FUNDAMENTOS DE CITOMETRIA DE FLUXO. Dayane Alves Costa Priscilla Ramos Costa Programa de Alergia e Imunopatologia- LIM 60 USP

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1 FUNDAMENTOS DE CITOMETRIA DE FLUXO Dayane Alves Costa Priscilla Ramos Costa Programa de Alergia e Imunopatologia- LIM 6 USP

2 CITOMETRIA DE FLUXO CITO METRIA DE FLUXO CÉLULA MEDIDA MOVIMENTO Caracterização de célula em movimento Primeiro Citômetro 197- Henzenberg

3 O QUE É A CITOMETRIA DE FLUXO? É uma tecnologia que permite a medida simultânea de múltiplas características de uma única célula. FACS Tamanho relativo Complexidade interna Intensidade de fluorescência

4 APLICAÇÕES DA CITOMETRIA DE FLUXO NO LABORATÓRIO CLÍNICO Análise de subpopulação linfocitária; Acompanhamento de pacientes HIV+ Imunofenotipagem de células tumorais (leucemias e linfomas); Análise de DNA (Ciclo celular e ploidia de tumor); Contagem de reticulócitos; Quantificação de células progenitoras stem cell ; Análises de moléculas de sinalização intracelular; Fatores de transcrição

5 CITOMETRIA DE FLUXO Tipos de Amostras: Células; bactérias; Cromossomos; Beads BD Biosciences

6 CITOMETRIA DE FLUXO Tamanho da Amostra:,5 mm- 14mm BD Biosciences

7 Vantagens Mede vários parâmetros em uma única célula; Muitas células analisadas simultaneamente; Variedade de anticorpos específicos; Analisar simultaneamente antígenos de superfície, intracitoplasmáticos e intranucleares ;» ~32 Anticorpos Monoclonais- proteínas identificadas (moléculas de superfície, citocinas, moléculas de sinalização intracelular e Intranuclear).

8 CITOMETRIA DE FLUXO CD- Cluster of differentiation: Moléculas antígenos que se expressam na superfície das células específicas do sistema hematopoiético que as identificam e têm funções diversas.

9 COMO SÃO DETECTADAS AS CARACTERÍSTICAS DA CÉLULA? Fonte de Luz Incidente: Laser de Argon a 488 nm Detector de dispersão de luz em ângulo reto Complexidade celular SSC (Side Scatter) Detector de dispersão de luz frontal Tamanho celular FSC (Forward Scatter) Clontech Discovery Labware Immunocytometry Systems Pharmingen BD Biosciences

10 DETECÇÃO DA FLUORESCÊCIA Fonte de Luz Incidente: Laser de Argon a 488 nm Laser Diode (vermelho) a 633 nm, 2º LASER Detectores de fluorescência: FL1 FL2 FL3

11 DETECÇÃO DA FLUORESCÊCIA Fonte de Luz Incidente: Laser de Argon a 488 nm Laser Diode (vermelho) a 633 nm, 2º LASER Detectores de fluorescência: FL1 FL2 FL3

12 FLUORESCÊNCIA É o comprimento de onda gerado pela excitação dos fluorocromos após atingir a absorção máxima da luz do laser. l = 488 nm O H Fluoresceína O l = 53 nm Luz Incidente de maior energía Fluorocromo CO 2 H Luz Fluorescente emitida de menor energia e maior comprimento de onda

13 Slide da Karina

14 ESPECTRO DE EMISSÃO PI FITC: ISOTIOCIANATO DE FLUORESCEÍNA PE: FICOERITRINA 4 FITC PE 2 APC PerCP PerCP: PERIDININ CLOROPHIL PROTEIN APC: ALOFICOCIANINA PI: IODETO DE PROPÍDEO Comprimento de onda (nm)

15 COMO SÃO DETECTADAS AS CARACTERÍSTICAS DA CÉLULA?

16 O CITÔMETRO NECESSITA DE UM COMBINADO DE SISTEMAS

17 SISTEMA

18 FLUXO DA AMOSTRA Aumentando a pressão da amostra aumenta a velocidade do fluxo, permitindo que mais partículas passem através da célula de fluxo, NÃO PERDE a qualidade da detecção mas Aumenta o numero de eventos eliminados por causa da sobreposição. Uma VELOCIDADE DE FLUXO MENOR é geralmente usada para aplicações onde uma RESOLUÇÃO MAIOR É CRÍTICA, como nos estudos quantitativos e para medidas de DNA. Uma ALTA VELOCIDADE DO FLUXO é geralmente usada para medidas qualitativas, tais como imunofenotipagem, onde os dados requerem menor resolução, mas são adquiridos mais rapidamente.

19 FLUXO DA AMOSTRA

20 SISTEMA

21 COMO SÃO DETECTADAS AS CARACTERÍSTICAS DA CÉLULA? Fonte de Luz Incidente: Laser de Argon a 488 nm BD Biosciences

22 SISTEMA

23 DETECÇÃO DA FLUORESCÊCIA Fonte de Luz Incidente: Laser de Argon a 488 nm Laser Diode (vermelho) a 633 nm, 2º LASER Detectores de fluorescência: FL1 FL2 FL3

24 CD38 Ativação Células T CD4+ e CD8+ 25K SSC-A PE FSC-H SSC-A K 2K 15K 1K 25K 2K 15K 1K 25K 2K 15K 1K K 15K 1K K 5K K 5K Time K 1K 15K 2K 25K FSC-A 5K 1K 15K 2K 25K FSC-A Live/dead <PE-Texas Red-A>: CD3 CD CD CD K <AmCyan-A>: CD CD CD <Pacific Blue-A>: CD4 <PerCP-Cy5-5-A>: CD <Alexa Fluor 7-A>: HLA-DR HLA-DR <PerCP-Cy5-5-A>: CD <Alexa Fluor 7-A>: HLA-DR 2K 15K 1K 5K CCR5

25 IMUNOFENOTIPAGEM Células Exemplos anti-cd3 FITC anti-cd4 PE anti-cd8 PerCP anti-il-4 APC + Incubar Lavar Análise no Citômetro Células marcadas Anticorpos

26 IMUNOFENOTIPAGEM Quanto maior o número de marcadores de superfície, maior a intensidade de fluorescência + + Intensidade de fluorescência BD Biosciences

27 Slide da Karina

28 IMUNOFENOTIPAGEM Quanto maior o número de marcadores de superfície, maior a intensidade de fluorescência BD Biosciences

29 Caracterização de células do Sistema Imune Detecção de marcadores de superfície de células; Detecção de fatores intracelulares; Detecção de fatores detectados pelas células; Detecção do conteúdo de DNA.

30 IMUNOFENOTIPAGEM IDENTIFICAÇÃO DE POPULAÇÕES CELULARES PELOS SEUS MARCADORES DE SUPERFÍCIE.

31 IMUNOFENOPTIPAGEM SANGUE TOTAL PBMC Slide da Karina

32 Marcação INTRACELULAR Slide da Karina

33 Ontogenia de células T CD27 SSC-A CD27 CD4+ 25K 2K 15K 1K 5K <FITC-A>: CD45RA CD45RA <PE-A>: CD CD45RA <PE-Cy7-A>: CCR SSC-A 25K 2K 15K 1K 5K CD <FITC-A>: CD45RA CD45RA <PE-A>: CD CD45RA <PE-Cy7-A>: CCR7 CD45RA CD45RA-.425 <PE-A>: CD <PE-A>: CD <PE-Cy7-A>: CCR7 CCR7 Naive/Memória 1- Naïve Memória Central 3-Memória transicional 4-Memória Efetora <PE-Cy7-A>: CCR7 CCR7 5-Efetora Terminal 6-?? CD45RA CD CCR

34 CD4 CD25 CD4 CD25 CD127 25K 25K 25K 25K 1 4 2K 2K 2K 2K <PE-A>: Foxp Time FSC-H 15K 1K 5K K 1K 15K 2K 25K FSC-A SSC-A 15K 1K 5K 69 5K 1K 15K 2K 25K FSC-A SSC-A 15K 1K 5K live <Indo-1 (Violet)-A>: UV SSC-A 15K 1K 5K 76 CD <PE-Texas Red-A>: CD3 Células T CD4+ reguladoras (Tregs) 1 5 <PE-Cy7-A>: CD CD25high 68 5 T reg supressor T regs CD <Pacific Blue-A>: CD4 FoxP3 CD39 Células T CD4+ indutoras (Tind) CD FoxP3 CD39

35 <Alexa Fluor 7-A>: HLA-DR Ativação Células T CD4+ e CD K K 25K 1 4 2K 2K 2K <PE-A>: CD FSC-H 15K 1K FSC-A 15K 1K 95.7 SSC-A 15K 1K K 5K 5K Time 5K 1K 15K 2K 25K FSC-A <AmCyan-A>: LIVE/DEAD <PE-Texas Red-A>: CD <PerCP-Cy5-5-A>: CD <APC-A>: CD <Alexa Fluor 7-A>: HLA-DR <Pacific Blue-A>: CD 4 <PerCP-Cy5-5-A>: CD

36 Prof. Dr. Esper G. Kallas Nádila Millan Todos os colaboradores AGRADECIMENTOS