

21 Artigo 2 Journal of Biotechnology

22 ETAPAS EM DESENVOLVIMENTO ( ) Estabilização Genética das Linhagens recombinantes já construídas; Biorreatores; Construção de bactérias Gram-positivas remediadoras; Construção de Leveduras remediadoras (fase final); Construção de linhagens bacterianas que apresentam capacidade de biorremediar íons seletivamente: Ar +2, Pb +2 e Hg +2.

23 Biorreatores Batelada: volumes de operação definidos; Contínuo: amplamente utilizados em tratamento de efluentes; Batelada Alimentada: produção de produtos biológicos.

24 1ª Abordagem do Projeto Reator de Biodisco Rotativo (RBR) Problema: Formação de Biofilme (exopolímeros que encobrem a membrana) Inviabiliza o Cell surface display da Cupriavidus metallidurans recombinante.

25 2ª Abordagem do Projeto Processo Contínuo As células podem ser mantidas em estado fisiológico e crescimento constantes; Cultivo mais longo que a batelada; Reatores e equipamentos associados menores, gerando menor custo; A principal aplicação é no tratamento de efluentes.

26 Escolha do melhor tipo de reator CSTR Air-lift Continuous Stirred Tank Reactor Vantagens do Air-lift em relação aos reatores agitados: Agitação mais suave; Melhor transferência de O 2; Mais baratos; Permitem processos contínuos; Homogeneidade; Eficiência de mistura; São empregados em tratamento de efluentes.

27 Reator

28 Representação esquemática do aparato de biorremediação usado neste trabalho.

29 Outros Projetos: Construções Genéticas de linhagens microbianas biorremediadoras de poluentes orgânicos. Fitorremediação de solos.

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33 A Na célula portadora do plasmídeo codificante do lócus ParB, ocorre a expressão do RNA-m de hok e do RNA antisenso sok, evitando a expressão da toxina letal Hok; B Na célula onde o plasmídeo é perdido, ocorre a tradução do RNA-m hok devido à falta da fita antisenso, ocorrendo a expressão da toxina letal.

34 Diferenças entre os envoltórios celulares Gram-negativas Gram-positivas mbrana terna riplasma embrana erna Membran interna Camada de peptideoglicanos