Métodos de estudo e Técnicas: como estudar as células

Transcrição

1 Histologia (Enfermagem) Métodos de estudo e Técnicas: como estudar as células Prof a Dr a. Iêda Guedes

2 Métodos de estudo e Técnicas: como estudar as células A Célula Processamento do material biológico Métodos histológicos e histoquímicos Poder de Resolução e Limite de Resolução Microscópio óptico Microscópio eletrônico

3

4 Métodos de estudo e Técnicas: como estudar as células A Célula Processamento do material biológico Técnicas histológicas e histoquímicas Poder de Resolução e Limite de Resolução Microscópio óptico Microscópio eletrônico

5 Escolha do animal Escolha do Material (órgão) Fixação Desidratação Diafinazação congelação Inclusão Microtomia Desparafinização Hidratação Coloração Desidratação Montagem

6 Naturais: - de origem Animal (Carmim) Tipos de Corantes - de origem Vegetal (Hematoxilina) Artificiais Básicos - Coram estrutura ácida (azul de metileno, verde de metila, Pironina G). Corante Estrutura Básico Acidófilo Ácida Basófila

7 Artificiais Neutros - São misturas de corantes geralmente usados em esfregassos sangüíneos. Ex. azul de metileno + eosina Tipos de Corantes Ácidos - Coram estruturas básicas (eosina, fucsina ácida, orange G, azul de anila). Corante Estrutura Ácido Basófilo Básica Acidófila Indiferentes - São corantes dissolvidos em solventes orgânicos (Xilol/Bensol) usados para observação lipídios. Ex. Sudam Black, Sudam I, II, III e IV

8 Simples - usa-se apenas 1 tipo de corante. Ex. Células da bochecha azul de metileno Combinada - usamos 2 ou mais tipos de corantes. Ex. H.E. (Hematoxilina e Eosina) Difusa - todo o material é corado. Ex. Medula espinal (H.E.) cora-se tanto a substância Branca como a substância Cinzenta. Eletiva - escolhemos a estrutura a ser corada e usamos um corante específico. Ex. DNA Reação de Feulgen Direta - a estrutura tem afinidade pelo corante. corando em estrutura básica. Tipos de Corantes Ex. Corante ácido Indireta - a estrutura não tem afinidade pelo corante e usamos uma solução para torná-la afim dele. A essa substância dá-se o nome de MORDENTE. Ex. Coloração de Gran corar bactérias. Usa-se Lugol como mordente. Hematoxilina Férrica de Regaud corar mitocôndrio. Usa-se Alúmem de Ferro como mordente

9 Tipos de Corantes Ortocromática - a estrutura adquire a cor do corante. Metacromática - a estrutura muda de cor, não fica com a cor do corante. Ex. Mastócito - Azul de metileno. Ao microscópio óptico, aparece roxo. Progressiva - cora-se lentamente até atingir a cor desejada. Regressiva - faz-se uma hipercoloração e depois descora-se lentamente até atingir a cor desejada. Negativa - destruímos a estrutura a ser observada e depois coramos o restante do material. Ex. RNA destruí-lo com RNAse. Depois cora-se com Galocianina.

10 Escolha do animal Escolha do Material (órgão) Fixação Desidratação Diafinazação congelação Inclusão Microtomia Desparafinização Hidratação Coloração Desidratação Montagem

11 Métodos de estudo e Técnicas: como estudar as células A Célula Processamento do material biológico Técnicas histológicas e histoquímicas Poder de Resolução e Limite de Resolução Microscópio óptico Microscópio eletrônico

12

13

14 Poder de resolução é a capacidade de se enxergar dois pontos distintos com a menor limite de resolução. Limite de resolução - é a menor distância entre dois pontos que ainda permite que sejam visualizados individualmente. O limite de resolução (LR) depende, sobretudo: - Abertura Numérica (AN) da objetiva - comprimento de onda da luz utilizada. LR= k x λ AN -L Limite de Resolução. -k Constante cujo valor é 0,61 -λ Comprimento de onda da luz utilizada -AN Abertura Numérica da Objetiva. Portanto, quanto menor o limite de resolução, maior será o poder se resolução.

15 Métodos de estudo e Técnicas: como estudar as células A Célula Processamento do material biológico Métodos histológicos e histoquímicos Poder de Resolução e Limite de Resolução Microscópio óptico Microscópio eletrônico

16 Componentes Mecânicos - Parafuso do Condensador - Parafuso Macrométrico - Parafuso Micrométrico - Mesa ou Platina - Charriot - Presilha - Braço - Base

17 Componentes Ópticos - Fonte de Luz - Condensador - Canhão - Ocular - Revolver ou Porta Objetivas - Objetivas: - Panorâmica (4x) - Pequeno Aumento (10x) - Médio Aumento (40x) - Imersão (100x)

18

19 Por que usamos óleo de Imersão? Índice de refração do ar = 1 AN = n. senα LR = k. λ AN AN abertura numérica da objetiva. n índice de refração do meio. α ângulo do raio de luz. LR Limite de resolução. K Constante cujo valoe é 0,61. λ Comprimento de onda da uz utilizada. AN = n. senα (ar) AN = 1. sen30º Índice de refração do óleo = 1,5 AN = n. senα (óleo) AN = 1,5. sen60º AN = 1. 0,5 AN = 1,5. 0,866 AN = 0,5 AN ~1,3 Portanto, quanto menor o limite de resolução, maior será o poder se resolução.

20 Microscópio de Contraste de Fase

21 Microscópio de Contraste de Fase Comum Contraste de fase Normaski Contraste de fase Fase positiva Contraste de fase Fase negativa

22 Microscópio de Contraste de Fase

23 Microscópio de Polarização Comum acrescido discos polaróides: polarizador - analisador Substâncias Cristalinas Birrefringenteanisotrópica Substâncias Amorfas isotrópicas

24 Microscópio de Fluorescência

25 Microscópio de Confocal

26 Métodos de estudo e Técnicas: como estudar as células A Célula Processamento do material biológico Métodos histológicos e histoquímicos Poder de Resolução e Limite de Resolução Microscópio óptico Microscópio eletrônico

27 Microscópio Eletrônico

28 Microscópio Eletrônico de Varredura

29 Microscópio Eletrônico X Óptico Microsc. Optico Microsc. Eletrômico Obtenção da Imagem Feixe Luminoso Feixe de Eletrons Lentes Vidro Bobina Eletromagnética Limite de Resolução 0,5 µm 0,0001 µm 1º Lente Condensador Bobina Condensadora 2º Lente Objetiva Objetiva Projetora 3º Lente Ocular Bobina Projetora Tamanho de Ampliação 1000 à 1500 vezes vezes Material Pode ser vivo Nunca pode ser vivo Fixação Bouin, Formol 10% Glutaraldeído (4ºC), T. de Ósmio Desidratação Alcool Acetona Inclusão Parafina Resina Epóxi, Araldite Microtomia Micrótomo Ultra-micrótomo Material da Navalha Metal Vidro ou Diamante Distenção dos Corte Lâmina de Vidro Esteira Eletromagnética Coloração Usa-se corante Não se usa corante