VI CURSO DE SINALIZAÇÃO CELULAR NO CÂNCER

Transcrição

1 VI CURSO DE SINALIZAÇÃO CELULAR NO CÂNCER MÓDULO PRÁTICO DE AUTOFAGIA Marcos Thomé Conceitos básicos Estratégias de indução, inibição e bloqueio Abordagens metabólicas, farmacológicas e genéticas Metodologias de análise Bioquímica, molecular, citometria, microscopia Bibliografia básica

2 Processo de catabolismo e reciclagem celular; Mecanismo de adaptação a situações de estresse; Conservado evolutivamente Basal Previne acúmulo de proteínas e organelas envelhecidas Limita a produção de ROS Autofagia Estimulada Suprimento energético e de nutrientes

3 Macroautofagia Microautofagia Autofagia mediada por chaperonas

4 Progressão morfológica

5 INICIAÇÃO Complexo ULK1 Primeiro ponto de regulação Regulação Cinases AMPK mtor Níveis de fontes de carbono Níveis de nitrogênio, sinais de crescimento e estresse Reconhecimento de alvos NUCLEAÇÃO PI3K III EXPANSÃO Proteínas ATG

6 Reconhecimento de alvos de degradação Receptores Adaptadores. Simultaneamente ligam a alvos de degradação e à maquinaria da autofagia

7 Autofagia seletiva Lipophagy Ferritinophagy

8 Autofagia seletiva Mitofagia Ferritinofagia

9 Acúmulo de componentes celulares envelhecidos e disfuncionais; Suprimento energético insuficiente. Homeostase Catabolismo de organelas; Degradação de fatores essenciais para manutenção de vias de sobrevivência. Turnover de organelas e proteínas; Degradação de organelas envelhecidas; Eliminação de agregados; Geração de nutrientes para suporte bioenergético.

10 Estratégias de modulação Metabólica Farmacológica Genética Positiva (Indução) Starvation Rapamicina Negativa Inibição ATG5, ATG7, Beclina-1 3-MA Bloqueio Bafilomicina A1 Cloroquina

11 ATGs knockout/knockdown Beclin-1 ATG5 ATG7 Vantagem específico* Permanente (ko/kd) robusto Desvantagem Curto período (transfecção) Autofagia independente

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13 3-metiladenina (3-MA) Inibidor de PI3K Cuidado tempo!

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15 Bloqueadores da fase tardia Bloqueio degradação lisossomal BafilomicinaA1 NH4CL, cloroquina PepstatinA, E64D

16 Estratégias de modulação Metabólica Farmacológica Genética Positiva (Indução) Starvation Rapamicina Negativa Inibição ATG5, ATG7, Beclina-1 3-MA Bloqueio Bafilomicina A1 Cloroquina

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18 Starvation Clássico Privação de nutriente Carbono (glicose) AMP AMPK HBSS Nitrogênio (aminoácido) mtor * Fatores de crescimento Serum deprivation

19 Rapamicina Clássico Inibidor mtor Concentrações nm

20 MÉTODOS DE AVALIAÇÃO

21 Microscopia eletrônica LC3-I/II, p62, mcherry-gfp-lc3 GFP-LC3 Laranja de acridina

22 Ensaio de agregação de GFP-LC3

23 Quantificação 1) Avalia-se número de pontos 2) Porcentagem de céluas com determinado número de pontos Pode ser indução ou bloqueio

24 Avaliação de fluxo (mcherry-gfp-lc3) Expressão via vetor retroviral de mcherry-gfp-lc3

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26 Controle Rapamicina Bloqueio Rapa + Bloqueio

27 HEK293

28 mcherry-gfp-lc3 - quantificação Avalia-se número e cor de pontos *Número: indução/inibição *Cor: fluxo

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30 GFP-LC3 e mcherry-gfp-lc3 Transfecção (transiente) Transfecção estável (seleção) Transdução vetor viral (estável) Cuidados Células vivas Fixação Nomenclatura Avalia-se número e cor de pontos *Número: indução/inibição *Cor: fluxo

31 Laranja de acridina Substância lipofílica capaz de cruzar membranas biológicas; Em ph ácido aceita um próton. Ficando carregada positivamente, não cruza mais as membranas, ficando retida em compartimentos ácidos ph citoplasma ~ 7,4 ph autofagossomos ~ 6 ph lisossomos ~ 4,7 ph autolisossomos ~ 5,5

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33 Citometria de fluxo

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35 FSC (Forward Scatter)

36 SSC (Side Scatter)

37 Detecção de fluorescência

38 Detecção e quantificação de autofagia com laranja de acridina

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40 Laranja de acridina - quantificação

41 Western blot ATGs Conversão de LC3 e p62

42 ATGs mrna ou proteína Pouco valor quantitativo para níveis de autofagia Validar silenciamento

43 Níveis de SQSTM1/p62 Proteína SQSTM1/p62 é um substrato da autofagia, sendo seletivamente incorporada dentro dos autofagossomos e degradada com a conclusão do processo autofágico.

44 Ensaio de conversão de LC3-I/II por Western blot A conversão de LC3-I em LC3-II ou GFP-LC3-I/II pode ser detectada por Western Blot ; A quantidade de LC3-II correlaciona bem com o número de autofagossomos.

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46 O que este resultado indica? Esta linhagem é deficiente em autofagia?

47 Bibliografia básica

48 Prática demonstrativa GFP-LC3 (transfecção) mcherry-gfp-lc3 (transfecção) Laranja de acridina