Microscopia e o Espectro Eletromagnético

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1 Microscopia e o Espectro Eletromagnético O limite de resolução inferior de um microscópio é determinado pelo fato de que, nestes instrumentos, se utiliza ondas eletromagnéticas para a visualização Não se pode distinguir detalhes menores que o comprimento de onda das ondas utilizadas devido a refração

2 Microscopia e o Espectro Eletromagnético O espectro visível possui comprimentos de onda (λ) que impõem limites de resolução que não permitem a identificação de muitas estruturas celulares (máximo 200 nm) A luz verde possui λ de 550 nm (resolução de 300 nm). Bactérias e mitocôndrias possuem aproximadamente 500 nm de comprimento

3 Microscopia e o Espectro Eletromagnético Uma forma de contornar este problema é através da utilização de ondas eletromagnéticas com λ menores Um ribossomo possui aproximadamente 20 nm, para visualizá-lo em detalhes, precisaríamos de um λ de 1 nm (Raios-X)

4 Dualidade Partícula-Onda A energia de qualquer partícula está relacionada com a sua massa pela equação E = mc 2 (Einstein) A expressão de Planck E = hf (h = 6, J.s) relaciona a energia de uma onda com sua freqüência Louis de Broglie, da combinação das expressões de Einstein e Planck, deduziu uma relação obtida entre a massa de um fóton de energia eletromagnética e sua freqüência ou comprimento de onda, onde mc 2 = hf Como c = λ f (comprimento de onda versus freqüência) encontramos m c λ = h

5 Dualidade Partícula-Onda Substituindo-se c (velocidade da luz) por v (velocidade de um elétron) obtemos a relação de de Broglie, onde: λ = h / m v de Broglie tentou associar a natureza dualista da luz ao comportamento do elétron Mais tarde essa hipótese foi demonstrada experimentalmente, sustentando que é possível conseguir a difração dos elétrons, permitindo se obter imagens a partir destes

6 Dualidade Partícula-Onda Desta forma, acelerando-se o elétron através de um potencial eletrostático pode-se obter diferentes comprimentos de onda para o mesmo Por ex., um potencial de 100 KeV gera um λ de 0,0037 nm Assim, a resolução do microscópio eletrônico pode ser muito melhor que a do microscópio óptico

7 (ME) O primeiro protótipo de ME foi construído em 1931 Constitui um microscópio com potencial de aumento muito superior ao seu congênere óptico Não utiliza luz, mas sim feixes de elétrons gerados através de um filamento de tungstênio aquecido (efeito termo-iônico) para iluminar e criar uma imagem do objeto No microscópio eletrônico não há lentes de cristal e sim bobinas, chamadas de lentes eletrostáticas e eletromagnéticas que controlam a iluminação e a formação da imagem

8 Subdivide-se em ME de Transmissão e ME de Varredura

9 Fonte de Elétrons

10 Lentes Magnéticas

11 ME e Interação com a Matéria A interação da amostra com o feixe eletrônico é o que torna a ME possível Os elétrons acelerados no microscópio geram diferentes efeitos quando atingem a amostra Na ME de Varredura, a imagem topográfica é gerada através dos elétrons dispersos refletidos e dos elétrons secundários Na ME de Transmissão, a imagem final é gerada através dos elétrons que atravessam diretamente a amostra, principalmente os não dispersos

12 ME e Interação com a Matéria

13 ME de Transmissão O feixe de elétrons gerado e transmitido através da amostra, funcionando como um projetor de slides A imagem formada e ampliada e direcionada para uma tela fluorescente, um filme fotográfico ou um sensor digital (CCD) A formação da imagem depende do grau de opacidade da amostra ao feixe de elétrons, de forma semelhante aos exames que empregam Raios-X Detalhes da amostra podem ser salientados através do uso de colorações especiais compostas por metais pesados como ósmio, chumbo ou urânio (coloração)

14

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16 Preparo da Amostra O material a ser estudado passa por um complexo processo de desidratação, fixação e inclusão em resinas especiais, muito duras Após esta etapa, são feitos cortes ultrafinos (100 nm) obtidos através das navalhas de vidro ou diamante utilizando o instrumento conhecido como ultramicrótomo ou micrótomo Estes cortes são necessários tendo-se me vista que amostras muito espessas não permitiriam a passagem do feixe de elétrons acelerados

17 Micrótomo

18 Micrótomo

19 ME de Transmissão - Coloração Na coloração negativa, as amostras aparecem claras, contra um fundo escuro

20 ME de Transmissão - Coloração Na coloração positiva, ou sombreamento, uma fina camada de metal pesado e depositada na superfície da amostra

21 ME de Transmissão - Coloração Na imuno-coloração, utilizam-se anticorpos específicos contra os antígenos de interesse (primários) e após estes, antígenos secundários marcados com partículas coloidais de ouro contra os antígenos primários

22 ME de Varredura É um tipo de microscópio capaz de produzir imagens em alta resolução da superfície das amostras O feixe de elétrons é defletido horizontalmente e verticalmente varrendo uma área retangular superfície da amostra A interação deste feixe com a amostra resulta na emissão de elétrons e radiação eletromagnética (Raios-X) secundários Esta emissão secundária é então detectada, gerando a imagem final

23 ME de Varredura

24 ME de Varredura

25 Preparo da Amostra Amostras não metálicas como insetos, plantas ou material biológico precisam ser recobertos para tornarem-se eletricamente condutivos Isto é conseguido recobrindo-se estes objetos por uma camada nanométrica de ouro O ouro possui um elevado número atômico, gerando uma elevada resolução e contraste topográficos. No entanto, este procedimento pode alterar, mesmo que em pequenas proporções, detalhes finos da amostra As amostras metalizadas podem, então, ser colocadas diretamente no microscópio

26 Preparo da Amostra

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28

29 Criofixação Consiste em um método de preparação onde a amostra é rapidamente congelada utilizando-se nitrogênio ou hélio líquidos A água presente congela de forma vítrea (desorganizada), não cristalina, preservando a amostra exatamente como no estado original, tornando possível a observação de qualquer amostra biológica de forma muito semelhante ao seu estado natural Uma evolução da Criofixação, a Tomografia Crio-eletrônica, permite a visualização em 3D de amostras biológicas intactas com uma altíssima resolução

30 Criofixação

31 Criofixação

32 Criofixação

33 Fim Fim

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