Aplica-se à observação de microorganismos vivos, sem preparação prévia (coloração)

Transcrição

1 Campo Escuro Campo Escuro Constitui uma técnica especializada de iluminação que utiliza a luz oblíqua para reforçar o contraste em espécimes que não estão bem definidas sob condições normais de iluminação Aplica-se à observação de microorganismos vivos, sem preparação prévia (coloração) Utiliza, como princípio de iluminação, a luz que não será coletada pelas objetivas e, portanto, não faz parte da imagem Desta forma, produz uma imagem com o fundo escuro, praticamente preto, e o objeto muito claro e brilhante

2 Campo Escuro Campo Escuro 1. A luz entra no microscópio para iluminação da amostra 2. Um bloqueador de luz opaco impede a passagem de parte da luz incidente, permitindo a passagem de um anel de iluminação 3. O condensador foca este anel de luz sobre a amostra 4. Ao atingir a amostra, parte da luz é diretamente transmitida, enquanto parte é dispersa, difratada, refratada e refletida pela amostra 5. Apenas a luz dispersa entra na lente da objetiva enquanto a luz diretamente transmitida não é captada pela objetiva 6. Desta forma, apenas a luz dispersa forma a imagem, enquanto a luz diretamente transmitida é omitida

3 Campo Escuro Campo Escuro

4 Campo Escuro Campo Escuro Campo Claro

5 Campo Escuro Campo Escuro

6 Campo Escuro Campo Escuro

7 Campo Escuro

8 Campo Escuro Campo Escuro

9 Campo Escuro Campo Escuro

10 Campo Escuro Campo Escuro Compreende uma técnica simples e muito útil para a observação de organismos vivos e amostras biológicas não coradas É uma técnica onde o campo visual apresenta-se praticamente livre de artefatos e com uma grande capacidade de resolução Devido ao reduzido nível de luz da imagem final as amostras devem ser fortemente iluminadas, podendo causar danos à mesma Requer mais habilidade do operador, sendo que algumas cores tornam-se indistinguíveis pela iluminação diferenciada

11 Campo Escuro - Sangue Campo Escuro É também conhecida como uma técnica de observação sanguínea empregando células vivas Permite uma melhor visualização das alterações de tamanho e forma dos eritrócitos (células sanguíneas vermelhas) Permite uma ótima visualização de agregados plaquetários sanguíneos (trombos), considerados um fator de risco para algumas doenças vasculares Permite a identificação de agentes patogênicos circulantes, como algumas bactérias (septicemia) e fungos (Candida)

12 Campo Escuro

13 Campo Escuro

14 Campo Escuro

15 Contraste de Fase Contraste de Fase Baseia-se nos princípios físicos da difração da luz e na densidade das estruturas celulares É empregado em especial para o estudo de células vivas, sem coloração (como células cultivadas, por exemplo) Pode ser usado de modo que as estruturas celulares apareçam escuras (fase positiva ou campo claro) ou claras (fase negativa ou campo escuro) Cria a imagem através do contraste devido à diferença de fase dos raios luminosos que atravessam o fundo relativamente à fase da luz que atravessa os microrganismos gerando

16 Contraste de Fase Contraste de Fase É dotado de um sistema óptico especial que transforma diferenças de fase dos raios luminosos em diferenças de intensidade. Assim, as diferenças de fase, para as quais o olho não é sensível, tornam-se visíveis, pois são traduzidas em diferenças de intensidade luminosa, facilmente perceptível As diversas estruturas celulares tem quantidades diversas de matéria e causam atrasos diferentes na luz que as atravessa. Isso gera diferenças de fase na luz emergente, que, por interferência, são transformadas em diferença de amplitude, gerando diferenças de intensidade luminosa as quais a retina é sensível

17 Contraste de Fase

18 Contraste de Fase Contraste de Fase

19 Contraste de Fase Contraste de Fase

20 Contraste de Fase Contraste de Fase

21 Contraste de Fase Contraste de Fase Dependendo da configuração e propriedades do anel de fase posicionado no plano focal da objetiva os espécimes podem ser observados em contraste de fase positivo ou negativo

22 Contraste de Fase Positivo ou Negativo Contraste de Fase

23 Contraste de Fase

24 Contraste de Fase

25 Estereomicroscopia Estereomicroscopia Possui características que permitem a visualização em 3- Dimensões e percepção de profundidade e contraste em diferentes espécimes São utilizados para examinar amostras a partir da luz transmitida (episcópica) e transmitida (diascópica), geralmente utilizadas emconjunto Há três principais técnicas para a estereomicroscopia: - Iluminação Obliqua - Iluminação de Campo Escuro - Iluminação Fluorescente

26 Estereomicroscopia Estereomicroscopia

27 Estereomicroscopia - Iluminação Estereomicroscopia

28 Estereomicroscopia Estereomicroscopia Em muitos sistemas de estereomicroscopia as imagens são geradas utilizando-se dois caminhos ópticos diferentes, possuindo cada um oculares, objetivas e elementos ópticos independentes (Modelo Greenough) Outros modelos empregam uma objetiva em comum, compartilhada por dois caminhos ópticos individuais. Desta forma, duas imagens distintas, originárias de próximos e diferentes ângulos de visão são projetados na retina do microscopista e convertidos em uma imagem única pelo cérebro (Modelo de Objetiva Comum)

29 Estereomicroscopia - Configuração Estereomicroscopia

30 Estereomicroscopia Estereomicroscopia Aberrações da Imagem A porção central dos espécimes visualizados através da estereomicroscopia aparece ligeiramente elevada em relação ao restante do campo visual Isto cria uma falsa impressão de convexidade da amostra ou de maior espessura central da mesma Este artefato é referido como uma distorção de perspectiva, sendo mais acentuada em amostras planas Espécimes mais complexas ou com maior riqueza de detalhes irão apresentar menor grau de distorção quando visualizadas neste tipo de microscópio

31 Estereomicroscopia Estereomicroscopia Aberrações da Imagem

32 Estereomicroscopia Estereomicroscopia

33 Estereomicroscopia Estereomicroscopia

34 Estereomicroscopia Estereomicroscopia

35 Estereomicroscopia Estereomicroscopia

36 Fluorescência Fluorescência É a capacidade de uma substancia de emitir luz quando exposta a radiações do tipo raios ultravioleta (UV), raios catódicos ou raios X. As radiações absorvidas (invisíveis a olho humano) se transformam em luz visível, ou seja, de um comprimento de onda maior que a incidente Consiste na absorção de energia por um elétron, passando do estado fundamental (S0) para o estado excitado (S1), este elétron ao retornar ao estado fundamental é acompanhado pela libertação de energia em excesso através da emissão de radiação luminosa em diferentes comprimentos de onda Na Fluorescência todo o processo ocorre em tempo inferior a 0,00001 segundos

37 Fluorescência Fluorescência É utilizado para estudar as propriedades de substâncias orgânicas e inorgânicas através do fenômeno da fluorescência Em muitos casos, o componente de interesse no espécime estudado é especificamente marcado com uma molécula fluorescente chamada fluoróforo A amostra é iluminada (excitada) com luz de um comprimento de onda específico que é absorvida pelo fluoróforo, levando este a emitir luz em um comprimento de onda maior (menor energia) Os comprimentos de onda de excitação e emissão são corretamente separados através de filtros adequados

38 Fluorescência

39 Fluorescência Fluorescência Estado excitado (S1) Estado fundamental (S0)

40 Fluoróforos Fluorescência São análogos aos cromóforos, sendo portanto componentes de moléculas que emitem fluorescência É um grupo funcional em uma molécula sendo seus comprimentos de onda de excitação e emissão altamente específicos A quantidade de luz e os comprimentos de onda dependem da própria estrutura do mesmo e do ambiente químico onde este se encontra Esta tecnologia tem grande e particular importância no campo da bioquímica e estudos de proteínas, por ex. na imunofluorescência e imunohistoquímica

41 Fluoróforos Fluorescência Excitação Emissão

42 Fluoróforos Fluorescência

43 Fluorescência Fluorescência Utiliza uma lâmpada de mercúrio ou xenônio para produzir luz ultravioleta. Esta luz incide sobre um espelho dicróico - espelho que reflete comprimentos de onda de um determinado intervalo e permite que comprimentos de onda de outro intervalo passem através dele O espelho dicróico reflete a luz ultravioleta até o espécime, excitando a fluorescência dentro das moléculas deste A objetiva coleta a luz de comprimento de onda fluorescente que foi produzida que passa através do espelho dicróico e de um filtro de barreira (capaz de eliminar outros comprimentos de onda além do fluorescente), levando-a para formar a imagem na ocular

44 Microscópio de Fluorescência Fluorescência

45 Microscópio de Fluorescência Fluorescência

46 Filtros Dicróicos Fluorescência

47 Espelhos Dicróicos Fluorescência

48 Fluorescência Fluorescência As técnicas de microscopia de fluorescência são úteis para exibir estruturas e mensurar eventos fisiológicos e bioquímicos nas células vivas Existem vários indicadores fluorescentes para o estudo de muitos produtos químicos fisiologicamente importantes como DNA, cálcio, magnésio, sódio, ph e enzimas Além disso, os anticorpos específicos de várias moléculas biológicas podem estar quimicamente ligados às moléculas fluorescentes e ser usados para corar estruturas específicas dentro das células

49 Fluorescência Fluorescência

50 Fluorescência Fluorescência

51 Fluorescência Fluorescência Coloração Direta

52 Fluorescência Fluorescência - Imunofluorescência

53 Fluorescência Fluorescência Marcação de Proteínas

54 Fluorescência Fluorescência

55 Fluorescência Fluorescência

56 Fim Fim

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